胡焱，嵇辛勤,2，阮涌,2，趙佳福,2，雷云，段志強,2*，劉秀梵

(1. 貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2. 貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室，貴陽 550025；3. 揚州大學農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學重點開放實驗室，江蘇揚州 225009)

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不同新城疫疫苗對貴州三穗麻鴨的免疫效果比較

胡焱1，嵇辛勤1,2，阮涌1,2，趙佳福1,2，雷云1，段志強1,2*，劉秀梵3*

(1. 貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2. 貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室，貴陽 550025；3. 揚州大學農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學重點開放實驗室，江蘇揚州 225009)

為探討不同新城疫(ND)疫苗對貴州三穗麻鴨的免疫效果，選用NDⅠ系活疫苗(CS2株)、Ⅳ系滅活疫苗(LaSota株)和重組基因Ⅶ型NDV滅活疫苗(A-Ⅶ株)分別對三穗麻鴨進行免疫實驗，檢測疫苗最小免疫劑量、免疫鴨的抗體滴度和消長規(guī)律，以及病毒感染免疫鴨后的排毒情況。結(jié)果顯示，活疫苗CS2株、滅活疫苗LaSota株、滅活疫苗A-Ⅶ株的最小免疫劑量分別為1.0 mL/只、0.5 mL/只和0.2 mL/只；3種疫苗2次免疫要高于1次免疫產(chǎn)生的抗體滴度，但各免疫組不同免疫次數(shù)鴨的抗體滴度均在第60天達到高峰，其中以滅活疫苗A-Ⅶ株1次或2次免疫誘發(fā)的抗體滴度最高(分別為7.5log2和8.1log2)，并且抗體持續(xù)期長，在免疫后第150天抗體水平仍能達到免疫保護要求；對免疫鴨的排毒檢測發(fā)現(xiàn)，活疫苗CS2株免疫后的鴨持續(xù)排毒，滅活疫苗LaSota株免疫后的鴨排毒量少且時間短，而滅活疫苗A-Ⅶ株免疫后的鴨未檢測到排毒。試驗結(jié)果表明，重組基因Ⅶ型NDV滅活疫苗(A-Ⅶ株)在免疫劑量、免疫次數(shù)、免疫鴨的抗體滴度和持續(xù)時間，以及抑制免疫鴨排毒方面均明顯優(yōu)于傳統(tǒng)ND疫苗。

新城疫病毒；三穗麻鴨；新城疫疫苗；免疫效果

自1926年首次確認新城疫(Newcastle disease, ND)以來，經(jīng)過世界范圍內(nèi)的四次大流行，ND宿主范圍明顯擴大，迄今為止能自然或人工感染的禽類已超過250多種[1]。水禽被認為是新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)的天然儲存宿主，不同基因型的NDV均可從水禽中分離[2]。我國自1997年7月以來多個省份相繼出現(xiàn)了鵝群和鴨群感染NDV并發(fā)病死亡的報道[3-4]，且呈擴大流行趨勢，改變了"傳統(tǒng)一般認為NDV對水禽不致病"的觀點。分子流行病學調(diào)查結(jié)果表明，感染并導致水禽發(fā)病死亡的主要是基因Ⅶ型NDV強毒株[5-6]。有研究表明，雖然有些NDV強毒株對家鴨的致病力不強，但是人工感染雞或鵝后能造成嚴重的發(fā)病和死亡[7-9]。因此，要警惕家鴨攜帶的強毒NDV向雞群或鵝群傳播而對養(yǎng)殖業(yè)造成的威脅和損失。

