袁莉莉， 丁百興， 沈 震， 吳 湜， 徐曉剛， 李光輝

耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的耐藥性及分子流行病學(xué)研究

袁莉莉， 丁百興*， 沈 震*， 吳 湜*， 徐曉剛*， 李光輝*

目的 了解耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌（CRPA）對抗菌藥物的耐藥性及分子生物學(xué)特征。方法 收集2013年1－12月復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院住院患者臨床分離的CRPA 104株，采用瓊脂稀釋法對菌株行藥敏測定；脈沖場凝膠電泳（PFGE）行同源性分析。結(jié)果 104株CRPA對美羅培南、亞胺培南的耐藥率分別為85.6%、98.1%，對阿米卡星、慶大霉素的耐藥率分別為18.3%、40.4%，對頭孢他啶和頭孢吡肟的耐藥率分別為26.9%和21.2%，對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為44.2%和50.0%，對哌拉西林-他唑巴坦、頭孢哌酮-舒巴坦和替卡西林-克拉維酸的耐藥率分別為19.2%、26.9%和52.9 %，對氨曲南耐藥率為26.9%，對黏菌素耐藥率最低，僅為5.8%。PFGE分析存在48個型別（3株未能分型），9個克隆?？寺是主要流行株，占41.6%（42/101），科室主要集中在神經(jīng)外科、老年科及綜合病房，其次為克隆B，占5.9%（6/101）。結(jié)論 醫(yī)院內(nèi)存在耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的多個克隆，應(yīng)采取有效的感染控制手段，加強抗菌藥物臨床應(yīng)用管理，延緩細菌耐藥性產(chǎn)生并阻止耐藥菌進一步播散。

銅綠假單胞菌 ； 碳青霉烯類耐藥 ； 耐藥性 ； 同源性分析

銅綠假單胞菌廣泛分布于自然界及健康人的皮膚、腸道和呼吸道等部位，為醫(yī)院感染主要的條件致病菌之一。近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，該菌對此類藥物的耐藥率一直處于高位水平[1-2]，給臨床抗感染治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。了解復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 2013 年 1－12 月耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌（CRPA）耐藥特點及分子流行病學(xué)情況，對指導(dǎo)臨床合理用藥，控制與降低該菌引起的醫(yī)院感染非常重要。本研究采用瓊脂稀釋法檢測 104 株 CRPA 對 15 種常用抗菌藥物的耐藥性 ；脈沖場凝膠電泳（PFGE）進行同源性分析。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 收 集 2013 年我 院 住 院患者送 檢 的CRPA 菌株 104 株。標(biāo)本來自于痰液、尿液、引流液等。剔除同一患者的重復(fù)菌株。入選標(biāo)準(zhǔn)：紙片法抑菌圈直徑亞胺培南≤15 mm 或美羅培南≤15 mm，兩者只要其中一種符合上述范圍。鑒定采用法國生物梅里埃公司 API20NE 鑒定條。

1.1.2 抗菌藥物 除替卡西林為大連美侖生物技術(shù)有限公司制品外，其余測試抗菌藥物均購自于中國藥品生物制品檢定所。

1.1.3 培 養(yǎng) 基 和 主 要 試 劑 培 養(yǎng) 基 購 自 于 英 國OXOID 公司 ；內(nèi)切酶 Spe I、濃度為 20 mg/mL 的蛋白酶 K 購自 TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 采用瓊脂倍比稀釋法檢測藥物的最低抑菌濃度（MIC），操作及結(jié)果判讀按照2013 版 CLSI標(biāo)準(zhǔn)。藥敏試驗質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌 ATCC27853、大腸埃希菌 ATCC35218。

