王晴，韓文杰，張旗，陳丹陽，高菁，丁楠，張迅杰，李強

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100102)

玄參抗內(nèi)毒素性急性肺損傷活性的譜效關系研究

王晴，韓文杰，張旗，陳丹陽，高菁，丁楠，張迅杰，李強*

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100102)

目的：分析玄參不同提取部位的高效液相特征圖譜與抗內(nèi)毒素性急性肺損傷活性之間的相互關系。方法：通過HPLC-MS測定分析玄參不同提取部位的HPLC特征圖譜，利用氣管滴注LPS的方法復制急性肺損傷模型并測定肺泡灌洗液中白細胞數(shù)目及肺的濕干比，運用偏最小二乘回歸分析法研究譜效之間的關系，并用HPLC-MS/MS指認樣品主要成分的峰。結(jié)果：各提取部位對急性肺損傷大鼠均有一定的作用，通過譜效分析得出3個藥效貢獻率較大的成分，分別是哈帕苷、安格洛苷C、毛蕊花糖苷。結(jié)論：本研究初步確定玄參抗內(nèi)毒素性急性肺損傷的物質(zhì)基礎為哈帕苷、安格洛苷C、毛蕊花糖苷。

玄參；特征圖譜；譜效分析；急性肺損傷

玄參為玄參科植物玄參(ScrophularianingpoensisHemsl.)的干燥根，性寒，味苦、甘、咸；歸肺、胃、腎經(jīng)；具有清熱涼血，瀉火解毒，滋陰生津，潤燥通便的功效，為溫病熱毒證常用藥，出現(xiàn)在“清營湯”“清瘟敗毒飲”等經(jīng)典治療熱毒血證的方劑中?，F(xiàn)代藥理研究表明玄參具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、增強免疫、抗氧化、抗疲勞、抗血小板凝集等藥理作用[1]。急性肺損傷的臨床表現(xiàn)常伴有炎癥，發(fā)熱，咳喘等癥狀，屬于中醫(yī)熱毒營血證的范疇，因此，從藥效學角度提示玄參有治療急性肺損傷的潛力。玄參化學成分十分豐富，主要包括環(huán)烯醚萜、苯丙素、黃酮類物質(zhì)，另外還含有少量的多糖、生物堿、有機酸、揮發(fā)油、植物甾醇等化合物[2-3]。課題組前期研究表明，玄參對內(nèi)毒素性急性肺損傷有一定的防治作用，但其物質(zhì)基礎尚不清楚。因此本實驗研究玄參不同提取部位對內(nèi)毒素性急性肺損傷的保護作用，并采用偏最小二乘回歸分析法研究不同部位HPLC特征圖譜與藥效之間的關系，以獲得的玄參抗急性肺損傷的主要活性成分。

1 材料

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；美國 Agilent 1100 HPLC /MSD Trap (G1376A 毛細管泵，G1315B 二極管陣列檢測器，離子阱質(zhì)譜儀)；KQ-500E 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；1/10萬電子分析天平(CAP225D Sartorius)；甲醇為色譜純、流動相水為超純水，其余試劑均為分析純；脂多糖LPS(L2880，sigma)；血細胞分析儀(XFA6100A)；玄參購買于安國藥材市場，由北京中醫(yī)藥大學劉春生老師鑒定；清潔級SD雄性大鼠90只，體質(zhì)量190～210 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 玄參不同提取部位的制備

玄參藥材6份，每份200 g，分別用10倍量的水、30%、50%、70%、90%的乙醇提取3次，每次1 h，共制備2份水提液，將其中一份水提物濃縮后用95%乙醇醇沉終濃度為80%，低溫靜置48 h后去除沉淀。所有提取物減壓濃縮至無醇味，使最終含有生藥量0.5 g/ml。

2.2 LC-MS特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱Agilent Zorbax SB-C18( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ； 柱溫30℃；流速 1. 0 ml/min；進樣量10 μL；流動相A為甲醇、B為0.1%醋酸水，梯度洗脫0～40 min(5%～35%A)，40～60 min(35%～50%A)，60～80 min(50%～65%A)。檢測波長在290 nm下，樣品各色譜峰具有較好的分離度，且峰相對較多，而哈帕苷為玄參的指標性成分，且只有末端吸收，結(jié)合相關文獻[4]選擇210 nm、290 nm為檢測波長。

