蘭芳俊， 吳 娟， 何清雯， 曹穎平， 李 彬

臨床分離大腸埃希菌質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因和β內(nèi)酰胺酶基因檢測

蘭芳俊1， 吳 娟2， 何清雯1， 曹穎平1， 李 彬1

目的 探討大腸埃希菌臨床分離株質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥（PMQR）基因的流行情況，及其與 β 內(nèi)酰胺酶基因相關(guān)性。方法 收集 2013 年 7－12 月福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院臨床分離的對左氧氟沙星和 /或環(huán)丙沙星耐藥的大腸埃希菌200 株，采用 PCR 檢測 qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac(6')-Ib-cr、qepA 和 oqxAB 基因，對 PMQR 基因陽性菌株擴增常見 β 內(nèi)酰胺酶基因 ；采用瓊脂稀釋法對 PMQR 基因陽性菌株進行藥敏試驗，以及 PCR 法對菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分型 ；利用腸桿菌基因重復(fù)一致序列分析（ERIC-PCR）進行菌株同源性分析。結(jié)果 PCR 擴增結(jié)果顯示實驗菌株 PMQR 陽性率為29.0%（58/200）。其中 qnr 陽性率為 5.5%（11/200），aac(6')-Ib-cr 陽性率為 20.5%（41/200），oqxAB 陽性率為 8.0%（16/200），qepA 陽性率為 0.5%（1/200）。58 株 PMQR 基因陽性菌株中 CTX-M-1 組 32 株（55.2%）、CTX-M-9 組 17 株（29.3%）和TEM 型 1 株（1.7%），未檢出 SHV 型 β 內(nèi)酰胺酶基因。PMQR 陽性菌呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象 ；系統(tǒng)發(fā)育分型結(jié)果顯示 A 型有21 株（36.2%），D 型 17 株（29.3%），B2 型 11 株（19.0% ），B1 型 9 株（15.5% ）。ERIC-PCR 顯示 PMQR 大腸埃希菌可分為 50 個不同的型別，其中 1 株未能分型。結(jié)論 該院大腸埃希菌中 PMQR 基因以 aac(6')-Ib-cr、qnr 和 oqxAB 為主，且與 β內(nèi)酰胺酶耐藥基因高度相關(guān) ；此外PMQR 菌株以非克隆播散方式在該院中流行。

大腸埃希菌 ； 喹諾酮類耐藥 ； 質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥 ； β 內(nèi)酰胺酶

氟喹諾酮類藥物是目前臨床治療革蘭陰性菌感染最常用的抗菌藥物之一。隨著該藥臨床上的廣泛使用，其耐藥性也不斷增長。細(xì)菌對喹諾酮類的耐藥主要是由染色體介導(dǎo)，包括藥物靶位改變、膜滲透性改變和外排泵表達過度。質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥（PMQR）機制的存在使細(xì)菌更容易產(chǎn)生高水平的耐藥[1]。目前 PMQR 基因包括 qnr、aac(6')-Ib-cr、qepA 和 oqxAB，其作用方式各不相同，均介導(dǎo)細(xì)菌對喹諾酮類抗菌藥物的低水平耐藥[2]。細(xì)菌耐藥性的迅速增加，給臨床抗感染治療帶來嚴(yán)峻的考驗。本研究對臨床分離的大腸埃希菌進行耐藥狀況和喹諾酮類耐藥基因的調(diào)查，同時探討 PMQR 基因與 β內(nèi)酰胺酶基因之間的關(guān)系，旨在為臨床合理選用抗菌藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集 2013 年 7－12 月福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院臨床分離的對左氧氟沙星和/或環(huán)丙沙星耐藥的大腸埃希菌 200 株，剔除同一患者同一部位的重復(fù)菌株。所有菌株均使用 VITEK系統(tǒng)鑒定。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC25922。

1.1.2 儀 器 與 試 劑 細(xì) 菌 鑒 定 儀 為 VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定儀（法國生物梅里埃公司）；PCR 擴增儀（美國 Applied Biosystems 公司）；Universal Hood Ⅱ凝膠成像分析系統(tǒng)（美國BIO-RAD 公司）。PCR 擴增試劑為大連寶生物有限公司產(chǎn)品 ；100 bpDNA Maker、電泳用瓊脂糖、Goodview 核酸染料購自鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司。萘啶酸、四環(huán)素、頭孢噻肟、頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星均購于中國藥品生物制品檢定所，亞胺培南為杭州默沙東制藥有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性試驗 采用瓊脂稀釋法檢測藥物對大腸埃希菌的 MIC，按美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）2014 版標(biāo)準(zhǔn)操作及判斷結(jié)果。