三穗麻鴨是我國地方四大蛋系名鴨品種之一，目前三穗麻鴨產(chǎn)業(yè)已成為貴州省特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)。本實驗室前期對貴州省三穗麻鴨群進行了NDV流行病學調(diào)查和致病性研究，發(fā)現(xiàn)三穗麻鴨中主要流行基因Ⅶd亞型NDV，雖然這些分離株對雞致病力強而對鴨不致病，但鴨在感染后的較長時間可通過喉頭或泄殖腔向體外排毒[10]，這與國內(nèi)研究結(jié)果相一致[7-8]。我國當前控制雞群和鵝群感染NDV的主要措施是ND疫苗免疫，但是否有必要對鴨群進行ND疫苗免疫尚存在爭議。鑒于目前貴州省三穗麻鴨的規(guī)?；B(yǎng)殖不斷擴大，且感染強毒NDV的三穗麻鴨可持續(xù)向環(huán)境排毒，有造成其它禽群接觸感染的危險，因此有必要對三穗麻鴨群進行ND疫苗的免疫接種。本研究選取國內(nèi)常用的NDⅠ系活疫苗(CS2株)、Ⅳ系滅活疫苗(LaSota株)和新型基因Ⅶ型NDV滅活疫苗(A-Ⅶ株)分別對三穗麻鴨進行免疫實驗，檢測疫苗最小免疫劑量、免疫鴨的抗體滴度和消長規(guī)律，以及強毒NDV感染免疫鴨后的排毒情況，旨在為生產(chǎn)上有效防控ND提供科學的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 基因Ⅶ型鴨源NDV強毒株Duck/China/Guizhou/ZY/2014(簡稱ZY株)[10]由本實驗室保存。將ZY株接種10日齡SPF雞胚，收集24 h后死亡雞胚尿囊液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗動物 SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司；1日齡健康三穗麻鴨購自貴州省三穗縣興綠洲農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.1.3 試驗疫苗 雞ND活疫苗(CS2株)(批準文號：獸藥生字(2016)150132073，商品化疫苗中病毒含量為105.5EID50/0.1 mL)、雞ND滅活疫苗(LaSota株)(批準文號：獸藥生字(2015)150132241，滅活前病毒含量為109.1EID50/0.1 mL)、重組NDV滅活疫苗(A-Ⅶ株)(批準文號：獸藥生字(2015)150132231，滅活前病毒含量為108.5EID50/0.1 mL)購自青島易邦生物工程有限公司。

1.1.4 抗原血清 雞新城疫血凝抑制(HI)試驗用抗原、雞新城疫HI試驗用陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 疫苗免疫鴨的最小免疫劑量試驗 將1日齡雛三穗麻鴨40只按相同飼養(yǎng)管理條件飼養(yǎng)至7日齡，隨機抽取20只采血作首次免疫前新城疫HI抗體水平檢測。采血后隨機將40只雛鴨分成4組，10只/組，分別用3種ND疫苗按不同劑量(CS2：0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL；LaSota：0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL；A-Ⅶ：0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL)進行頸部皮下注射，對照組不免疫。免疫后21 d，連同對照組采血分離血清，測定HI抗體效價。

1.2.2 疫苗免疫鴨的免疫持續(xù)期比較試驗 將3種ND疫苗按最小免疫劑量通過頸部皮下注射方式分別免疫10只7日齡雛鴨，2周后加強免疫1次，各免疫組同時設10只不做加強免疫，僅監(jiān)測HI抗體效價消長規(guī)律。另設10只作為不免疫對照。分別在免疫后的14、21、28、60、90、120、150 d采血，測定HI抗體效價。

1.2.3 免疫鴨的攻毒試驗 將3種ND疫苗按最小免疫劑量通過頸部皮下注射方式分別免疫10只7日齡雛鴨，2周后各組選擇5只鴨加強免疫1次，另外5只鴨不加強免疫，同時設5只不免疫鴨作為對照。在免疫后第21天，以0.5 mL ZY株新鮮病毒尿囊液原液分別對各組鴨進行腿部肌肉注射，在攻毒后的第3、5和7天分別采集鴨的喉頭和泄殖腔拭子，處理后接種10日齡SPF雞胚分離病毒，檢測免疫鴨的排毒情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗對鴨的最小免疫劑量測定 按照ND疫苗使用說明書，用不同劑量疫苗經(jīng)頸部皮下注射免疫后21 d，均可誘導雛鴨產(chǎn)生不同程度的抗新城疫HI抗體，疫苗免疫劑量與HI抗體水平呈現(xiàn)正相關；在相同的疫苗免疫劑量(0.5或1.0 mL)時，LaSota組、A-Ⅶ組產(chǎn)生的抗體滴度顯著高于CS2組(P<0.01)(表1)。有研究表明，免疫家禽的ND血清HI抗體效價與攻毒保護呈正相關，當血清HI抗體效價不低于1∶32時，可判定為免疫保護[11]。通過疫苗最小免疫劑量試驗結(jié)果可以看出，CS2組、LaSota組、A-Ⅶ組使用劑量分別為1.0、0.5和0.2 mL/只時可達到免疫保護，為疫苗的最小免疫劑量。

表1 新城疫疫苗免疫雛鴨的最小免疫劑量測定結(jié)果Tab 1 The minimum immune dosage of ND vaccines tested in ducks

