鄭慶豐 周智鋒 柳碩巖 林萬松 陳賽云 葉韻斌

(福建省腫瘤醫(yī)院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，福建省腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室，福建省腫瘤醫(yī)院胸外科，福州350014)

MICA 第5外顯子微衛(wèi)星多態(tài)性與食管癌相關(guān)性研究①

鄭慶豐 周智鋒②③柳碩巖 林萬松②陳賽云 葉韻斌②

(福建省腫瘤醫(yī)院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，福建省腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室，福建省腫瘤醫(yī)院胸外科，福州350014)

目的：研究MICA第5外顯子微衛(wèi)星多態(tài)性與食管癌相關(guān)性。方法：采用PCR-STR 微衛(wèi)星基因分型技術(shù)檢測103 例食管癌患者和84 例正常對照MICA 基因5 外顯子多態(tài)性。構(gòu)建食管癌標(biāo)本中高頻率出現(xiàn)的MICA等位基因的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞株，LDH法檢測NK細(xì)胞對不同MICA等位基因轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的殺傷作用，效靶比20∶1。ELISA法檢測轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞上清中sMICA含量。結(jié)果：食管癌患者第5 外顯子檢測到5種等位基因，頻率分別為：MICA-A4(9.71%)，MICA-A5(22.3%)，MICA-A5.1(40.8%)，MICA-A6(15.5%)，MICA-A9(11.7%)，其中MICA-A5.1 與對照組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MICA等位基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞株后，相對于其他第5外顯子A5.1組對NK殺傷的敏感性較低[(30.4±6.3)%，P<0.05]，上清可溶性MICA分泌增加(135.7±6.2)pg/ml。結(jié)論：食管癌與MICA 第5外顯子多態(tài)性A5.1 顯著性相關(guān)，其危險性高于其他等位基因。

MICA 基因;微衛(wèi)星多態(tài)性;食管癌;NK細(xì)胞

MICA基因包含6個外顯子，外顯子1編碼L前導(dǎo)肽；外顯子2～4分別編碼細(xì)胞外α1、α2、α3結(jié)構(gòu)域；外顯子5編碼跨膜(TM)區(qū)；外顯子6編碼胞質(zhì)區(qū)。MICA基因具有高度多態(tài)性，目前已發(fā)現(xiàn)并命名的MICA等位基因多達(dá)70幾個，編號為MICA*001-MICA*065。編碼胞外區(qū)的外顯子2、3、4是MICA等位基因多態(tài)性的集中區(qū)域，另外，跨膜區(qū)有一個三核苷酸重復(fù)序列的微衛(wèi)星多肽位點(GCT)。根據(jù)GCT的差異分別命名為A4、A5、A5.1、A6、A7、A8和A9等[1]，數(shù)字代表GCT的重復(fù)數(shù)目。A5.1是在A5基礎(chǔ)上插入一個G，在2個GCT重復(fù)順序后插入一個堿基G，導(dǎo)致在跨膜區(qū)提前出現(xiàn)終止密碼子，編碼產(chǎn)生可溶性蛋白[2]。 盡管已有研究證實MICA 第5外顯子微衛(wèi)星多態(tài)性與多種腫瘤有關(guān)[3]，但與食管癌的關(guān)系尚不明確，本研究檢測食管癌手術(shù)標(biāo)本跨膜區(qū)微衛(wèi)星多態(tài)性，分析MICA跨膜區(qū)多態(tài)性與食管癌的關(guān)系。并構(gòu)建食管癌標(biāo)本中高頻率出現(xiàn)的MICA等位基因的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞株，通過體外驗證MICA等位基因?qū)K細(xì)胞殺傷影響，探討MICA跨膜區(qū)基因多態(tài)性與患食管癌風(fēng)險的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取福建省腫瘤醫(yī)院2012 年4月至2015 年6月收治的食管癌患者103 例，其中男58例、女45例，平均年齡(49.69±8.28)歲；另選取同期食管正常者84例，其中男37例、女47例，平均年齡(42.81±9.13)歲，兩組年齡、性別等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.1.2 試劑 載體pcDNA3.1/myc-His(-)A及 Lipofectamine 2000購自上海Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ及KpnⅠ美國購自BioLab公司；質(zhì)粒大量抽提純化試劑盒購自德國Qiagen公司；DC蛋白定量試劑盒購自美國Bio-Rad公司；過硫酸銨、TEMED、SDS、甘氨酸、Tween-20、40%Acr-bis 及Tris-Base美國Amresco；LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自美國Roche公司；可溶性MICA的ELISA檢測試劑盒購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 MICA-STR 的PCR 擴(kuò)增 采用primer 5 軟件設(shè)計MICA 基因第5 外顯子引物序列，由閩博生物公司合成。根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]，設(shè)計MICA 基因組DNA 序列PCR 引物，其中，引物序列為：上游引物5′-CCAGAGTGAGGACAGACTTGC-3′，下游引物5′- CATGCCTATCTTTGCAGGAG-3′。PCR反應(yīng)體系包括:2 μl 10 × PCR 緩沖液，0.25 mmol/L dNTPs，0.5 μmol/L 引物，100 ng 基因組DNA 和1 U Taq DNA 聚合酶。擴(kuò)增產(chǎn)物通過ABI 3730 核酸分析儀檢測，并經(jīng)過ABI 3730 數(shù)據(jù)收集V3.0 和ABI 基因分型軟件(Genemapper 4.0)分析得到PCR 產(chǎn)物片段大小信息。