1.2.2 PCR 擴增 PMQR 和 β 內(nèi)酰胺酶基因 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA模板。反應(yīng)體系、引物序列見表1[3-12]。反應(yīng) 條 件 為 94 ℃預(yù)變 性 5 min ；94 ℃變 性 30 s，55 ℃ 退 火 30 s，72 ℃ 延 伸 30 s， 共 30個循環(huán)，最后 72 ℃延伸 10 min。引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。PCR 陽性產(chǎn)物均送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進行測序，測序結(jié)果在 GenBank 中經(jīng) BLAST 程序分析比對。

1.2.3 系 統(tǒng) 發(fā) 育 分 型 基 因 檢 測 多 重 PCR 對PMQR 基因陽性菌株擴增系統(tǒng)發(fā)育分型基因，包括 ChuA、YjaA、TspE4.C2；引物合成參照文獻 [13]。1.2.4 菌 株 同 源 性 分 析 利 用 腸 桿 菌 科 基 因 重復(fù)一致序列分析（ERIC-PCR）對 PMQR 基因陽性菌 進行 同 源 性 分析。引 物序 列 為 ERIC-1 ： 5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'，ERIC-2 ： 5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'。反應(yīng)條件 ：94 ℃ 預(yù) 變 性 5 min ；94 ℃ 變 性 1 min、26 ℃ 退 火1 min、72 ℃ 延 伸 1 min， 共 4 個 循 環(huán) ；94 ℃ 變 性30 s、40 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 1 min，共 40 個循環(huán) ；最后 72 ℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物 經(jīng) 2% 瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果，判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻 [14]。

2 結(jié)果

2.1 PMQR 基因檢測

200 株耐藥大腸埃希菌中，檢出 PMQR 基因陽 性 菌 58 株（29.0%）。 其 中 qnr 11 株（5.5%）；aac(6')-Ib-cr 41 株（20.5%）；oqxAB 16 株（8.0%）；qepA 1 株（0.5%）。未檢出 qnrA、qnrC 和 qnrD 基因。結(jié)果見表2。

2.2 β 內(nèi)酰胺酶基因擴增

58 株 PMQR 陽性菌株中共有 45 株（77.6%）攜 帶 β 內(nèi) 酰 胺 酶 基 因。5 株 攜 帶 CTX-M-1 組 和CTX-M-9 組 2 種 β 內(nèi)酰胺酶基因。未檢出 SHV、CTX-M-2 組基因。結(jié)果見表3。

2.3 藥敏試驗

58 株 PMQR 基因陽性菌株對萘啶酸耐藥且耐藥水平較高，對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥率分別為 96.6% 和 91.4% ；對四環(huán)素和慶大霉素的耐藥率分別為 98.3% 和 88.0% ；對頭孢菌素類抗生素敏感性不一，對頭孢噻肟和頭孢吡肟的耐藥率分別為 82.8% 和 27.6% ；對阿米卡星和亞胺培南耐藥率較低。結(jié)果見表4。

表1 PCR 擴增引物序列Table 1 Primer used for PCR ampli fi cation in this study

表2 200 株大腸埃希菌 PMQR 基因型分布Table 2 Prevalence of PMQR genotypes in the 200 strains of E. coli [ n ( % ) ]

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分型

本次研究中，58 株 PMQR 基因陽性大腸埃希菌檢出 A 型 21 株（36.2%），D 型 17 株（29.3%），B2 型 11 株（19.0%）， B1 型 9 株（15.5%）。