1.2.2 PFGE ① 細菌 DNA 原位純化 ：將細菌與等體積1%低熔點瓊脂糖混勻后注模，成型凝膠塊經(jīng)蛋白酶K溶液裂解、已滅菌的蒸餾水及TE液多次洗滌，置于 4 ℃過夜。② 限制性內(nèi)切酶原位消化：將原位純化的凝膠塊切成一定大小薄片，加 入 120 μL 酶 切 體 系（ 內(nèi) 切 酶 SpeI）37 ℃ 孵 育3 h。③ 加樣 ：把消化好的膠塊及標(biāo)準(zhǔn)菌株 H9812置于膠梳板上，把梳子放入膠槽中，用 0.5×TBE液配制 1% Golden agarose 澆制電泳膠，室溫下凝固 30 min 左右。凝固后用融化的自身膠或低熔點膠 封 閉 加 樣 孔。 ④ 電 泳 參 數(shù) ：6 V/cm，19 h， 角度變換 120°，轉(zhuǎn)換時間為 2.16～54.17 s。 ⑤ 染色及圖像采集：電泳結(jié)束后，EB染色。采用凝膠成像系統(tǒng)（Bio．Rad）采集凝膠 DNA 指紋圖像。判讀標(biāo)準(zhǔn)與文獻一致[3]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用 WHONET5.4 進行統(tǒng)計及匯總。

2 結(jié) 果

2.1 CRPA 臨床流行情況

2.1.1年齡分布 分離 104 株 CRPA 的患者年齡在19～99 歲，平均 58 歲，其中 50 歲以上的患者占65.4%（68/104），19～50 歲患者占 34.6%（36/104）。2.1.2 科室分布 臨床科室分布依次為神經(jīng)外科33株（31.7%），ICU 21株（20.2 %），老年科18株（17.3%），綜合病房15株（14.4%），神經(jīng)內(nèi)科7株（6.7%），普外科6株（5.8%），皮膚科、感染科、呼吸科和耳鼻咽喉科各1株（各占1.0%）。

2.1.3 標(biāo)本來源 104 株 CRPA 中分離自呼吸道標(biāo)本 88 株（85.6%）、腹腔引 流 液 8 株（7.7%）、尿液 2 株（1.9%）、血液 2 株（1.9%）、組織 2 株（1.9%）、膽汁 1 株（1.0%）、分泌物 1 株（1.0%）。

2.2 藥敏試驗結(jié)果

104 株 CRPA 對美羅培南、亞胺培南的耐藥率分別為 85.6%、98.1%，對阿米卡星、慶大霉素的耐藥率分別為 18.3%、40.4%，對頭孢他啶和頭孢吡肟的耐藥率分別為 26.9% 和 21.2%。對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為 44.2% 和 50.0%。對哌拉西林-他唑巴坦、頭孢哌酮-舒巴坦和替卡西林 -克拉維酸的耐藥率分別為 19.2%、26.9% 和52.9 %。對氨曲南耐藥率為 26.9%。對黏菌素耐藥率最低，僅為 5.8%。見表1。

2.3 PFGE PFGE

采用 PFGE 對 CRPA 進行同源性分析，并用Bionumerisc 軟 件 對其 PFGE 圖譜 進行聚類分析，結(jié)果顯示 PFGE 圖譜相似值為 16.8%～99.6%，共存在 48 個型別（3 株未能分型），9 個克隆?？寺 為優(yōu)勢流行株，占 41.6%（42/101），主要集中在我院的神經(jīng)外科、老年科及綜合病房，見圖1；次之為克隆 B，占 5.9%（6/101），見圖2?？寺?C、克隆 I各 2 株，各占 2.0%（2/101）。

