喬瑞君，鄭華月

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院 兒科，河南 南陽 473000）

白藜蘆醇對單個核細胞氧化應(yīng)激的作用和影響*

喬瑞君，鄭華月

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院 兒科，河南 南陽 473000）

目的探討高氧暴露早產(chǎn)兒外周血單個核細胞應(yīng)用白藜蘆醇對氧化應(yīng)激的影響。方法52例早產(chǎn)兒隨機分為白藜蘆醇+高氧組和高氧組，每組26例，選取同期吸入常壓空氣早產(chǎn)兒20例作為對照組。抽取患兒橈動脈血2 ml，采用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞。觀察3組單個核細胞活性氧水平、培養(yǎng)液丙二醛（MDA）水平、細胞自噬體、血紅細胞加氧酶（HO-1）蛋白水平及活性。結(jié)果3組活性氧、MDA、細胞自噬體、HO-1蛋白水平、HO-1活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），高氧組活性氧、MDA、細胞自噬體、HO-1蛋白水平、HO-1活性高于對照組和白藜蘆醇+高氧組；白藜蘆醇+高氧組活性氧、MDA、細胞自噬體、HO-1蛋白水平、HO-1活性高于對照組。結(jié)論白藜蘆醇能夠有效對抗高氧暴露產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，減少氧化應(yīng)激損傷。

早產(chǎn)兒；高氧；白藜蘆醇；單個核細胞；氧化應(yīng)激

早產(chǎn)兒出生后長時間處于低氧血癥狀態(tài)，與運動障礙、認知、視網(wǎng)膜病變等不良預(yù)后相關(guān)[1]。早產(chǎn)兒長期和/或過量補充氧氣，會破壞肺組織，這可能與早產(chǎn)兒肺組織發(fā)育不成熟、氧化應(yīng)激及抗氧化防御機制間的相互作用有關(guān)[2]。白藜蘆醇具有抗癌、抗氧化等作用[3-6]。魻ZDEMIR等[7]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以通過抗炎、抗氧化特性對高氧性肺損傷起防治作用。本研究通過對高氧暴露早產(chǎn)兒應(yīng)用白藜蘆醇，探討其對外周血單個核細胞氧化應(yīng)激的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年3月-2016年6月于南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院住院治療的52例早產(chǎn)兒作為研究對象。其中，男性32例，女性20例；胎齡29～35周，平均（31.7±2.8）周；其中早產(chǎn)兒非透明膜病34例，早產(chǎn)窒息后肺炎18例。采用隨機數(shù)字表將其分為白藜蘆醇+高氧組和高氧組，每組26例。白藜蘆醇+高氧組，男性15例，女性11例；胎齡30～35周，平均（31.8±2.7）周。高氧組男性17例，女性9例；胎齡29～34周，平均（31.6±2.8）周。選取同期吸入常壓空氣的早產(chǎn)兒20例作為對照組。其中，男性12例，女性8例；胎齡30～32周，平均（32.0± 1.6）周。3組性別比例、胎齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)本院臨床試驗倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①入選患兒符合《早產(chǎn)兒管理指南》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②患兒監(jiān)護人知情同意，并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①肺部先天性疾病，如先天性肺發(fā)育不全、肺隔離癥、先天性支氣管肺囊中、先天性肺動靜脈瘺、先天性肺動靜脈血管異常；②先天性心臟病，如肺動脈狹窄、主動脈縮窄、房間隔缺損、室間隔缺損、動脈導(dǎo)管未閉、法洛四聯(lián)征等；③肺炎嚴重感染；④有溶血傾向或溶血性疾病；⑤顱內(nèi)出血；⑥消化道出血；⑦患兒監(jiān)護人不同意進行相關(guān)治療。

