吳鴻，韓勇軍，高水波，雷震，王振濤，韓麗華

（河南中醫(yī)藥大學 1.細胞成像實驗室，2.心血管病研究所，河南 鄭州 450002）

臨床研究·論著

PRT318對膠原誘導人血小板Syk磷酸化的影響*

吳鴻1，韓勇軍1，高水波1，雷震1，王振濤2，韓麗華2

（河南中醫(yī)藥大學 1.細胞成像實驗室，2.心血管病研究所，河南 鄭州 450002）

目的觀察脾酪氨酸激酶（Syk）抑制劑PRT060318（PRT318）在體外對人血小板聚集率及Syk磷酸化的影響。方法采用比濁法測定PRT318對膠原、二磷酸腺苷（ADP）及花生四烯酸（AA）誘導的人血小板聚集率的影響；運用Western blot檢測Syk525/6磷酸化水平。結果Syk特異性抑制劑PRT318可抑制膠原誘導的人血小板聚集率，但對ADP或AA誘導的人血小板聚集率無影響。在蛋白水平上PRT318可促進人血小板在膠原誘導下Syk525/6磷酸化水平升高。酪氨酸蛋白激酶抑制劑PP2可抑制膠原誘導的人血小板聚集，降低人血小板在膠原誘導下Syk525/6磷酸化水平，并可阻斷膠原誘導下PRT318促Syk525/6磷酸化作用。結論PRT 318對膠原誘導的血小板聚集具有抑制作用，并能促進膠原誘導的血小板膜受體糖蛋白VI信號通路上Syk525/6磷酸化，提示PRT318可能通過作用于Syk525/6磷酸化而抑制血小板聚集。

PRT318；膠原；血小板集聚；Syk525/6磷酸化

在血小板參與止血、血栓形成過程中，血小板膜受體糖蛋白VI（glycoprotein VI，GPVI）是其中一個重要的受體，阻斷GPVI下游信號通路能減少血栓形成，成為目前研發(fā)新型抗血栓藥物的新靶點[1-2]。GPVI受體激活后，下游脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）磷酸化，血小板發(fā)生聚集，Syk在該過程中起重要作用[3-4]。Syk特異性抑制劑PRT060318（以下簡稱PRT318）在不同動物體內可抑制動脈血栓形成，表明Syk在血栓形成中起重要作用，而PRT318對膠原誘導人血小板Syk磷酸化水平的影響尚無報道[5]。本實驗利用體外人血小板，觀察PRT318對膠原誘導人血小板GPVI信號通路上Syk525/6磷酸化的影響。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

Syk抑制劑PRT318、Src家族激酶抑制劑PP2購于美國Selleck公司，膠原、腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）及花生四烯酸（arachidonic acid，AA）購于美國Helena公司，兔抗p-Syk525/6和兔t-Syk抗體購于美國 Cell Signaling Technology公司。血小板來自本實驗室健康自愿者靜脈血。

1.2 血小板懸液制備

空腹靜脈采血2 ml置于3.2%枸櫞酸鈉抗凝管中，室溫下500 r/min離心10 min，取上清液，即為富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）。于PRP中加入阿司匹林（終濃度為1 mmol/L）防止血小板活化，37℃孵育30 min，室溫放置5 min，3 000 r/min離心5 min，去上清液，用無Ca2+臺氏液懸浮[無Ca2+臺氏液組成：氯化鈉NaCl 140 mmol/L，氯化鉀KCl 5 mmol/L，氯化鎂MgCl23.7 mmol/L，D-葡萄糖（D-glucose）2 mmol/L，羥乙基哌嗪乙磺酸（hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，HEPES）10 mmol/L，pH=7.4]，調節(jié)血小板濃度至1×108個/ml備用。

