王芳，王俊，胡博，任美萍

（1.西南醫(yī)科大學藥學院，四川瀘州646000；2.西南醫(yī)科大學藥物與功能性食品研究中心，四川瀘州646000）

葡萄籽原花青素提取物對糖尿病小鼠的保護作用

王芳1，王俊1，胡博1，任美萍2，*

（1.西南醫(yī)科大學藥學院，四川瀘州646000；2.西南醫(yī)科大學藥物與功能性食品研究中心，四川瀘州646000）

研究葡萄籽原花青素提取物對鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）致糖尿病小鼠的作用及影響，并探討相關機制。通過高脂飼喂結合腹腔注射STZ造糖尿病小鼠模型，將造模成功的糖尿病小鼠隨機分為模型組，格列本脲組（250 mg/kg），葡萄籽原花青素（Grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）高劑量組（400 mg/kg）、中劑量組（200 mg/kg）、低劑量組（100 mg/kg），連續(xù)灌胃8周后通過斷尾取血測定糖尿病小鼠空腹血糖；摘眼球取血，分離血清，測定血清中甘油三脂（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇的含量（Lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C）；采用試劑盒測定血清白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）含量、C反應蛋白（C reactive protein，CRP）含量、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性、胰島素（Insulin，INS）含量，丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量；分離胰腺，組織切片法觀察胰腺組織學改變。實驗結果顯示GSPE高、中劑量組能顯著降低STZ所導致的糖尿病小鼠的血糖；GSPE高、中劑量組的TG、TC含量比模型組的顯著降低（P<0.05）；GSPE高劑量組的HDL-C比模型組顯著提高（P<0.05）；GSPE高、中劑量組能顯著降低血清中IL-6和CRP含量（P<0.05）；GSPE高劑量組的INS含量與模型組比較顯著性增加（P<0.05）；GSPE高、中劑量組的SOD活性與模型組相比顯著性增高（P<0.05），GSPE高劑量組的MDA含量與模型組比較顯著性降低（P<0.05）；糖尿病小鼠胰腺病變組織得到修復。綜上所述，葡萄籽提取物原花青素對STZ所導致的糖尿病小鼠有明顯的降低血糖和改善血脂，修復胰臟病變組織的作用，其作用機制可能與其能提高糖尿病小鼠機體抗氧化能力、降低炎癥因子含量有關。

葡萄籽原花青素提取物；糖尿??；血糖；抗氧化作用；炎癥因子

糖尿病是一種嚴重危害人類健康的內分泌代謝疾病，其并發(fā)癥已成為繼心腦血管疾病和腫瘤之后人類第三大致死原因[1]。目前糖尿病尚無有效根治方法，臨床上常用于糖尿病治療的西藥雖然對血糖有較好的控制，但毒副作用大。因此研究安全、有效的天然降糖活性成分用以開發(fā)降血糖藥物及功能食品具有重要意義。

葡萄籽原花青素（Grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）提取物是從葡萄籽中分離出的多酚類混合物，其具有抗氧化、清除自由基、調節(jié)血脂、抗腫瘤等作用[2]。近年有報道原花青素具有調節(jié)血糖的作用，為進一步研究GSPE的抗糖尿病作用及機制，本研究建立了2型糖尿病小鼠模型，觀察GSPE對糖尿病小鼠血糖、血脂、炎癥因子及抗氧化作用的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

昆明種小白鼠：雄性，體重（20±2）g，清潔級，由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK（川）2013-17。

1.1.2 主要試劑及藥品

葡萄籽原花青素提取物（純度大于95%）：陜西慧科植物開發(fā)有限公司；格列本脲（批號：20150330）：山西云鵬制藥有限公司；鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）（批號：617D031）：sigma公司；檸檬酸鈉；白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）試劑盒、C反應蛋白（C reactive protein，CRP）試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（Malonaldehyde，MDA）試劑盒、小鼠胰島素（Insulin，INS）試劑盒：上海嵐派生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

血糖儀（附加血糖試紙）：艾康生物技術有限公司；SpectraMax M3多功能讀板機：Molecular Devices公司；全自動生化分析儀：美國貝克曼DXC800；FC104型電子天平：上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型的制備及分組