1.2.2 MICA等位基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 TRIZOL法提取含高頻率出現(xiàn)的MICA等位基因A4、A5、A5.1、A6和A9食管癌組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增MICA全長(MICA-myc-F：5′-CCGCTCGAGATGGGGCTGGGCCCGGTCT-3′，MICA-myc-R：5′-CGGGGTACCGGCGCCCTCAGTGG-AGCCA-3′)， 以KpnⅠ及XhoⅠ酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后進(jìn)行膠回收，T4 連接酶16℃連接過夜，次日轉(zhuǎn)化大腸桿菌，克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A載體，篩選重組克隆，經(jīng)酶切鑒定及測序鑒定，選取鑒定正確的重組載體，命名為p293TA4、p293TA5、p293TA5.1、p293TA6及p293TA9,質(zhì)粒大量抽提，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

1.2.3 Western blot檢測MICA等位基因轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá) Western blot檢測帶有myc標(biāo)簽的pcDNA3.1、p293TA4、p293TA5、p293TA5.1、p293TA6及p293TA9的MICA蛋白,制備SDS-PAGE凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，將膜置于脫脂牛奶室溫封閉1～2 h或4℃過夜，搖床孵育。鼠抗人myc一抗室溫孵育1～2 h，除去一抗，加入以封閉液稀釋的二抗，室溫1～2 h，搖床孵育。除去二抗，次日以TBST 洗膜10 min × 4 次，加入顯色液，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描圖像。

1.2.4 MICA基因多態(tài)性對NK殺傷的影響 NK細(xì)胞培養(yǎng)參考本科室常規(guī)方法[5]：LDH法檢測NK細(xì)胞對不同MICA等位基因轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的殺傷作用，效靶比20∶1，以培養(yǎng)17～20 d的NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，NK 細(xì)胞調(diào)密度至1×106ml-1，靶細(xì)胞分別為pcDNA3.1、p293TA4、p293TA5、p293TA5.1、p293TA6及p293TA9轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞。終體積200 μl/孔，設(shè)3個復(fù)孔。根據(jù)說明書設(shè)立對照組，包括加入靶細(xì)胞的自發(fā)釋放組(SR靶)、加入靶細(xì)胞并在檢測前40 min 加入1% Triton-100的最大釋放組(MR靶)，只加入效應(yīng)細(xì)胞的自發(fā)釋放組(SR 效應(yīng))，在37℃孵箱中培養(yǎng)4 h。1 000 r/min×10 min離心后，吸出50 μl/孔上清，轉(zhuǎn)移至另一ELISA板，加入50 μl/孔LDH 反應(yīng)液，室溫避光放置30 min 后，測定492 nm 的吸光度(A)值，殺傷率(%)=[(實驗孔D值-SR效應(yīng)組D值-SR靶組D值)/(MR靶組D值-SR靶組D值)]×100%。

1.2.5 可溶性MICA的測定 取293T培養(yǎng)細(xì)胞上清-80℃冰箱保存， 根據(jù)試劑盒的操作說明書， 以雙抗體夾心ELISA法檢測上清中sMICA含量。先不稀釋血清樣本， 初步檢測如果標(biāo)本超過試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍， 將標(biāo)本根據(jù)需要進(jìn)行稀釋重新檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 等位基因頻率通過計數(shù)法直接得出，對各等位基因的數(shù)據(jù)采用Genepop v3.4軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗；利用SPSS17.0進(jìn)行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 食管癌患者和正常對照MICA-STR頻率比較 結(jié)果如表1所示，食管癌患者M(jìn)ICA-A5.1 的頻率40.8% 高于正常對照組19.0%(P<0.05)，風(fēng)險評估(OR)=2.926，95%CI為1.495～5.728。