1.3 血小板聚集率測定

為檢測PRT318對膠原誘導血小板聚集率的影響，并驗證PRT318對膠原作用的特異性，使用血小板聚集儀進行血小板聚集率的測定。血小板聚集儀（美國Helena公司）于實驗前30 min開機預熱，取專用比色杯，加入100 μl血小板，分別加入25 μl不同濃度的PRT318（終濃度分別為1.0、2.5和5.0 μmol/L）或PP2（終濃度分別為10.0、20.0和50.0 μmol/L），陰性對照組加入25 μl生理鹽水。37℃孵育5 min，加入100 μl含Ca2+臺氏液[含Ca2+臺氏液組成：NaCl 140 mmol/L，KCl 5 mmol/L，氯化鈣CaCl22.5 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，D-glucose 2 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，pH 7.4]，輕輕混勻，再分別加入25 μl血小板激動劑膠原（終濃度為2.5 μg/ml）或ADP（終濃度為5.0 μmol/L）或AA（終濃度為500.0 μg/ml），在磁棒攪拌下（1 200 r/min）記錄5min內血小板聚集過程及最大聚集率。

1.4 Western blot檢測p-Syk525/6

本實驗觀察PRT318和Syk上游蛋白Src抑制劑PP2對膠原誘導人血小板Syk525/6磷酸化的影響。取100 μl血小板，加入不同濃度PRT318（終濃度分別為1.0、2.5和5.0μmol/L）或PP2（終濃度分別為10.0、20.0和50.0 μmol/L），37℃孵育5 min，加入膠原，37℃孵育、震蕩3 min（轉速1 200 r/min）。4℃下13 000 r/min離心2 min，棄去上清液，加入70 μl蛋白裂解液，提取總蛋白。聚氰基丙烯酸正丁酯法測蛋白定量，稀釋后用5×SDS Buffer處理樣品。配置10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分離膠和5%濃縮膠，取蛋白80 μg/孔上樣，300 V恒壓30 min。半干轉轉膜1 h，5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入抗體p-Syk525/6（1∶1 000）、t-Syk（1∶1 000），4℃孵育過夜。二抗37℃孵育1 h后，增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，凝膠成像系統采集圖像并分析。

1.5 統計學方法

數據分析采用Graphpad prism 5統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PRT318對膠原誘導血小板聚集率的影響

在膠原（2.5 μg/ml）誘導下，血小板集聚率升高。4組血小板集聚率比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=622.183，P=0.000）。PRT318濃度為2.5和5.0 μmol/L時能抑制血小板聚集，且隨濃度增加抑制作用越明顯，與對照組比較，差異有統計學意義。見圖1。

2.2 PRT318對ADP、AA誘導血小板聚集率的影響

ADP（5.0 μmol/L）和AA（500 μg/ml）均能有效誘導血小板集聚率升高。4組血小板集聚率比較，經方差分析，差異無統計學意義（F=0.202，P=0.892）。與對照組比較，PRT318（5.0 μmol/L）對ADP、AA誘導的血小板聚集率均無抑制作用，表明PRT318對血小板聚集率的抑制作用具有膠原誘導選擇性。見圖2。

2.3 PRT318對膠原誘導血小板Syk525/6磷酸化的影響

6組磷酸化水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=50.655，P=0.000）。在未加誘導劑膠原狀態(tài)下Syk525/6處于低磷酸化水平，而10.0 μg/ml膠原可誘導Syk525/6磷酸化水平升高。與單純使用膠原比較，濃度分別為0.5、1.0和2.5 μmol/L的PRT318對膠原（10.0 μg/ml）誘導的血小板Syk525/ 6磷酸化有促進作用。見圖3。

2.4 不同濃度膠原對 PRT318作用的血小板Syk525/6磷酸化的影響

4組磷酸化水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=56.266，P=0.000）。在無膠原誘導下，PRT318（2.5μmol/L）對Syk525/6磷酸化無促進作用，而隨著膠原濃度增加，Syk525/6磷酸化水平也逐漸增加，與對照組比較，差異有統計學意義。見圖4。