1.3 治療方法

抽取患兒橈動脈血2 ml，置于抗凝管中，采用Fi coll密度梯度離心法分離單個核細胞，肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。2 000 r/min水平離心20 min。離心后管內(nèi)分為3層，上層為血漿和Hank's液，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞；此外，還含有血小板。用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一短管中，加入> 5倍體積的Hank's液，1 500 r/min離心10 min，洗滌細胞2次。末次離心后，棄上清，加入含10%小牛血清的無血清細胞凍存培養(yǎng)基（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640），重懸細胞。

1.3.1 對照組 單個核細胞置于細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱參照早產(chǎn)兒溫箱要求進行設(shè)置，溫度32～35℃，濕度55%～65%，5%二氧化碳CO2。

1.3.2 高氧組 培養(yǎng)環(huán)境同對照組，采用新生兒空氣、氧氣混合器（無錫法斯達醫(yī)學(xué)設(shè)備有限公司）向細胞培養(yǎng)箱中輸注95%濃度的氧氣，20 min后密閉培養(yǎng)箱。

1.3.3 白藜蘆醇+高氧組 培養(yǎng)環(huán)境同高氧組，在通入高濃度氧前，應(yīng)用5μmol/L白藜蘆醇在單個核細胞中。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 單個核細胞活性氧檢測 3組均培養(yǎng)48 h，收集各組單個核細胞和培養(yǎng)液。采用活性氧檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司），將收集好的細胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育。陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等稀釋陽性對照到常用工作濃度100 μmol/L，加入細胞37℃避光孵育0.5～4.0 h，可看到活性氧水平提高，探針裝載前，按照1︰1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋二氯熒光黃二乙酸酯（2'，7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）至終濃度為10 μmol/L。去除細胞內(nèi)藥物，離心收集細胞，加入適當(dāng)稀釋好的探針，使其細胞密度為1.0×106～2.0×107。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞1～2次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。收集細胞后用熒光分光光度計，使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。

1.4.2 培養(yǎng)液丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量檢測 采用MDA測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），取各組培養(yǎng)液0.1～0.2 ml，按說明書加入樣本和試劑，漩渦混勻，>95℃沸水浴40 min，流水冷卻，4 500 r/min離心10 min，取上清液待測，采用532 nm波長，1 cm光徑比色測定各組吸光度值，得出MDA含量。

1.4.3 細胞自噬體檢測 采用細胞自噬染色檢測試劑盒[單丹磺酰尸胺（Monodansylcadaverine，MDC）法]（北京雷根生物技術(shù)有限公司），用去離子水稀釋1×緩沖液；離心，收集細胞，用1×緩沖液清洗細胞1次，棄上清液；加入適量的1×Wash Buffer重懸細胞，計數(shù)并調(diào)節(jié)細胞濃度至1×106/ml；取適量細胞懸液至新的離心管（eppendorf tubes，EP）中，加入MDC Stain，輕輕混勻，室溫避光染色；離心收集細胞，用1×Wash Buffer清洗細胞2次，棄上清液；加入Collection Buffer重懸細胞，滴加于載玻片上并加蓋玻片；熒光顯微鏡下觀察（激發(fā)濾光片波長355 nm，阻斷濾光片波長512 nm），計數(shù)并拍照，測定熒光強度。

1.4.4 血紅素加氧酶 -1（heme oxygenase-1，HO-1）蛋白水平及活性檢測 HO-1蛋白水平采用人HO-1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）進行檢測。①加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；②溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min；③配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用；④洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，拍干；⑤加酶：加入酶標(biāo)試劑50 μl/孔，空白孔除外；⑥顯色：先加入顯色劑A 50 μl/孔，再加入顯色劑B 50μl/孔，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min；⑦終止：加終止液50 μl/孔，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）；⑧測定：以空白空調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度。測定應(yīng)在加終止液后15 min內(nèi)進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組單個核細胞活性氧、MDA含量比較

3組活性氧、MDA水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），高氧組活性氧、MDA水平高于對照組和白藜蘆醇+高氧組，白藜蘆醇+高氧組活性氧、MDA水平高于對照組。見表1。