2.2.2 質(zhì)譜條件

離子阱質(zhì)譜，離子源：ESI；檢測模式為負離子模式檢測；離子噴射電壓-4 500 V；毛細管電壓自動；霧化氣壓35 psi；干燥氣流速11 L/min;干燥器溫度350℃；掃描質(zhì)量范圍m/z 100～1 500。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密量取各提取物含生藥量0.5 g/ml，離心取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得各供試品溶液。

2.2.4 對照品溶液的配置

分別精密稱取哈帕苷、安格洛苷C、毛蕊花糖苷對照品適量，用甲醇溶解定容，并過0. 22 μm 微孔濾膜，即得各對照品溶液。

2.2.5 樣品測定

取各供試品溶液進行液相及液質(zhì)聯(lián)用分析，進樣量為10 μl，在290 nm波長下記錄80 min的色譜圖和質(zhì)譜圖，如圖1所示，290 nm波長下，從6組液相圖譜中選擇20個響應度較高的峰。210 nm波長下選擇哈帕苷的峰如圖2所示，并按出峰時間依次排列，見表1(其中6號峰為210 nm波長下哈帕苷色譜峰)。哈帕苷、安格洛苷C、毛蕊花糖苷標準品及樣品的紫外圖譜如圖3所示，玄參質(zhì)譜總離子流圖如圖4所示，通過查閱文獻及標準品對照，對玄參LC-MS/MS圖譜進行解析，選中的21個峰共指認出9個化合物，見表2。

圖1 各組提取物HPLC液相圖譜(290 nm)注：S1:水提；S2:30%醇提；S3:50%醇提；S4:70%醇提；S5: 90%醇提；S6:水提醇沉。

圖2 各組提取物哈帕苷HPLC峰(210 nm)注：A：水提；B：30%醇提；C：50%醇提；D：70%醇提；E：90%醇提；F：水提醇沉。

表1 各樣品HPLC色譜峰的峰面積

No.tR/min水提30%醇提50%醇提70%醇提90%醇提水提醇沉14.209464.7557.2634.8589.9406.1373.626.064606.1665.1721683.9951.4510.138.028926.9724.5806878.41361.41306.6410.4611136.2562.4458.9573.2606.81125.9513.711139.1169.1136.5151.5137.8113.66*16.28318014.316208.317748.418014.313013.117404.7720.939719.6595.8701.1731.9439.4621.6828.557202.7221.7230234135.2153.9930.792524.9366.8311.5361.1358.91981033.641164.6219.1110.1187.6123.2165.31135.248669.2533.6363.6490.8375.8628.81239.116517365.5356.1394.2273.9483.61345.505223.6498.9438.7413.8263.63431446.427676.1837.1897.81141.4633.8773.81550.232659.9414.6354.2395.5284.7711.81656.2175744.95283.25282.15244.63320.95491.91758.7556268.257345011.95249.84174.15716.91860.623570.8360.3244.8290.5261.85371963.676192.2175.8155.4150.4117.8170.32065.27665.276141.7118.4131.2100.9159.12172.9715402.55654.35874.3526950045419.4

注：*為210 nm波長下所出的峰。

圖3 標準品及樣品紫外圖注：A：哈帕苷標準品；B：樣品；C：毛蕊花糖苷標準品；D：樣品；E：安格洛苷C標準品；F：樣品。

圖4 玄參提取物總離子流圖

表2 HPLC-MS/MS色譜峰指認

No.tR/minm/z[M-H]-裂解碎片分子式化合物推測410.461387.366387,225,123C17H24O10梔子苷[5]616.283363.129201,183,165,157,139C15H24O10哈帕苷[6]720.939487.144307,179,161,135C21H28O13肉蓯蓉苷F[6]930.792487.1463341,325,307,163,145C21H28O13Acretoside1345.505471.149323,219,189,161,147C21H28O12sibiriosideA[6]1446.427623.1971461,315,179,161,135C29H36O15毛蕊花糖苷[6]1656.217783.2716607,589,461,193,175C36H48O19安格洛苷C[6]1758.755147.0451103C9H8O2肉桂酸[7]2172.971493.1704345,183,165,147C24H30O11哈帕俄苷[6]

