段忠亮， 秦娟秀， 李 敏， 關(guān) 明

上海某醫(yī)院臨床分離嗜麥芽窄食單胞菌分子流行病學(xué)分析

段忠亮1，2， 秦娟秀3， 李 敏3， 關(guān) 明1

目的 研究上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院成人患者分離嗜麥芽窄食單胞菌的分子流行病學(xué)特征，為嗜麥芽窄食單胞菌的感控提供數(shù)據(jù)支持。方法 收集 2014 年 1－9 月該醫(yī)院成人患者分離的非重復(fù)嗜麥芽窄食單胞菌，采用多位點序列分型（MLST）和脈沖場凝膠電泳（PFGE）方法分析其克隆特點 ；用紙片擴散法測定 3 種抗菌藥物（左氧氟沙星，甲氧芐啶-磺胺甲唑，米諾環(huán)素）的敏感性 ；PCR 檢測 4 種主要毒力基因（Stmpr1，Stmpr2，smf-1，Smlt3773locus）；采用半定量生物膜形成試驗分析其生物膜形成能力 ；同時收集和分析患者的臨床信息。結(jié)果 共收集78株嗜麥芽窄食單胞菌，26 株來自外科監(jiān)護室，其余較為分散。檢出患者以男性為主占 67.9%（53 / 78），在分離出嗜麥芽窄食單胞菌之前都有抗菌藥物應(yīng)用史，62.8% 患者使用 3 種以上抗菌藥物。MLST 分析檢測出 38 種新的 ST 型，命名為 STnew1-STnew38，嗜麥芽窄食單胞菌的型別較為分散，較多的 ST23 型只有 6 株，克隆流行傳播趨勢不明顯。PFGE 顯示 78 株菌株分成 58 個簇群，無明顯聚集的簇群。78 株菌株對左氧氟沙星、甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率分別為 2.6%（2 / 78）、10.3%（8 / 78），所有菌株 對 米 諾 環(huán) 素 均 敏 感。Stmpr1、Stmpr2、smf-1 和 Smlt3773locus 毒 力 基 因 陽 性 率 分 別 為 79.5%（62 / 78）、93.6%（73 / 78）、94.9%（74 / 78）和 48.7%（38 / 78）。生物膜形成試驗結(jié)果顯示 ：生物膜形成能力平均值為 D492=0.51±0.44，不同性別的患者中無明顯差異。結(jié)論 嗜麥芽窄食單胞菌檢出患者以男性居多，感染患者大多有抗菌藥物應(yīng)用史，毒力基因攜帶率較高。未發(fā)現(xiàn)同一科室明顯的克隆傳播。

嗜麥芽窄食單胞菌 ； 多位點序列分型 ； 脈沖場凝膠電泳

不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），廣泛存在于水體和環(huán)境中[1]。其主要引起呼吸系統(tǒng)感染[2]，也可引起尿路感染、關(guān)節(jié)感染和皮膚感染等[3]。隨著臨床上各種抗生素和免疫抑制劑的應(yīng)用及侵襲性醫(yī)療設(shè)備的廣泛使用，患者免疫力下降，導(dǎo)致該菌的醫(yī)院感染呈逐漸上升趨勢。嗜麥芽窄食單胞菌是毒力不高的致病菌，但其本身含有β內(nèi)酰胺酶，對許多 β 內(nèi)酰胺類藥物天然耐藥[4]，同時也可借助產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶及外排泵表達等機制對多種抗生素產(chǎn)生耐藥[5]，使得嗜麥芽窄食單胞菌臨床多重耐藥菌株不斷增多，給治療加大了難度。國內(nèi)對嗜麥芽窄食單胞菌感染的分子流行病學(xué)調(diào)查較 少， 多 關(guān) 注 分離 科室 和 耐藥 情況[6-8]。崔 茜等[9]采用多位點序列分型（MLST）對 18 株嗜麥芽窄食單胞菌進行分子分型研究，郭述良等[10]、孫 蕾 等[11]采 用 脈 沖 場 凝 膠 電 泳（PFGE） 分 型 法調(diào)查過度通氣患者和 ICU 患者中嗜麥芽窄食單胞菌的感染現(xiàn)狀。本研究對臨床分離的嗜麥芽窄食單胞菌采用 MLST 和 PFGE 兩種方法進行系統(tǒng)的分子流行特征分析，同時結(jié)合患者臨床信息、檢測毒力基因、耐藥情況和生物膜形成能力等，為臨床感控提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及臨床信息收集 收集 2014 年 1－9月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院 78株來自門診和住院成人患者感染分離的非重復(fù)嗜麥芽窄食單胞菌，所有菌株均經(jīng)過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI TOF MS）進行鑒定，同時搜集患者的臨床信息和抗菌藥物的應(yīng)用情況。