2.5 PP2對膠原、ADP和AA誘導血小板聚集率的影響

6組血小板集聚率比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=180.651，P=0.000）。與對照組比較，濃度為10.0、20.0及50.0 μmol/L的PP2能抑制膠原（2.5 μg/ml）誘導的血小板聚集率。其中，PP2濃度為50.0 μmol/L時對血小板聚集率的抑制作用最為顯著。而50.0 μmol/L PP2對ADP（5.0 μmol/L）和AA（500 μg/ml）誘導的血小板聚集率無抑制作用。結果表明，PP2只通過GPVI信號通路對膠原誘導的血小板聚集率產生抑制效應。見圖5。

2.6 PP2對膠原誘導血小板Syk525/6磷酸化的影響

5組磷酸化水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=10.966，P=0.001）。與單獨應用膠原比較，濃度為10.0、20.0及50.0 μmol/L的PP2對膠原（10.0 μg/ml）誘導的人血小板Syk525/6磷酸化有抑制作用。見圖6。

圖1 PRT318對膠原誘導血小板聚集率的影響

圖2 PRT318對ADP、AA誘導血小板聚集率的影響

圖3 PRT318對膠原誘導血小板Syk525/6磷酸化的影響

圖4 不同濃度膠原對PRT318作用的血小板Syk525/6磷酸化的影響

圖5 PP2對膠原、ADP和AA誘導血小板聚集率的影響

圖6 PP2對膠原誘導血小板Syk525/6磷酸化的影響

圖7 PP2對PRT318促進膠原誘導Syk525/6磷酸化的影響

2.7 PP2對PRT318促進膠原誘導Syk525/6磷酸化的影響

4組磷酸化水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=42.983，P=0.001）。PRT318能升高膠原誘導的Syk磷酸化水平，不同濃度的PP2（10.0、20.0及50.0 μmol/L）對其均有抑制作用。見圖7。

3 討論

PRT318是近期發(fā)現的一種新型、特異性高的Syk抑制劑，但PRT318調節(jié)膠原誘導的人血小板GPVI信號通路Syk磷酸化的作用尚不清楚。本研究第一次發(fā)現，在膠原誘導作用下，PRT318可抑制人血小板聚集，在蛋白水平上升高Syk525/6的磷酸化水平。同時發(fā)現，在PRT318作用前提下，隨著膠原濃度增加，Syk525/6磷酸化水平也隨之增加，而在缺乏PRT318作用時，即使增加膠原濃度，Syk525/6磷酸化水平也未出現明顯變化。

非常有趣的是，ANDRE等[5]研究發(fā)現，PRT318能夠抑制人血小板Syk525/6磷酸化，與本實驗結果相反。但無論是抑制或促進血小板Syk磷酸化，ANDRE小組研究結果與本研究結果相同的地方是PRT318對血小板聚集率都表現出抑制作用。分析其原因可能為以下幾個方面：①所用血小板激動劑不同。ANDRE等[5]所用誘導劑為Convulxin（一種GPVI受體特異性激動劑），而本實驗所用誘導劑為膠原，膠原受體除GPVI之外，還有糖蛋白Ⅰa/Ⅱa（glycoproteinⅠa/Ⅱa，GPⅠa/Ⅱa）。當膠原與GPVI、GPⅠa/Ⅱa結合后，外部信號傳遞至血小板內部[6-7]，盡管GPⅠa/Ⅱa在傳遞膠原信號由外到內的作用相對微弱，但分析其信號網絡可能與Convulxin參與的信號網路不同，也可能是PRT318對Syk磷酸化水平發(fā)揮不同作用的主要原因；②所用防止血小板活化的預處理試劑不同。ANDRE等[5]使用糖蛋白Ⅱb/Ⅲa）抑制劑埃替非巴肽對血小板進行預處理，而本實驗使用的是阿司匹林，兩者作用部位不同；③激動劑誘導血小板活化的時間不同。Andre小組使用Convulxin誘導血小板1 min，本實驗使用膠原誘導的時間為3 min。血小板在激動劑Convulxin刺激下，Syk會迅速磷酸化，在30 s時達到最高水平，但通路也很快啟動去磷酸化，在60 s時Syk磷酸化水平已開始降低，在150 s時Syk磷酸化水平顯著降低。而膠原對Syk磷酸化和去磷酸化的作用時間軸與Convulxin不盡相同，亦有可能對Syk磷酸化水平高低具有重要影響。有研究表明，若敲除Syk負調控基因TULA-2，則Syk磷酸化一直維持在較高水平[8-9]，因此分析PRT318在膠原作用下可能阻礙類似TULA-2該類具有去磷酸功能的蛋白與Syk相結合，使得Syk磷酸化保持高水平狀態(tài)。但只有Syk磷酸化，不足以活化血小板，血小板仍保持圓盤狀[10]，血小板集聚率仍處于較低水平，本研究結果也證明該點，也就是說即使PRT318促使膠原誘導的Syk磷酸化水平升高，但在PRT318作用下膠原誘導的血小板集聚率卻處于低水平狀態(tài)。