2.2 疫苗對鴨的免疫持續(xù)期測定 由表2結(jié)果可見，3種ND疫苗免疫7日齡雛鴨后(CS2組和LaSota組按最小免疫劑量，A-Ⅶ組使用與LaSota組相同的免疫劑量)，從14d至150d不同疫苗免疫產(chǎn)生的抗體水平整體呈先上升后下降的趨勢，并且疫苗2次免疫要高于1次免疫所產(chǎn)生的抗體滴度；各免疫組不同免疫次數(shù)的鴨在第60天抗體滴度達到高峰，A-Ⅶ組產(chǎn)生的抗體滴度明顯高于CS2組和LaSota組(P<0.01)，但LaSota組和CS2組之間的抗體滴度差異不顯著(P>0.05)。從3種疫苗的免疫效果和抗體持續(xù)期來看，A-Ⅶ組1次或2次免疫雛鴨后在第60天產(chǎn)生的平均抗體效價最高，分別為7.5log2和8.1log2，并且在免疫后的第150天平均抗體水平仍維持在1∶32左右，免疫效果明顯優(yōu)于CS2組和LaSota組。

表2 新城疫疫苗免疫雛鴨的免疫持續(xù)期試驗結(jié)果Tab 2 The persistent period of ND antibody in different vaccine-immunized ducks

2.3 免疫鴨的排毒情況檢測 對3種疫苗按不同免疫次數(shù)免疫鴨后第21天進行攻毒，檢測免疫鴨的排毒情況。由表3可以看出，CS2組不同免疫次數(shù)的鴨在第3、5和7天鴨喉頭和泄殖腔均存在排毒現(xiàn)象，并且排毒率高；LaSota組的個別免疫鴨喉頭和泄殖腔存在排毒；A-Ⅶ組的免疫鴨不出現(xiàn)排毒。作為對照組，不免疫的鴨感染NDV后喉頭和泄殖腔排毒率最高。

表3 免疫鴨攻毒后的排毒情況檢測Tab 3 Detection of the virus shedding of immunized ducks

/表示不免疫

/ indicate nonimmunity

3 討論與小結(jié)

越來越多的研究表明，水禽在NDV進化、傳播和維持過程中發(fā)揮了重要作用[2, 12-13]。2001年Gould等[14]首次報道了澳大利亞當?shù)厮葜械臒o致病性NDV毒株經(jīng)過30年在雞群中的循環(huán)感染變成了強毒株；2002年Yu等[15]和2015年Meng等[16]分別將水禽中分離的NDV弱毒株通過在雞的氣囊或腦內(nèi)連續(xù)傳代，短時間就產(chǎn)生了強毒NDV。以上結(jié)果說明，水禽中無致病性的NDV在自然條件下可以通過陸生禽類傳播而產(chǎn)生強毒，只是相比人工感染需要更長的時間。水禽作為NDV的天然儲存宿主，其感染發(fā)病和排毒情況也受到關注。目前研究證實我國流行的基因Ⅶ型NDV是主要病原，在家鵝中已成為地方流行，對家鴨的毒力也在逐漸增強，并且感染鴨群可長期向環(huán)境中排毒而感染其它鵝群或雞群[8,10]。因此，加強對鴨源NDV的遺傳進化研究和疫苗防控是保障家禽健康養(yǎng)殖的一個重要方面。

近年來，ND疫苗在世界范圍內(nèi)的廣泛使用較好地控制了雞群ND的發(fā)生，但水禽ND免疫還未受到重視。為研究不同ND疫苗對貴州三穗麻鴨的免疫效果，本實驗選用國內(nèi)常用的NDⅠ系活疫苗(CS2株)、Ⅳ系滅活疫苗(LaSota株)和新型基因Ⅶ型NDV滅活疫苗(A-Ⅶ株)分別對三穗麻鴨進行免疫，發(fā)現(xiàn)3種疫苗均能誘導鴨產(chǎn)生較高的抗體滴度，但重組NDV滅活疫苗(A-Ⅶ株)所需的免疫劑量低，1次或2次免疫誘發(fā)的抗ND HI抗體滴度最高，并且抗體持續(xù)期長，在免疫后第150天抗體滴度仍能達到免疫保護要求。在免疫禽群排毒研究方面，國內(nèi)外研究表明：常用的疫苗株LaSota、Mukteswar、V4等雖然誘導產(chǎn)生的抗體能保護家禽，但不能防止免疫禽群中病毒的感染復制和排毒，當使用與流行株一致的NDV疫苗株才能顯著降低免疫家禽的強毒感染率和排毒量[17-18]。本研究對3種ND疫苗免疫鴨后進行排毒檢測，發(fā)現(xiàn)活疫苗CS2株免疫后的鴨喉頭和泄殖腔持續(xù)排毒，滅活疫苗LaSota株免疫后的鴨排毒量少且時間短，而滅活疫苗A-Ⅶ株免疫后的鴨未檢測到排毒。原因可能是由于CS2株誘導鴨產(chǎn)生的抗體水平低，并且與NDV流行株ZY株的遺傳距離遠，存在抗原性差異所致。這與Miller等[17]研究結(jié)果“當疫苗株與攻毒株為同一基因型時，疫苗株能有效減少禽體內(nèi)病毒的攜帶量，并且疫苗株與流行毒株的遺傳距離相近時，其誘導的免疫保護效果較為理想”相符。綜上所述，重組NDV滅活疫苗(A-Ⅶ株)對貴州三穗麻鴨在免疫劑量、免疫次數(shù)、免疫后的抗體滴度和持續(xù)時間，以及抑制免疫鴨排毒方面均明顯優(yōu)于傳統(tǒng)ND疫苗，這對選擇合適的ND疫苗在貴州省鴨群中進行推廣應用以及控制NDV在家禽中的流行提供了理論依據(jù)。