1.1.2 抗菌藥物及培養(yǎng)基 抗菌藥物包括左氧氟沙星、甲氧芐啶-磺胺甲唑和米諾環(huán)素，均購自英國 OXOID 公司，血平皿和 MH 瓊脂平皿購自法國梅里埃公司，血平皿用于接種細菌，MH平皿用于藥敏試驗。

1.2.3 藥物敏感性試驗 參照 CLSI中推薦的紙片擴散法對 3 種抗菌藥物（左氧氟沙星，甲氧芐啶 -磺胺甲唑和米諾環(huán)素）進行藥物敏感性試驗。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC25922 和銅綠假單胞菌 ATCC27853。

1.2.4 毒力基因的檢測 參考文獻 [13]合成引物（見表1），采用 PCR 方法檢測嗜麥芽窄食單胞菌

1.1.3 主要儀器和試劑 PCR擴增儀購自新加坡公司；MALDI TOF MS分析儀購自德國Bruker Daltonik公司；PCR試劑盒和細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker購自日本TaKaRa公司；PFGE系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 MLST MLST 法 參 考 網(wǎng) 站 http ： / / pubmlst. org / smaltophilia / 合成 7 對管家基因（atpD， gapA，guaA， mutM， nuoD， ppsA 和 recA）引物（引物序列見表1），進行 PCR 檢測。PCR 產(chǎn)物送上海鉑尚有限公司進行雙向測序，測序結(jié)果在該網(wǎng)站進行比對。并將 7 對管家基因拼接，利用 MEGA.4 建樹，進行進化分析。

1.2.2 PFGE PFGE 方 法 與 條 件 參 考 文 獻 [12]，并根據(jù)預(yù)實驗略做修改，（酶切：限制性內(nèi)切酶Xbal在 37 ℃酶切 3 h ；PGFE 電泳條件 ：2 000 mL 0.5×TBE，電壓 6.0 V / cm，溫度 14 ℃，脈沖夾角120 °， 起 始 脈 沖 時 間 5 s， 終 止 脈 沖 時 間 20 s， 電泳時間 19 h）。圖像錄入 BioNumerics（version 4.0，Applied Maths，Inc．）軟件包進行處理，并構(gòu)建聚類樹。的 4 個 主 要 毒 力 基 因（Stmpr1，Stmpr2，smf-1，Smlt3773locus），所得產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，電壓5 V / cm， 進 行 10 min， 根 據(jù) 片 段 大 小 判 斷 有 無，并計算毒力基因的攜帶率。

表1 MLST 和毒力基因引物序列表Table 1 Primers used for multilocus sequence typing and detection of virulence genes

1.2.5 生物膜測定 利用新鮮的 TSB 將過夜培養(yǎng)的嗜麥芽窄 食 單 胞菌調(diào)到 D600=1（相 當 于 1×109cfu / mL）， 再 次 1∶100 稀 釋 到 D600=0.01（1×107cfu / mL）， 吸 取 200 μL 加 入 到 96 孔 板 中 37 ℃ 培養(yǎng) 24 h 。采用結(jié)晶紫實驗測定其生物膜形成能力。首先將過夜培養(yǎng)的平皿 60 ℃固定 1 h ；棄上清液，用無菌 PBS 清洗 4 次 ；然 后 每孔加入 50 μL 結(jié)晶紫 染 液， 室 溫 靜 置 5 min ；用 自 來 水 洗 去 殘 余 染料，置于室溫晾干 ；加入 250 μL 33% 冰醋酸溶解15 min ；用酶標儀讀取 D492值來評估生物膜的形成能力。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 19 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用雙側(cè) t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Pearson 相關(guān)系數(shù)用來驗證兩變量之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 患者和菌株的基本臨床信息

本次研究中共計收集78株嗜麥芽窄食單胞菌，主要分離自外科監(jiān)護室（26 例），其次是神經(jīng)外科（12 例），其余來自肝膽外科、干部保健科和心血管外科等。嗜麥芽窄食單胞菌感染患者中，男53例，（67.9%），女 25 例（32.1%）。標本主要來自痰標本 65 份（83.3%），7 份取自引流物，6 份取自其他分泌物。患者在分離到嗜麥芽窄食單胞菌前均應(yīng)用過1～6種抗生素，平均每例使用3種，使用3 種及以上的患者占 62.8%，主要的抗菌藥物為頭孢菌素類（76.9%，60 / 78）、碳青霉烯類（64.1%，50 / 78） 和 酶 抑 制 劑 復(fù) 合 制 劑（62.8%，49 / 78） ，見表2。