Src家族激酶Fyn和Lyn位于Syk上游，抑制Src激酶會抑制Syk激活以及Syk底物磷酸化[11-12]。本實驗證實，Src特異性抑制劑PP2可抑制血小板聚集，并在蛋白水平上抑制Syk525/6磷酸化水平。在PP2作用下，PRT318對膠原誘導的Syk525/6磷酸化的促進作用亦被阻斷，表明PRT318作用靶點是Syk蛋白磷酸化位點而不是其他。

綜上所述，PRT318可有效抑制膠原誘導的血小板聚集，并能促進GPVI信號通路上Syk525/6磷酸化，PRT318作用靶點位于Syk蛋白磷酸化位點。今后尚需對PRT318在膠原誘導下是如何促進人血小板Syk525/6磷酸化水平升高的詳細機制進行探索，并對Syk其他磷酸化位點的影響做進一步研究。同時需要研究在Syk抑制劑PRT318相互作用下同為GPVI受體激動劑的膠原和Convulxin對人血小板Syk磷酸化誘導作用差異化的原因，分析血小板活化的調控網絡。

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（李科 編輯）

Effect of PRT318 on collagen-induced Syk phosphorylation in human platelets*

Hong Wu1,Yong-jun Han1,Shui-bo Gao1,Zhen Lei1,Zhen-tao Wang2,Li-hua Han2
(1.Laboratory of Cell Imaging,2.Institute of Cardiovascular Disease,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou,Henan 450002,China)

ObjectiveTo observe the effect of PRT060318 (PRT318),an inhibitor of spleen tyrosine kinase (Syk),on human platelet aggregation and Syk phosphorylationin vitro.MethodsThe effect of PRT318 on platelet aggregation induced by collagen,adenosine diphosphate (ADP)and arachidonic acid (AA)was measured by turbidimetry.The phosphorylation of Syk525/6 was detected by Western blot.ResultsThe Sykspecific inhibitor PRT318 suppressed collagen-induced platelet aggregation,while it did not have significantly inhibitory effect on ADP-or AA-induced platelet aggregation.The present data showed that PRT318 promoted the phosphorylation of Syk525/6 in collagen-induced platelets.PP2,tyrosine protein kinase (Src)inhibitor, inhibited collagen-induced platelet aggregation and decreased the level of Syk525/6 phosphorylation induced by collagen.PP2 also blocked PRT318-enhanced Syk525/6 phosphorylation in collagen-treated platelets.ConclusionsPRT318 significantly inhibits collagen-induced platelet aggregation and promotes collagen-induced phosphorylation of Syk525/6 locating in the downstream of glycoprotein VI (GPVI)signal pathway,suggesting that PRT318 may inhibit platelet activation through regulating Syk525/6 phosphorylation.

PRT318;collagen;platelet aggregation;phosphorylation of Syk525/6

R331.143

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.008

1005-8982（2017）09-0039-05

2016-12-13

國家自然科學基金（No：81072968）；教育部留學回國人員科研啟動基金[No：教外司（20011568）]；河南省重點科技攻關項目（No：102102310334）

高水波，Tel：0371-60906297；E-mail：wuziao@126.com