3 討論

銅綠假單胞菌是需氧不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌，是一種重要的條件致病菌。目前，世界各地陸續(xù)出現(xiàn)了該菌耐碳青霉烯類藥物的報道[4-6]，耐藥情況嚴(yán)峻已成臨床最棘手的問題之一。本研究中 104株 CRPA 多分離自 50 歲以上的中老年患者，主要集中在神經(jīng)外科及 ICU，這可能與中老年患者自身免疫力低下，且神經(jīng)外科及 ICU 絕大部分患者病情嚴(yán)重、住院時間長、普遍應(yīng)用廣譜抗菌藥物、各種侵襲性操作頻繁使用及醫(yī)護人員消毒不嚴(yán)格等因素有關(guān)。分離株多數(shù)來源于呼吸道，與文獻報道的一致[7]。藥敏試驗結(jié)果顯示，該菌對多黏菌素 B 敏感率最高，達 83.7%，但低于臺灣的 93.9%[8]。 其 次 為 阿 米 卡 星， 敏 感 率 達 68.3%。阿米卡星對其有良好的抗菌作用可能是該類藥物多數(shù)對氨基糖苷類鈍化酶穩(wěn)定，且在臨床中的用量較其他類藥物少的原因。從藥敏結(jié)果可以看出：CRPA 對多種抗菌藥物均產(chǎn)生了較強的耐藥性，在治療方面可選擇藥物有限，可根據(jù)藥物敏感試驗結(jié)果選用抗假單胞菌β內(nèi)酰胺類+氨基糖苷類或喹諾酮類 + 黏菌素的聯(lián)合治療[9]。

表1 104 株 CRPA 菌株對常用抗菌藥物的藥敏結(jié)果Table 1 Susceptibility prof i le of 104 strains of carbapenem-resistant P. aeruginosa to the commonly used antimicrobial agents

圖1 42 株 A 型 CRPA 的聚類分析圖Figure 1 Clustering analysis of 42 carbapenem-resistant P. aeruginosa strains by pulsed-f i eld gel electrophoresis

圖2 6 株 B 型 CRPA 的聚類分析圖Figure 2 Clustering analysis of 6 carbapenem-resistant P. aeruginosa strains by pulsed-f i eld gel electrophoresis

細菌同源性分析的方法有很多，包括隨機擴增多態(tài)性 DNA（RAPD）、擴增限制性片段長度多態(tài)性分析（AFLP）、重復(fù)序列 PCR 分析（REP-PCR、ERIC-PCR）、MLST、PFGE 等。PFGE 具 有 良 好的分辨率、特異性、穩(wěn)定性和結(jié)果可靠性，被譽為細菌分子分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，已被眾多國家采用。有研究證實 PFGE 比 MLST 對銅綠假單胞菌的分辨率更高[10]，本研究通過 PFGE 對 CRPA 的DNA 分子條帶類型進行分析，并使用 Bionumerisc軟件對 PFGE 圖譜進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)這批菌株共分為 48 個型別（3 株未能分型），9 個克隆，分別為 克 隆 A～I。PFGE 圖譜 相 似 值 16.8%～99.6%。A 型為主要型別有 42 株，占 41.6%，圖譜相似值80.1%～98.0%。 在 3 月 4－7 日， 在 神 經(jīng) 外 科 和綜合病房都發(fā)現(xiàn)了相同分型的菌株感染，這一時間、地點和人群的高度集中性提示我院在3月初這段時間出現(xiàn)過小規(guī)模的交叉感染。其中，hsh243和 hsh264 都來自 3 月份神經(jīng)外科的痰液標(biāo)本 ；而hsh262 和 hsh265 都來自綜合病房的痰液標(biāo)本。在11－12 月，出現(xiàn)了在神經(jīng)外科、綜合病房和老年病房的多個聚類高峰，提示在這一段時間內(nèi)也可能出現(xiàn)了小規(guī)模的交叉感染。

在 A 型 中 hsh1268 和 hsh1340 菌 株、hsh1117和 hsh854 菌株具有完全相同 PFGE 指紋。hsh1268是從1例神經(jīng)外科女性患者的痰液中分離，而hsh1340 來自綜合病房，同樣為痰液樣本，這提示可能存在同一克隆株的播散，但是并未發(fā)現(xiàn)除此之外來自神經(jīng)外科患者也有與此完全相同的 PFGE分型。hsh1117 和 hsh854 分離自同一時期的老年病房中相同性別菌株相同來源的患者，從暴露史上分析，這2例患者均有吸痰史，提示2例患者很有可能感染同一菌株，具體原因是暴露于相同環(huán)境，還是患者之間接觸傳染尚不能確定。