[1] Ganar K, Das M, Sinha S,etal. Newcastle disease virus: current status and our understanding [J]. Virus Research, 2014, 184:71-81.

[2] 劉秀梵. 家養(yǎng)水禽在A型流感病毒和新城疫病毒進化和疾病流行中的作用[J]. 中國家禽, 2007, 29(15):1-7.

Liu X F. The Role of Domestic waterfowl in the evolution and prevalence of influenza a virus and Newcastle disease virus[J]. China Poultry, 2007, 29(15):1-7.

[3] 劉華雷, 鄭東霞, 孫承英, 等. 1997-2005年中國水禽新城疫分子流行病學特點分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學報, 2009, 40(1):145-148.

Liu H L, Zheng D X, Sun C Y,etal. Molecular epidemiology analysis of Newcastle disease outbreaks in waterfowl during 1997 to 2005 in China [J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2009, 40(1):145-148.

[4] 丁壯, 尹仁福, 薛 聰, 等. 新城疫流行病學新特點及鵝源新城疫防控策略[J]. 中國獸醫(yī)學報, 2015, 35(1):159-168.

Ding Z, Yin R F, Xue C,etal. The epidemiology characteristics of Newcastle disease and the prevention and control strategies of geese Newcastle disease virus[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2015, 35(1):159-168.

[5] Liu X F, Wan H Q, Ni X X,etal. Pathotypical and genotypical characterization of strains of Newcastle disease virus isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001[J]. Archives of Virology, 2003, 148(7): 1387-1403.

[6] Qin Z M, Tan L T, Xu H Y,etal. Pathotypical characterization and molecular epidemiology of Newcastle disease virus isolates from different hosts in China from 1996 to 2005 [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2008, 46(2):601-611.

[7] 吳煥榮, 刁有祥, 李宏梅, 等. 鴨源副黏病毒的致病性試驗[J]. 中國獸醫(yī)學報, 2011, 31(1):36-39.

Wu H R, Diao Y X, Li H M,etal. Pathogenicity of duck paramyxovirus [J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2011, 31(1):36-39.

[8] 伊惠, 胡北俠, 楊少華, 等. 基因VII型新城疫病毒對鴨和SPF雞致病性比較研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學報, 2013, 44(12):1982-1988.

Yin H, Hu B X, Yang S H,etal. Pathogenicity comparison of Newcastle disease virus isolates of genotype VII in ducks and SPF chickens [J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2013,44(12):1982-1988.

[9] 魯愛玲, 刁有祥, 崔京騰, 等. 鴨源新城疫病毒對鵝的致病性試驗[J]. 中國獸醫(yī)學報, 2014, 34(8):1239-1243.

Lu A L, Diao Y X, Cui J T,etal. Pathogenicity of duck Newcastle disease virus for geese[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2014, 34(8):1239-1243.

[10]段志強, 許厚強, 嵇辛勤, 等. 貴州省鴨源新城疫病毒強毒株的遺傳變異分析及致病性研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學報, 2016, 47(8):1623-1634.

Duan Z Q, Xu H Q, Ji X Q,etal. Genetic variation and pathogenicity analysis of virulent Newcastle disease viruses isolated from ducks in Guizhou province [J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2016, 47(8):1623-1634.

[11]張春杰, 李婉濤, 程相朝, 等. 雛雞新城疫母源抗體與首免日齡關系的再探討[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學, 2002, (8):41-43.