2.3 不同提取部位的藥效試驗

2.3.1 動物模型的建立

90只雄性SD大鼠隨機分為9組，正常對照組(NS)、模型組(LPS)、陽性藥組、水提組、30%醇提組、50%醇提組、70%醇提組、90%醇提組、水提醇沉組，每組10只。按照LPS 5 mg/kg 氣管滴注法復制ALI模型。各組均采用10%的水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，50°仰臥固定，剝離氣管，用1 ml注射器緩緩滴注LPS后，直立旋轉(zhuǎn)，使LPS盡量在肺內(nèi)均勻分布。正常對照組大鼠：氣管滴注等體積的生理鹽水。陽性藥組：在氣管滴注LPS前，腹腔注射地塞米松注射液(2 mg/kg)。造模后12 h取材。

2.3.2 大鼠肺泡灌洗液中白細胞數(shù)目和肺濕干比測定

大鼠麻醉后腹主動脈取血處死，剪開頸部皮膚并打開胸腔，使氣管充分暴露，分離并結(jié)扎右支氣管；主氣管插管，向左肺緩緩注入2.5 ml冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS )，待左肺逐漸變得鼓起、泛白時，輕輕撫摸數(shù)次，并回抽1.5 ml肺泡灌洗液，如此平行進行3次；獲取BALF(4℃，1 300 rmp，10min)離心，沉淀用PBS重懸，利用血細胞分析儀記錄BALF中白細胞數(shù)量；取右肺上葉稱取濕重(W)后置于80℃烘箱中，烘至恒重，記錄干重(D)，計算肺的濕干比(W/D)。白細胞抑制率(%)=(LPS組白細胞數(shù)目-給藥組白細胞數(shù)目)/LPS組白細胞數(shù)目×100%；濕干比下降率(%)=(LPS組濕干比-給藥組濕干比)/LPS組濕干比×100%。結(jié)果顯示LPS組白細胞數(shù)目和濕干比均高于正常對照組(P<0.05)，各提取物白細胞數(shù)目和濕干比均小于LPS組，其中水提、50%醇提、70%醇部位能更顯著的降低白細胞數(shù)目；除水提醇沉部位外其他各部位均能抑制急性肺損傷肺的水腫情況，結(jié)果見表3。

表3 BALF白細胞計數(shù)及肺濕干比

注：與正常組比較，#P<0.05，與模型組比較，*P<0.05。

2.4 統(tǒng)計學分析

2.5 譜效關系研究

由于實驗中藥效數(shù)據(jù)和指紋圖譜數(shù)據(jù)有不同的度量單位(即量綱不同)，所以對原始數(shù)據(jù)進行標準化處理，以消除變量量綱差異。以通過標準化處理的特征圖譜中各化學成分的峰面積為自變量，以標準化處理后的藥效抑制率指標作為因變量，利用METALAB7.4.0統(tǒng)計軟件，運用偏最小二乘回歸法進行譜效分析，計算出各自變量對應因變量的回歸系數(shù)。其中回歸系數(shù)代表各自變量對因變量的貢獻大小，以回歸系數(shù)進行建模，即得回歸方程。

以各組提取物對白細胞的抑制率作為因變量得到回歸方程：

y1=0.142 0x1+(-0.016 6)x2+(-0.040 5)x3+0.021 1x4+(-0.142 9)x5+0.237 0x6+0.295 2x7+0.147 0x8+0.109 2x9+(-0.208 5)x10+(-0.043 3)x11+(0.114 8)x12+(-0.140 5)x13+0.186 0x14+0.014 8x15+0.098 3x16+(-0.012 0)x17+(-0.035 1)x18+(-0.025 3)x19+(-0.192 1)x20+(-0.021 6)x21，R2=0.997 6

以各組提取物對濕干比的下降率作為因變量得到回歸方程：

y2=0.051 0x1+0.072 1x2+0.021 0x3+0.000 2x4+0.147 9x5+0.114 1x6+0.220 6x7+0.132 5x8+0.254 8x9+0.223 8x10+0.084 8x11+0.063 7x12+(-0.172 6)x13+0.424 2x14+(-0.064 6)x15+(-0.045 6)x16+(-0.039 5)x17+(-0.062 7)x18+(-0.161 2)x19+(-0.132 6)x20+(-0.513 5)x21，R2=0.999 4