其次為 B 型，6 株，占 5.94%，圖譜相似值為80.3%～97.4%。hsh1033 和 hsh1319 菌 株 都 來 自神經(jīng)外科年齡相似患者的痰液標(biāo)本，由于住院時間不同，因此并不知道患者之間是否存在交叉感染的可能；也有可能是都暴露于相同環(huán)境所導(dǎo)致的相同菌株感染。hsh1208 和 hsh720 菌株具有完全相同 PFGE 指紋，但來自不同時期的不同病房，尚不能確定相互之間的關(guān)系。值得注意的是，這些完全同源的菌株科室分布集中，而且菌株與菌株之間檢出時間跨度不大，皆在3個月以內(nèi)，特別是 C 型的 hsh470 和 hsh547 都來自同一個月 ICU的痰液標(biāo)本，提示可能來源同一菌株，也暴露了ICU 在感染的傳播和擴散控制上存在一定問題。D型 hsh954 和 hsh976 也是來自同一個月的標(biāo)本，但是菌株來源的患者和科室并不同，其傳播途徑值得進一步深入調(diào)查，但可以反映出不同的科室在這個時間段的消毒滅菌工作存在缺陷。

綜上所述，對于 CRPA 的感染，應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果合理應(yīng)用抗菌藥物，對于病房的管理應(yīng)加強醫(yī)護人員的手衛(wèi)生和嚴(yán)格遵守?zé)o菌技術(shù)規(guī)范操作，加強留置醫(yī)療器械的護理，避免交叉感染。

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Antibiotic resistance and molecular epidemiology of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa

YUAN Lili, DING Baixing, SHEN Zhen, WU Shi, XU Xiaogang, LI Guanghui.
（Infection Control Unit, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China）

Objective To investigate the antibiotic resistance pattern and molecular epidemiology of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa. Methods The antimicrobial susceptibility was measured by agar dilution method for the 104 strains of carbapenem-resistant P. aeruginosa (CRPA) collected from Huashan Hospital. The homology between these strains was evaluated by pulsed fi eld gel electrophoresis (PFGE). Results Of the104 CRPA strains, 85.6% were resistant to meropenem and 98.1% to imipenem. These strains also showed various percentages of resistance to amikacin (18.3%), gentamicin (40.4%), ceftazidime (26.9%), cefepime (21.2%), ciprof l oxacin (44.2%), levof l oxacin (50.0%), piperacillin-tazobactam (19.2%), cefoperazone-sulbactam (26.9%), ticarcillin-clavulanic acid (52.9%), aztreonam (26.9%), and colistin (5.8%). PFGE analysis showed that these strains were divided into 48 types, belonging to 9 clones. Only 3 strains were non-typeable. Clone A was the primary epidemic strain (41.6%, 42/101), which was mainly isolated from Neurosurgery, Geriatrics and General Ward. Clone B accounted for 5.9% (6/101) of the strains. Conclusions Multiple clones of carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa were prevalent in Huashan hospital. Effective infection control approaches should be adopted to prevent the development and the further spreading of antimicrobial resistance.

Pseudomonas aeruginosa; carbapenem-resistant; antimicrobial resistance; homology analysis

R378.991

：A

：1009-7708 ( 2017 ) 03-0289-04

10.16718/j.1009-7708.2017.03.012

2016-08-04

2016-11-24

復(fù)旦大學(xué) 附 屬 華山醫(yī) 院 醫(yī) 院感染管 理 科 ，上海200040；*抗生素研究所。

袁莉莉（1984—），女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事醫(yī)院感染防控工作。

李光輝，E-mail：liguanghui@fudan.edu.cn。