Zhang C J, Li W T, Cheng X C,etal. Re-discussion on the relationship between the levels of ND maternal HI antibody and the first immunization age[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2002, (8):41-43.

[12]劉秀梵, 胡順林. 新城疫病毒的進化及其新型疫苗的研制[J]. 中國獸藥雜志, 2010, 44(1):12-18.

Liu X F, Hu S L. Evolution of Newcastle disease virus and the development of novel vaccines[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2010, 44(1):12-18.

[13]胡順林, 劉秀梵. 新城疫病毒的進化[J]. 生命科學, 2016, 28(3):295-302.

Hu S L, Liu X F. The heredity and evolution of Newcastle disease virus[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2016, 28(3):295-302.

[14]Gould A R. Virulent Newcastle disease in Australia: molecular epidemiological analysis of viruses isolated prior to and during the outbreaks of 1998-2000[J]. Virus Research, 2001, 77(1):51-60.

[15]Yu S Q, Noriko K, Hiroshi I,etal. Generation of velogenic Newcastle disease viruses from a nonpathogenic waterfowl isolate by passaging in chickens[J]. Virology, 2002, 301(2):206-211.

[16]Meng C, Qiu X, Yu S,etal. Evolution of Newcastle disease virus quasispecies diversity and enhanced virulence after passage through chicken air sacs[J]. Journal of Virology, 2015, 90(4):2052-2063.

[17]Miller P J, Afonso C L. Antigenic differences among Newcastle disease virus strains of different genotypes used in vaccine formulation affect viral shedding after a virulent challenge[J]. Vaccine, 2007, 25(41):7238-7246.

[18]Hu S L, M H L, Liu X F,etal. A vaccine candidate of atte￣nuated genotype VII Newcastle disease virus generated by reverse genetics[J]. Vaccine, 2009, 27(6): 904-910.

(編輯：李文平)

Comparison of the Immune Effect of Different Newcastle Disease Vaccines onSansui Sheldrake Ducks in Guizhou Province

HU Yan1, JI Xin-qin1,2, RUAN Yong1,2, ZHAO Jia-fu1,2, LEI Yun1, DUAN Zhi-qiang1,2*, LIU Xiu-fan3*

(1. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in thePlateau Mountainous Region, Ministry of Education, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 3. Key Laboratory of Animal Infectious Diseases ofMinistry of Agriculture, Yangzhou University, Yangzhou , Jiangsu 225009, China)

DUAN Zhi-qiang, E-mail: zqduan@gzu.edu.cn; LIU Xiu-fan, E-mail: xfliu@yzu.edu.cn

To explore the immune effect of different Newcastle disease (ND) vaccines on Sansui Sheldrake ducks, ND live vaccine (CS2 strain), inactivated vaccine (LaSota strain) and recombinant genotype Ⅶ inactivated vaccine (A-Ⅶ strain) were used to inoculate 7-day-old ducks. The minimum immune dosage of vaccines, the dynamic regularity of antibody titers, and the virus shedding of immunized ducks were evaluated. Results showed that the minimum immune dosage of three vaccines was 1.0 mL, 0.5 mL and 0.2 mL, respectively. Although the antibody level induced by the vaccines with two immune times was higher than one immune time, the antibody titer of immunized ducks all reached a peak at 60 days post-immunization. However, both one and two immunization times of A-Ⅶ strain vaccine induced the highest antibody titer than other vaccines, which were 7.5log2 and 8.1log2, respectively. Meanwhile, the antibody persistent period of A-Ⅶ strain vaccine reached 150 days, which could still provide immunoprotection. Virus shedding experiment indicated that A-Ⅶ strain vaccine could absolutely suppress the virus shedding. These results demonstrated that recombinant genotype Ⅶ NDV inactivated vaccine (A-Ⅶ strain) is superior to the traditional ND vaccines in the aspects of the immune dosage, the immunization time, the titer and persistent period of antibody, and the inhibition of virus shedding.

Newcastle disease virus; Sansui Sheldrake duck; Newcastle disease vaccine; immune effect

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.5.01

教育部"促進與美大地區(qū)科研合作與高層次人才培養(yǎng)項目"(教外司美[2014]2029號)；貴州省省校合作計劃項目(黔科合LH字[2014]7669號)

胡 焱，碩士研究生，從事家禽疫病免疫機理研究。

段志強，E-mail: zqduan@gzu.edu.cn；劉秀梵，E-mail: xfliu@yzu.edu.cn

2016-11-23

A

1002-1280 (2017) 05-0001-06

S855.3