由于回歸方程是有各回歸系數(shù)與峰面積乘積之和組成，所以x對y的貢獻率取決于系數(shù)和峰面積兩個因素，選擇與y呈正相關的峰(回歸系數(shù)為“+”)，并以所有正相關系數(shù)與峰面積乘積之和作為分母，以各個正相關系數(shù)與峰面積乘積作為分子，得出自變量x對y的貢獻率。有藥效指標可以看出玄參水提部位對白細胞的抑制較強，玄參50%醇提部位對濕干比的干預作用較強，對二者各峰進行貢獻率計算，結(jié)果見表4。

表4 玄參提取物中各峰對藥效的貢獻率

有貢獻率可知，6號、16號峰對y1的貢獻率達89.215 2%，6號、14號峰對y2的貢獻率達83.829 6%，由上文可知6號、14號、16號峰分別為為哈帕苷、毛蕊花糖苷、安格洛安C。結(jié)果提示，玄參對抗內(nèi)毒素性急性肺損傷的活性物質(zhì)可初步確定為哈帕苷、毛蕊花糖苷、安格洛安C。

3 討論

由于哈怕苷只有末端吸收，且為2010年《中國藥典》規(guī)定的玄參指標性成分，而在290 nm波長下，樣品各色譜峰具有較好的分離度，且峰相對較多，基本顯示玄參化學成分的全貌，故最終確定檢測波長為210 nm、290 nm。

中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥制劑經(jīng)適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示其化學特征的色譜圖或光譜圖。中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學成分系統(tǒng)研究的基礎上，主要用于評價中藥材以[8-13]及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性?！罢w性”和“模糊性”為其顯著特點。但單純的指紋圖譜不能確定到底是中藥中哪個或哪類化合物在藥效中起主要作用，而譜效關系是將指紋圖譜與藥效評價相結(jié)合，進行相關研究，不僅可以闡明中藥可能的活性成分還可以標示各成分之間的協(xié)同、拮抗作用，并實現(xiàn)中藥內(nèi)在質(zhì)量的綜合評價和控制，指導和加速新藥的開發(fā)與研究[14-15]。構(gòu)建譜效關系的數(shù)據(jù)處理方法是譜效分析的關鍵步驟，目前譜效關系中常用的譜效分析方法主要有回歸分析、相關分析、主成分分析、灰色關聯(lián)度分析、聚類分析、人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型分析等。一般譜效關系研究中常同時使用多種數(shù)據(jù)分析方法，更全面有效的揭示譜效關系[16-18]。本課題研究采用偏最小二乘回歸分析法，將6組不同提取部位的共有峰峰面積與藥效數(shù)據(jù)標準化處理后進行關聯(lián)分析。

本實驗研究結(jié)果表明玄參中16種化合物與藥效呈正相關，初步可以判斷這些成分對急性肺損傷的防治起協(xié)同作用。根據(jù)16種化合物的貢獻率大小得出3個主要活性成分即為哈帕苷、毛蕊花糖苷和安格洛苷C。相關研究表明哈帕苷、安格洛苷C、具有抗炎、抗氧化作用[19]，安格洛苷C、毛蕊花糖苷能對抗血小板凝集，能降低血漿纖溶酶原啟動抑制劑-1水平[20]。這些藥理活性均與急性肺損傷的治療機制相對應[21-22]。提示玄參對急性肺損傷有一定的治療作用，值得進一步開發(fā)研究。

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國家自然科學基金項目(No.81373830)；“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項-雙黃連粉針劑技術改造(No.2011ZX09201-201-15)； 北京中醫(yī)藥大學在讀研究生自主選題項目(No.2016-JYB-XS119)

王晴(1991-)，女，北京中醫(yī)藥大學2014級中藥化學專業(yè)碩士研究生。

李強*(1972-)，男，博士，研究員，主要研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎及功效成分組研究。

2016-09-01

R28

A

1002-2406(2017)03-0009-05

修回日期：2016-09-10