2.2 3組細胞自噬體水平比較

對照組自噬體為（0.34±0.04），高氧組為（1.21± 0.09），白藜蘆醇+高氧組為（0.46±0.05），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），高氧組自噬體水平高于對照組和白藜蘆醇+高氧組，白藜蘆醇+高氧組自噬體水平高于對照組。

2.3 3組HO-1蛋白水平及活性比較

3組HO-1蛋白水平及活性比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），高氧組HO-1蛋白水平及活性高于對照組和白藜蘆醇+高氧組，白藜蘆醇+高氧組HO-1蛋白水平及活性高于對照組。見表2。

表1 3組單個核細胞活性氧、MDA含量比較 （±s）

表1 3組單個核細胞活性氧、MDA含量比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P<0.05；2）與高氧組比較，P<0.05

組別MDA/（nmol/L）對照組（n=20） 10.30±0.90 0.43±0.04高氧組（n=26） 52.10±2.901） 1.19±0.061）白藜蘆醇+高氧組（n=26） 13.20±1.101）2） 0.59±0.051）2）F值 446.894 665.081 P值 0.000 0.000活性氧/熒光度

表2 3組HO-1蛋白水平及活性比較 （±s）

表2 3組HO-1蛋白水平及活性比較 （±s）

HO-1活性/ [mmol/（L·h）]對照組（n=20） 1.10±0.23 53.10±7.90高氧組（n=26） 1.81±0.32 77.40±12.10白藜蘆醇+高氧組（n=26） 1.23±0.27 57.30±8.20 F值 23.663 26.368 P值 0.000 0.000組別HO-1蛋白水平/熒光度

3 討論

早產(chǎn)兒進行氧療是臨床常規(guī)治療方法之一，SOLA等[9]發(fā)現(xiàn)，85%～94%的血氧飽和度可以升高早產(chǎn)兒的病死率，91%～95%的血氧飽和度可以導(dǎo)致不良反應(yīng)發(fā)生。因此合理的供氧濃度，采用預(yù)防措施減少高氧暴露的危害十分重要。白藜蘆醇是一種天然多酚，在細胞凋亡、生存、分化中具有多種作用。JIN等[10]研究發(fā)現(xiàn)，細胞損傷，如氧化和脂質(zhì)過氧化；自由基，如活性氧自由基引起的DNA損傷，導(dǎo)致疾病的發(fā)生，而白藜蘆醇具有清除自由基、抗氧化損傷的作用。SONG等[11]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有調(diào)節(jié)炎癥、細胞存貨和凋亡的能力。本研究通過白藜蘆醇對高氧暴露下早產(chǎn)兒單個核細胞的氧化應(yīng)激作用，探討其作用機制。

3.1 白藜蘆醇的抗氧化應(yīng)激作用

JIN等[10]采用自由基清除實驗發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對人肝臟腫瘤HepG2細胞氧化應(yīng)激損傷有保護作用。SEIF EL-DIN等[12]對302只肝損傷大鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以減輕肝損傷和炎癥，減少炎癥浸潤和水腫，降低腫瘤壞死因子-α、白介素6、丙氨酸和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平，恢復(fù)肝臟谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、丙二醛水平正?；?，說明白藜蘆醇抑制炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。OURIQUE等[13]發(fā)現(xiàn)，丙戊酸鈉是一種在兒童和成人癲癇的治療中廣泛使用的藥物，長期使用可能導(dǎo)致男性生殖功能障礙，氧化應(yīng)激是其主要作用機制，而白藜蘆醇可以用來防止丙戊酸鈉的氧化損傷。ATAIE等[14]認為，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致細胞凋亡或壞死，神經(jīng)元死亡，而使用多酚抗氧化劑可以減少神經(jīng)元死亡和氧化應(yīng)激。