2.5 菌株同源性

根據(jù) ERIC-PCR 結(jié)果分析，58 株 PMQR 基因陽性大腸埃希菌可分為 50個不同的型別，另有 1株未能分型。

3 討論

由于喹諾酮類藥物抗菌譜廣以及抗菌作用強，已經(jīng)成為繼頭孢菌素類之后抗感染應(yīng)用最廣泛的抗菌藥物。但隨著喹諾酮類的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致細(xì)菌在藥物選擇性壓力下，表現(xiàn)出對此類抗菌藥物的耐藥率越來越高。在 1998 年首次發(fā)現(xiàn) PMQR 基因 qnr，隨后新的 PMQR 基因及耐藥機制不斷被發(fā)現(xiàn)，包括 aac(6')-Ib-cr 基因、oqxAB 基因和 qepA基因。這些耐藥基因雖引起細(xì)菌對喹諾酮類藥物低水平耐藥，但其與染色體編碼的DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓樸異構(gòu)酶Ⅳ的突變具有相關(guān)性，后者可造成高水平氟喹諾酮類耐藥[15]。

表3 58 株 PMQR 基因陽性菌株中 β 內(nèi)酰胺酶基因的分布Table 3 Prevalence of β-lactamase encoding genes in the 58 PMQR-positive isolates [ n ( % ) ]

本研究顯示PMQR基因陽性大腸埃希菌攜帶qnr 基因占 5.5%，低于黃麗等[16]的報道。aac(6')-Ib-cr 基因是本地區(qū)中為最常見的 PMQR 流行基因，檢出率低于陳聰?shù)萚17]報道的檢出率。還發(fā)現(xiàn)oqxAB 陽性菌株在本地區(qū)的流行中也占有較大的比例，與其他文獻的報道相似[18-19]。本實驗顯示，PMQR 基因陽性菌株中β內(nèi)酰胺酶的檢出率達到77.6%，部分菌株攜帶 2 種或以上類型的 β 內(nèi)酰胺酶基因。有研究表明PMQR 基因通常與 β 內(nèi)酰胺酶基因共同存在于同一個質(zhì)粒，并且能夠共同傳播[20-21]。PMQR 基因的高檢出率及 PMQR 與 β 內(nèi)酰胺酶基因的高共存率[22]，表明兩者在介導(dǎo)細(xì)菌耐藥的進程中關(guān)系緊密。

表4 58 株 PMQR 基因陽性菌株對 9 種抗菌藥物的藥敏結(jié)果Table 4 Antimicrobial susceptibility of the 58 PMQR-positive strains to 9 antimicrobial agents

大腸埃希菌腸外致病株毒力最強的是B2型，其次是 D 型，A 型和 B1 型主要為共生菌[23]。張嶸等[24]對杭州地區(qū)的研究表明 D 型為主要部分。Zhao 等[25]對蘇州地區(qū)的研究表明所占比例最高的為 B2 型，其次為 D 型。本研究顯示 A 型（36.2%）為主，D型次之，與其他研究報道有一定的差別，其原因可能為菌株來源的差別，如本研究中收集的喹諾酮類耐藥菌株等。ERIC-PCR 檢測未發(fā)現(xiàn)明顯的優(yōu)勢克隆，推測本院PMQR基因陽性菌株為非克隆性傳播。

綜上，本院大腸埃希菌中喹諾酮類耐藥基因主 要 為 aac(6')-Ib-cr、qnr 和 oqxAB， 且 與 β 內(nèi) 酰胺酶耐藥基因高度相關(guān) ；此外 PMQR 基因陽性菌株以非克隆播散方式在本院中流行。PMQR 介導(dǎo)的耐藥往往是低水平的，但這些耐藥基因的存在有利于使菌株對喹諾酮類藥物產(chǎn)生高水平的耐藥，從而給臨床帶來嚴(yán)重的危害。PMQR 基因能夠在不同細(xì)菌中通過水平傳播并導(dǎo)致更大范圍的流行。因此醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)采取有效措施控制抗菌藥物的濫用，以防止多重耐藥菌株的產(chǎn)生及廣泛播散，同時加強對PMQR基因流行情況的監(jiān)測與防控。

[1] 畢超，蔣崗，余廣超，等 . 質(zhì)粒介導(dǎo)的大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥機制的研究 [J]. 中國醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21 （18）：3755-3758.

[2] BRIALES A， RODRIGUEZ-MARTINEZ JM， VELASCO C， et al. In vitro effect of qnrA1， qnrB1， and qnrS1 genes on fluoroquinolone activity against isogenic Escherichia coli isolates with mutations ingyrA and parC [J]. Antimicrob Agents Chemother， 2011， 55（3）： 1266-1269.