表2 嗜麥芽窄食單胞菌感染前用藥情況Table 2 Prior use of antimicrobial agents before Stenotrophomonas maltophilia infection

2.2 MLST 克隆分型

本研究中嗜麥芽窄食單胞菌的克隆分型較為分散，共分為 52 種 ST 型。其中 49 株的等位基因部分與網(wǎng)站上不同，根據(jù)等位基因的不同分成38個 ST 型，記為 STnew1～STnew38。其余 29 株為數(shù)據(jù)庫已有 ST 型，其中 ST23 型 6 株，其他型別較分散，包括 ST5（3 株）、ST15（3 株）、ST24（3 株）、ST3（2 株）、ST84（2 株）、ST89（2 株）、ST99（2 株）及 ST8、ST13、ST36、ST77、ST98、ST112 各 1 株，見圖1。6 株 ST23 型的嗜麥芽窄食單胞菌分布在4個科室，同時標本來源最多的外科監(jiān)護室分離出24 個 ST 型，表明嗜麥芽窄食單胞菌的感染并無明顯的克隆傳播。

2.3 PFGE 分型結(jié)果

據(jù) PFGE 分型的診斷標準，按 80% 相似度可歸為一個群或簇（cluster）[14]，低于則視為流行病學(xué)上的不同克隆。對 78株嗜麥芽窄食單胞菌進行聚類和進化分析，共分成 58 個簇群，其中有 10株可劃分為同一簇群，其余為差異較大的菌株，無法劃分為同一簇群。上述同一簇群的 10株菌來自 7個科室。見圖2。

2.4 毒力基因檢測

毒力基因檢測顯示：Stmpr1、Stmpr2、smf-1、Smlt3773locus的陽性率較高，分別為79.5%（62 / 78）、93.6%（73 / 78）、94.9%（74 / 78）和48.7%（38 / 78），見圖2。

2.5 耐藥性分析

嗜麥芽窄食單胞菌對左氧氟沙星的耐藥率為2.6%，對甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率為 10.3%，對米諾環(huán)素均敏感。見表3。其中 1 株 ji82 對除米諾環(huán)素以外的2種檢測藥物耐藥。

圖1 78 株嗜麥芽窄食單胞菌的 MLST 克隆進化分析Figure 1 Phylogenetic analysis of 78 S. maltophilia isolates by multilocus sequence typing

2.6 生物膜形成能力

嗜麥芽窄食單胞菌的生物膜形成能力平均值 為 D492=0.51±0.44， 男 性 患 者 中 生 物 膜 形 成能 力 平 均 值 為 D492=0.48±0.44， 女 性 患 者 的 為D492=0.56±0.43，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3，同時將菌株的耐藥情況與生物膜形成能力進行分析，結(jié)果顯示兩者沒有明顯的相關(guān)性，見表3。

圖2 78 株嗜麥芽窄食單胞菌的 PFGE 進化分析Figure 2 Clustering analysis of 78 S. maltophilia isolates by pulsed fi eld gel electrophoresis

表3 78 株嗜麥芽窄食單胞菌的藥敏結(jié)果及與生物膜形成能力的分析Table 3 Correlation between the resistance rate and the ability of bio fi lm formation in the 78 S. maltophilia isolates

3 討論

嗜麥芽窄食單胞菌是較常見的條件致病菌[15]，可致呼吸道感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎、尿路感染等[16-17]， 在 該 菌 所 致 的 肺 炎 患 者 中， 致 死 率 為 14%～69%[18-19]。 在 近 年 的 中 國 細 菌 耐 藥 性 監(jiān) 測中[20-22]， 該 菌 在 不 發(fā) 酵 糖 革 蘭 陰 性 桿 菌 中 都 是 僅次于銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的第三大菌種。因此我們對本院 2014 年 1－9 月分離的嗜麥芽窄食單胞菌進行流行病學(xué)分析，從而為臨床感控提供參考。

圖3 女性和男性嗜麥芽窄食單胞菌生物膜形成能力比較Figure 3 Biof i lm formation ability of S. maltophilia isolates in females and males

MLST 結(jié)果顯示，78 株嗜麥芽窄食單胞菌型別較為分散，個體間嗜麥芽窄食單胞菌感染型別差異較大，說明科室內(nèi)無明顯特殊型別聚集流行傳播情況。同時 MLST 與 PFGE 的一致性較差，這也與國外的報道相符[13，23]。