2.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-MICA的鑒定 將MICA基因分別克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A載體，構(gòu)建MICA等位基因重組表達(dá)載體(p293TA4,p293TA5,p293TA5.1,p293TA6及p293TA9)。重組質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可見兩條帶，其中5.5 kb為載體pcDNA3.1/myc-His(-)A條帶，另外一條為MICA等位基因片段，其對應(yīng)分子量為1 152、1 155、999、1 158及1 167 bp(圖1)。

2.2 Western blot檢測轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后MICA蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的293T細(xì)胞為陰性對照，轉(zhuǎn)染不同MICA等位基因的293T細(xì)胞作為實驗組，Western blot檢測MICA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，實驗組MICA蛋白水平表達(dá)變化。與空對照相比較，轉(zhuǎn)染不同MICA等位基因的293T細(xì)胞均有抗myc標(biāo)簽的MICA蛋白表達(dá)，分子量除了p293TA5.1為37 kD外,其余p293TA4、p293TA5、p293TA6及p293TA9均為43 kD(圖2)。

圖1 MICA等位基因重組載體酶切鑒定Fig.1 MICA allele recombinant vector enzyme digestionNote: M.DNA ladder;A.pcDNA3.1/myc-His(-)A;B.p293TA4;C.p293TA5;D.p293TA5.1;E.p293TA6;F.p293TA9.

2.3 NK細(xì)胞對轉(zhuǎn)染不同MICA基因的殺傷作用 與空轉(zhuǎn)染pcDNA3.1相比，MICA基因轉(zhuǎn)染后，靶細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷的敏感性均明顯升高(P<0.05)，但p293TA5.1組對NK殺傷的敏感性最低[(30.4±6.3)%，P<0.05]；而其他組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

2.4 293T細(xì)胞上清可溶性MICA 以雙抗體夾心法檢測轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞上清可溶性MICA，結(jié)果如圖4所示，空轉(zhuǎn)的pcDNA3.1組上清未檢測到可溶性MICA，p293TA5.1組:(135.7±6.2) pg/ml；明顯高于p293TA4、p293TA5、p293TA6及p293TA9組(P<0.05)。

圖2 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞的MICA表達(dá)Fig.2 MICA expression in 293T cells after transfection was detected by Western blot

表1 實驗組和對照組MICA 基因第5 外顯子等位基因頻率分布的比較

Tab.1 Comparison of allelic distributions of MICA gene polymorphism between patients and controls

AlleleTestgroup(n=103)Number(n)Frequency(%)Controlgroup(n=84)Number(n)Frequency(%)POR95%CIA4109.711214.30.3340.6450.264-1.577A52322.32125.00.6690.8630.438-1.698A5.14240.81619.00.0012.9261.495-5.728A61615.51720.20.0730.7250.341-1.540A70011.20.9181.0120.989-1.036A80000---A91211.71720.20.1070.5200.233-1.161

圖3 NK細(xì)胞對MICA基因轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的殺傷活性Fig.3 Cytotoxicity of NK cells to MICA gene transfected 293T cellsNote: *.P<0.05，vs the group of untransfected pcDNA3.1;#.P<0.05，vs the group of p293TA5.1.

圖4 轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞上清可溶性MICAFig.4 Supernatants soluble MICA after transfected 293T cellNote: *.P<0.05，vs the group of p293TA5.1.

3 討論

MICA 第5外顯子微衛(wèi)星多態(tài)性不僅與免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎有關(guān)[6]，更與多種腫瘤密切相關(guān)， Chung 等[7]證實A6 基因與口腔鱗狀細(xì)胞癌有關(guān)聯(lián)。Vallian 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，50歲以上的婦女中，含A6、A9等位基因型的婦女，患乳腺癌的風(fēng)險性明顯高于對照組。本文發(fā)現(xiàn)食管癌組患者M(jìn)ICA 第5 外顯子中A5.1 等位基因的頻率相比正常人組明顯增高，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示MICA-A5.1 等位基因可能與食管癌的發(fā)生密切相關(guān)，是食管癌易感標(biāo)記;其他基因表型頻率等與食管癌無關(guān)聯(lián)，未發(fā)現(xiàn)等位基因A7、A8。