[3] CHEN X， ZHANG W， PAN W， et al. Prevalence of qnr， aac（6'）-Ib-cr， qepA， and oqxAB in Escherichia coli isolates from humans， animals， and the environment [J]. Antimicrob Agents Chemother， 2012， 56（6）： 3423-3427.

[4] CATTOIR V， POIREL L， ROTIMI V， et al. Multiplex PCR for detection of plasmid-mediated quinolone resistance qnr genes in ESBL-producing enterobacterial isolates [J]. J Antimicrob Chemother， 2007， 60（2）： 394-397.

[5] WANG M， GUO Q， XU X， et al. New plasmid-mediated quinolone resistance gene， qnrC， found in a clinical isolate of Proteus mirabilis [J]. Antimicrob Agents Chemother， 2009， 53（5）： 1892-1897.

[6] CAVACO LM， HASMAN H， XIA S， et al. qnrD， a novel gene conferring transferable quinolone resistance in Salmonella enteric serovar Kentucky and Bovismorbif i cans strains of human origin [J]. Antimicrob Agents Chemother， 2009， 53（2）： 603-608.

[7] CATTOIR V， POIREL L， NORDMANN P. Plasmid-mediated quinolone resistance pump QepA2 in an Escherichia coli isolate from France [J]. Antimicrob Agents Chemother， 2008， 52（10）：3801-3804.

[8] PARK CH， ROBICSEK A， JACOBY GA， et al. Prevalence in the United States of aac（6'）-Ib-cr encoding a ciprof l oxacinmodifying enzyme [J]. Antimicrob Agents Chemother， 2006， 50（11）： 3953-3955.

[9] TONKIC M， MOHAR B， SISKO-KRALJEVIC K， et al. High prevalence and molecular characterization of extended-spectrum beta-lactamase-producing Proteus mirabilis strains in southern Croatia [J]. J Med Microbiol， 2010， 59（Pt 10）： 1185-1190.

[10] BHATTACHARJEE A， SEN MR， PRAKASH P， et al. Role of beta-lactamase inhibitors in enterobacterial isolates producing extended-spectrum beta-lactamases [J]. J Antimicrob Chemother，2008， 61（2）： 309-314.

[11] PARK YJ， LEE S， KIM YR， et al. Occurrence of extendedspectrum （beta）-lactamases and plasmid-mediated AmpC（beta）-lactamases among Korean isolates of Proteus mirabilis[J]. J Antimicrob Chemother， 2006， 57（1）： 156-158.

[12] GARREC H， DRIEUX-ROUZET L， GOLMARD JL， et al. Comparison of nine phenotypic methods for detection of extendedspectrum beta-lactamase production by Enterobacteriaceae[J]. J lin Microbiol， 2011， 49（3）： 1048-1057.

[13] MOULIN-SCHOULEUR M， REPERANT M，LAURENT S，et al. Extraintestinal pathogenic Escherichia coli strains of avian and human origin:link between phylogenetic relationship and common virulence patterns[J]. J Clin Microbial，2007，45（10）：3366-3379.

[14] VERSALOVIC J，KOEUTH T，LUPSKI JR. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes[J]. Nucleic Acids Res，1991，19（24）：6823-6831.

[15] MACHUCA J， BRIALES A， LABRADOR G， et al. Interplay between plasmid-mediated and chromosomal-mediated fluoroquinolone resistance and bacterial fitness in Escherichia coli [J]. J Antimicrob Chemother， 2014， 69（12）： 3203-3215.

[16] 黃麗，高曉坤，張宏 . 腸桿菌科細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因的檢測 [J]. 中國感染與化療雜志，2014，14（4）：286-290.

[17] 陳聰，葉英，江洋，等 . 安徽地區(qū) PMQR 基因陽性大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中 ESBLs 流行特征的研究 [J].中國抗生素雜志， 2013， 38（3）： 239-244.

[18] 李瑞華，劉亮，聶大平，等 . oqxAB 基因在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中的流行及傳播 [J].中國感染與化療雜志，2013，13 （6）：456-459.

[19] YUAN J， XU X，GUO Q， et al. Prevalence of the oqxAB gene complex in Klebsiella pneumonia and Escherichia coli clinical isolates [J]. J Antimicrob Chemother， 2012， 67（7）：1655-1659.

[20] BRIALESA， RODRIGUES-MARTINEZ JM， VELASCO C， et al. Prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance determinant sqnr and aac(6')-Ib-cr in Escherichia coli and Klebsiella pneumonia producing extended-spectrum β-lactamases in Spain[J]. Int J Antimicrob Agents， 2012，39（5）： 431-434.