患者在分離出嗜麥芽窄食單胞菌前均使用過1～6種抗菌藥物，平均每人應(yīng)用3種主要的抗菌藥 物 為 頭 孢 菌 素 類（76.9%，60 / 78）、 碳 青 霉 烯類（64.1%，50 / 78）和酶抑制劑復(fù)合制劑（62.8%，49 / 78），同時結(jié)合菌株的流行特征，我們推測嗜麥芽窄食單胞菌的感染更有可能是藥物選擇壓力下的內(nèi)源性感染，并非病房內(nèi)人與人之間的傳播。因本次收集的菌株較少，這有待于更多的數(shù)據(jù)支持。

因嗜麥芽窄食單胞菌天然對多種抗生素耐藥，本次分離的菌株對臨床上3種常用抗菌藥物耐藥率較低，但有1株對其中2種藥物耐藥。嗜麥芽窄食單胞菌對β內(nèi)酰胺類特殊的耐藥機制和多種耐藥機制導(dǎo)致耐藥的報道[1]，都提示我們不能放松對多重耐藥嗜麥芽窄食單胞菌的監(jiān)控。

總之，本院嗜麥芽窄食單胞菌感染以男性居多，毒力基因攜帶率較高。感染的患者大多有抗菌藥物應(yīng)用史，菌株呈現(xiàn)克隆多樣性，未發(fā)現(xiàn)同一科室明顯的克隆傳播，需要我們在臨床治療中合理使用抗生素，從而減少嗜麥芽窄食單胞菌的感染。

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通過上述表格可知，災(zāi)害點密度大小與易發(fā)性分區(qū)結(jié)果呈正相關(guān)，且較符合實際情況。研究區(qū)內(nèi)地質(zhì)災(zāi)害易發(fā)性分區(qū)說明如下：

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Molecular epidemiological analysis of Stenotrophomonas maltophilia strains in a teaching hospital in Shanghai

DUAN Zhongliang, QIN Juanxiu, LI Min, GUAN Ming.
（Department of Laboratory Medicine, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China）

Objective We evaluated the molecular epidemiology of Stenotrophomonas maltophilia strains in adult patients in Renji Hospital to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine for better control of S. maltophilia infections. Methods Nonduplicate clinical isolates of S. maltophilia were collected from Renji Hospital from January 2014 to September 2014. We examined the clonality among the S. maltophilia isolates by multilocus sequence typing (MLST) and pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Antimicrobial resistance pattern was investigated by Kirby-Bauer method and prevalence of toxin genes (Stmpr1, Stmpr2, smf-1, Smlt3773locus) by PCR. We also studied the biof i lm formation of S. maltophilia by semiquantitative biofilm formation test. Results A total of 78 nonduplicate S. maltophilia isolates were analyzed, of which 26 were isolated from surgical intensive care unit, and 53 strains were from male patients. All patients infected by S. maltophilia had

antibiotic therapy before the strains were isolated. At least three kinds of antibiotics were used in 62.8% of the patients. MLST analysis indicated that 49 isolates were assigned novel STs(STnew1-STnew38), with new combinations of allelic prof i les. The largest cluster of isolates was ST23 (6 strains). PFGE showed that there was weak genetic linkage between S. maltophilia strains. The 78 isolates were divided into 58 groups. About 2.6% (2 / 78) and 10.3% (8 / 78) of these strains were resistant to levof l oxacin and trimethoprim-sulfamethoxazole, respectively. All the strains were susceptible to minocycline. The prevalence of virulence genes Stmpr1, Stmpr2, smf-1 and Smlt3773 locus was 79.5% (62 / 78), 93.6% (73 / 78), 94.9% (74 / 78) and 48.7% (38 / 78), respectively. Biof i lm formation test indicated that the mean ability of biof i lm formation was 0.51±0.44 in terms of D492. There was no significant difference between males and females. Conclusions All patients with Stenotrophomonas maltophilia infection had a history of antibiotic use and male patients were susceptible population. Stenotrophomonas maltophilia isolates showed high prevalence of virulence genes. No clonal dissemination was found in the same department of hospital.

Stenotrophomonas maltophilia; multilocus sequence typing; pulsed fi eld gel electrophoresis

R378

：A

：1009-7708 ( 2017 ) 03-0283-06

10.16718 / j.1009-7708.2017.03.011

2016-11-08

2017-01-18

國家自然科學(xué)基金（81601853）；上海市衛(wèi)計委青年科研項目（20164Y0105）。

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗科，上海 200040；

2. 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院研究所；

3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院檢驗科。

段忠亮（1986—），男，碩士，主管技師，主要從事病原微生物的致病機制研究。

關(guān)明，E-mail：guanming88@126.com。