NK細(xì)胞上NKG2D配體與MICA結(jié)合，在DAP10的介導(dǎo)下激活NK細(xì)胞的殺傷活性，且該活化效應(yīng)能克服靶細(xì)胞上經(jīng)典HLAⅠ類分子所誘導(dǎo)的抑制性效應(yīng)，在NK細(xì)胞的活化中起著非常重要的作用[9]。NK細(xì)胞的殺傷敏感性與腫瘤細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)水平呈正相關(guān)，腫瘤細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)水平影響NK細(xì)胞的殺傷活性。提高腫瘤細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)水平，可使腫瘤細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷的敏感性明顯增強(qiáng)[10]。為了研究MICA基因多態(tài)性對NK殺傷作用的影響，本研究RT-PCR 技術(shù)將食管癌組織來源的高頻MICA等位基因,并將MICA基因連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His(-)A上，通過酶切鑒定和質(zhì)粒測序結(jié)果證明融合蛋白真核表達(dá)載體成功。再利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)、免疫印跡的方法MICA在真核細(xì)胞293T中正確表達(dá),來源pMCFA5.1總蛋白表達(dá)最低，可能是由于A5.1編碼截短型蛋白，MICA的RNA翻譯至跨膜區(qū)，提前終止。

本文通過LDH法檢測NK細(xì)胞對MICA等位基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的殺傷活性，與空轉(zhuǎn)染相比，MICA等位基因轉(zhuǎn)染后，靶細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷的敏感性均明顯升高，這與轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞MICA蛋白的增加有關(guān)。但相對于其他第5外顯子p293TA5.1組對NK殺傷的敏感性仍低，其原因可能是293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染p293TA5.1后，雖然A5.1編碼MICA截短型蛋白，容易脫落，產(chǎn)生可溶性MICA分泌至上清，仍有部分結(jié)構(gòu)錨定在細(xì)胞膜上，固定在細(xì)胞膜上的MICA仍可與NKG2D結(jié)合，誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化，促進(jìn)NK對靶細(xì)胞的殺傷。

許多惡性腫瘤(如黑色素瘤、肺癌、胃腸癌、肝癌、前腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等)可釋放可溶性MICA抑制NK細(xì)胞的功能，造成腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[11]。本研結(jié)果轉(zhuǎn)染p293TA5.1后293T細(xì)胞上清可溶性MICA明顯增加。我們前期對食管癌患者血清中的可溶性MICA的研究發(fā)現(xiàn)，可溶性MICA通過下調(diào)NKG2D表達(dá)來抑制NK細(xì)胞的殺傷活性[12]。所以可溶性MICA在食管癌免疫逃逸中起重要作用，從免疫逃逸方面驗證MICA等位基因A5.1 增加食管癌發(fā)病率。

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[收稿2016-08-01 修回2016-10-25]

(編輯 張曉舟)

Association of microsatellite polymorphism of MICA gene with susceptibility to esophageal cancer

ZHENGQing-Feng,ZHOUZhi-Feng,LIUShuo-Yan,LINWan-Song,CHENSai-Yun,YEYun-Bin.

FujianCancerHospital，F(xiàn)ujianMedicalUniversity,CancerHospitalFujianKeyLaboratoryofTranslationalCancer,DepartmentofThoracicSurgery,Fuzhou350014,China

Objective:To explore the association of microsatellite polymorphism of MICA gene with susceptibility to esophageal cancer.Methods: PCR-STR microsatellite genotyped technique was used to detect the polymorphism of MICA in Exon 5 in 103 cases of esophageal cancer and 84 cases of normal controls.Constructed of eukaryotic expression vector in esophageal carcinoma with high frequency of occurrence of the MICA allele.NK cells killing effect to 293T cells after alleles MICA transfected were assayed by LDH and the effect on target was 20∶1.ELISA was used to test supernatants sMICA of 293T cell after transfected.Results: Identified five allelic genes in MICA Exon 5 with esophageal cancer.Each allele and its frequency respectively were:MICA-A4(9.71%),MICA-A5(22.3%),MICA-A5.1(40.8%),MICA-A6(15.5%),MICA-A9(11.7%).MICA-A5.1 showed significant difference comparison with the control group.After 293T cell line was transfected MICA allele,MICA-A5.1 group was less sensitive to NK cytotoxicity compared to other groups[(30.4±6.3)%，P<0.05].The secretion of soluble MICA increased(135.7±6.2)pg/ml.Conclusion: Esophageal cancer was relevent with the MICA-A5.1 polymorphism of MICA Exon 5 alleles.Its risk is higher than other alleles.

MICA gene;Microsatellite polymorphism;Esophageal;NK cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.021

①本文受福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項目(No.2014-ZQN-JC-7)和福建省自然科學(xué)基金項目(2015J01378;2015J01433)資助。

鄭慶豐(1975年-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事胸部腫瘤外科方面的研究，E-mail:zhqf@msn.com。

及指導(dǎo)教師：葉韻斌(1964年-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫治療研究，E-mail: zjyunbin@189.cn。

R735.1

A

1000-484X(2017)05-0738-05

②福建省腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室，福建省腫瘤醫(yī)院免疫學(xué)研究室，福州 350014。

③共同第一作者。