[21] ALOUACHE S， ESTEPA V， MESSAI Y，et al. Characterization of ESBLs and associated quinolone resistance in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates from an urban wastewater treatment plant in Algeria [J]. Microb Drug Resist， 2014， 20（1）：30-38.

[22] FERJANI S， SAIDANI M， AMINE FS， et al. Prevalence and characterization of plasmid-mediated quinolone resistance genes in extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae in a Tunisian hospital[J]. Microb Drug Resist， 2015， 21（2）：158-166.

[23] PITOUT JD. Extraintestinal pathogenic Escherichia coli： an update on antimicrobial resistance， laboratory diagnosis and treatment [J]. Expert Rev Anti Infect Ther， 2012，10（10）：1165-1176.

[24] 張嶸， 池丹， 蔡加昌， 等 . 大腸埃希菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制及分子分型 [J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2014，34（ 4 ）： 256-263.

[25] ZHAO R， SHI J， SHEN Y， et al. Phylogenetic distribution of virulence genes among ESBL-producing uropathogenic Escherichia coli isolated from long-term hospitalized patients [J]. J Clin Diagn Res， 2015， 9（7）： DC01-DC04.

Survey on the genes conferring plasmid-mediated quinolone resistance and those encoding β-lactamases in Escherichia coli isolates

LAN Fangjun, WU Juan, HE Qingwen, CAO Yingping, LI Bin.
（Department of Laboratory Medicine, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China）

Objective To examine the prevalence of plasmid mediated quinolone resistance (PMQR) genes and their correlation with the genes encoding β-lactamases in E. coli isolates. Methods A total of 200 levof l oxacin- and/or ciprof l oxacin-resistant E. coli isolates were collected from Fujian Medical University Union Hospital during the period from July to December 2013. PCR method was used to screen these E. coli isolates for the presence of qnrA, qnrB, qnrC, qnrD, qnrS, aac(6’)-Ib-cr, qepA, oqxAB genes, and the blaTEM, blaSHVand blaCTX-Mgenes in the PMQR positive strains. Agar dilution method was utilized to measure the antimicrobial susceptibility of PMQR-positive strains. Phylogenetic analysis was conducted by triplex PCR. Enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction (ERIC-PCR) was used to evaluate the genetic similarity between the PMQR-positive isolates. Results Of the 200 clinical isolates of E. coli, 58 (29.0%) were PMQR-positive. And qnr, aac(6’)-Ib-cr, oqxAB, and qepA genes were positive in 11 (5.5%), 41 (20.5%), 16 (8.0%), 1 (0.5%) strains, respectively. The genes encoding CTX-M-1, CTX-M-9 and TEM type enzymes was positive in 32 (55.2%), 17 (29.3%), and 1 (1.7%) of the PMQR-positive strains, respectively. The blaSHVgene was not identif i ed in any isolate. PMQR-positive strains were multi-drug resistant. Phylogenetic analysis indicated that 21 (36.2%), 17 (29.3%), 11 (19.0%), and9 (15.5%) of the PMQR-positive strains belonged to group A, group D, group B2 and group B1, respectively. ERIC-PCR suggested the PMQR-positive isolates belonged to 50 different types. Only one strain was non-typeable. Conclusions Most of the PMQR-related genes in E. coli are aac(6’)-Ib-cr, qnr, and oqxAB in our hospital, which are highly relevant to β-lactamase genes. PMQR-positive strains may spread by way of non-clonal dissemination in our hospital.

Escherichia coli; quinolone resistance; plasmid mediated quinolone resistance; β-lactamase

R378.21

：A

：1009-7708 ( 2017 ) 03-0293-05

10.16718/j.1009-7708.2017.03.013

2016-09-06

2016-10-17

國家自然科學(xué)基金（81201328）；福建省高校杰青項目（JA13134）；福建省衛(wèi)計委中青年骨干人才培養(yǎng)項目（2015-ZQN-ZD-15）。

1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，福州 350001；2. 福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)與技術(shù)工程學(xué)院。

蘭芳俊（1992—），男，碩士研究生，主要從事細(xì)菌耐藥機制研究。

李彬，E-mail：leonlee307@hotmail.com。