3.2 早產(chǎn)與高氧暴露

全裕鳳等[15-16]對高體積分數(shù)氧暴露早產(chǎn)兒進行研究發(fā)現(xiàn)，高氧組患者外周血單個核細胞血紅素加氧酶-1、HO-1蛋白、HO-1活性表達水平，以及血清膽紅素、血漿一氧化碳CO、血紅蛋白水平顯著升高，且高于空氣組。楊熙等[17]對出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征且需要吸氧的早產(chǎn)兒外周血單個核細胞進行研究發(fā)現(xiàn)，隨著吸氧濃度不斷增加，單個核細胞產(chǎn)生的活性氧、MDA水平也隨之升高，而去乙?；赋聊雍闲托畔⒄{(diào)節(jié)因子2同源蛋白1轉(zhuǎn)位率也逐漸增加，其蛋白表達水平顯著下降，說明高氧暴露可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生。劉雪雁等[18]對足月新生大鼠進行高濃度氧吸入，發(fā)現(xiàn)高氧暴露第3天時肺泡發(fā)育停滯，逐漸出現(xiàn)纖維化，第7天發(fā)現(xiàn)膠原纖維和網(wǎng)狀纖維沉積。楊熙等[19]對40例早產(chǎn)兒的外周血單個核細胞進行研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用白藜蘆醇可以明顯降低高氧導(dǎo)致的活性氧、MDA、去乙?；赋聊雍闲托畔⒄{(diào)節(jié)因子2同源蛋白1轉(zhuǎn)位率升高，說明白藜蘆醇具有抗氧化應(yīng)激的能力。魻ZDEMIR等[7]對新生幼鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過其抗炎和抗氧化特性對高氧性肺損傷起防治作用。本研究發(fā)現(xiàn)，3組活性氧、MDA、細胞自噬體、HO-1蛋白水平、HO-1活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，高氧組活性氧、MDA、細胞自噬體、HO-1蛋白水平、HO-1活性高于對照組和白藜蘆醇+高氧組，白藜蘆醇+高氧組活性氧、MDA、細胞自噬體、HO-1蛋白水平、HO-1活性高于對照組，與上述研究結(jié)果相近。

綜上所述，白藜蘆醇能夠明顯降低高氧暴露早產(chǎn)兒活性氧、MDA、細胞自噬體、HO-1蛋白水平、HO-1活性，有效對抗高氧暴露產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，減少氧化應(yīng)激損傷。

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（童穎丹 編輯）

Effect of resveratrol on oxidative stress in peripheral blood mononuclear cells of hyperoxia-exposed preterm infants*

Rui-jun Qiao,Hua-yue Zheng
(Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital of Nanyang Medical College,Nanyang,Henan 473000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol on oxidative stress in peripheral blood mononuclear cells of hyperoxia-exposed premature infants.MethodsFifty-two cases of premature infants were randomly divided into resveratrol plus high oxygen group and high oxygen group with 26 cases in each group, and 20 preterm infants with normal atmospheric air inhalation during the same period were selected as control group.Each infant was drawn 2 ml of blood from the radial artery,and then mononuclear cells were isolated by Ficoll density gradient centrifugation.The levels of reactive oxygen species and malondialdehyde(MDA)in the culture medium,autophagosomes and the level and activity of erythrocyte oxygenase(HO-1)protein were observed.ResultsThe active oxygen,MDA,autophagosomes,HO-1 protein level and HO-1 activity were significantly different among the 3 groups(P<0.05),which were the highest in the high oxygen group and lowest in the control group.ConclusionsResveratrol can effectively protect premature infants from oxidative stress injury induced by hyperoxia exposure.

premature infant;high oxygen;resveratrol;mononuclear cell;oxidative stress

R722.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.013

1005-8982（2017）09-0064-05

2016-10-17

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目（No：142102810950）

鄭華月，E-mail：huangqijunsc@163.com