將100只健康小鼠適應性普通飼料喂養(yǎng)1周后，隨機留取10只作為正常對照組動物繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)，其余90只小鼠高脂飼料（88%基礎飼料，10%豬油，1%膽固醇，1%膽酸鈉）喂養(yǎng)4周，禁食不禁水12 h后按90 mg/kg腹腔注射用0.1 mol檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液配成的濃度為12 mg/mL的STZ溶液。（0.1 mol檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液的配制：精密稱取檸檬酸2.1 g加入雙蒸水100 mL配成A液，精密稱取檸檬酸三鈉2.4 g加入雙蒸水100 mL配成B液，將A、B液按體積比1∶1混合，調pH值為4.4，混合后過濾取濾液即得。）上述小鼠經過一周自由飲食后，斷尾采血測定小鼠空腹血糖，選取血糖值大于11.1 mmol/L的小鼠作為糖尿病小鼠[4]。

將60只造模成功的糖尿病小鼠隨機分為5組，模型組，格列本脲組，GSPE高、中、低劑量組，每組12只。

1.2.2 給藥劑量及方法

從造模第7天開始每天灌胃（ig）給藥1次，連續(xù)給藥8周。正常對照組及模型對照組按10 mL/kg體重ig蒸餾水，格列本脲組按250 mg/kg體重ig給藥，GSPE高、中、低劑量組依次按（400、200、100 mg/kg體重）給藥。每隔1周稱量體重，根據體重調整給藥劑量。

1.2.3 觀察指標與方法

實驗期間每天觀察小鼠體態(tài)特征變化，記錄死亡率；分別于給藥的第0天、28天、56天于小鼠斷尾取血，用血糖儀測小鼠的空腹血糖值；給藥結束后，小鼠摘眼球取血，離心分離血清，用全自動生化分析儀測定血清中甘油三脂（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇的含量（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C），并按試劑盒方法測定IL-6、CRP、INS、MDA含量和SOD活性。取血后迅速處死動物，分離并取出胰腺，濾紙吸干水分后置于4%多聚甲醛中固定過夜，進行石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡觀察。

1.2.4 統(tǒng)計學處理定量指標

用Excel建立數(shù)據庫，用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據分析，定量資料采用±s表示，組間比較采用ANOVA檢驗，以P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

整個實驗期間，正常對照組小鼠飲食、飲水及活動行為正常。糖尿病小鼠造模成功后，明顯出現(xiàn)多飲、多食、多尿、消瘦等癥狀，并出現(xiàn)精神萎靡，皮毛粗糙，活動減少。灌胃給藥后，格列本脲組、GSPE組小鼠糖尿病癥狀緩解，一般狀況有所改善。

2.2 GSPE對實驗性糖尿病小鼠空腹血糖的影響

GSPE對實驗性糖尿病小鼠空腹血糖的影響見表1。

如表1所示，與正常組比較，模型組小鼠的空腹血糖明顯升高；與模型組比較，格列本脲組，GSPE高、中劑量組小鼠的空腹血糖顯著降低（P＜0.05）。結果表明，GSPE對STZ誘導的糖尿病小鼠具有降低血糖的作用，且降糖作用與給藥劑量有關。

表1 GSPE對STZ致糖尿病小鼠空腹血糖的影響Table 1Effect of GSPE on fasting blood glucose of STZ diabetic mice（±s）

表1 GSPE對STZ致糖尿病小鼠空腹血糖的影響Table 1Effect of GSPE on fasting blood glucose of STZ diabetic mice（±s）

注：-為蒸餾水；△與模型組比較P＜0.05。

血糖/（mmol/L）0 d28 d56 d正常-105.27±0.445.35±0.425.08±0.30模型-924.07±5.7523.40±5.6424.56±5.87格列本脲2501020.8±5.8219.49±5.4917.50±5.47△GSPE高4001023.75±3.9620.88±4.7418.11±6.06△GSPE中200922.83±6.0122.27±4.9219.34±7.33△GSPE低100821.54±4.0720.37±4.3319.81±3.02組別劑量/（mg/kg）動物數(shù)/只

2.3 GSPE對實驗性糖尿病小鼠INS的影響

GSPE對實驗性糖尿病小鼠INS的影響見表2。

表2 GSPE對STZ致糖尿病INS的影響Table 2Effect of GSPE on INS in STZ induced diabetic mice（±s）

表2 GSPE對STZ致糖尿病INS的影響Table 2Effect of GSPE on INS in STZ induced diabetic mice（±s）

注：-為蒸餾水；△與模型組比較P<0.05。

組別劑量/（mg/kg）動物數(shù)/只INS/（mu/mL）正常-109.96±1.8模型-93.00±0.97格列苯脲250107.06±1.48△GSPE高400105.87±1.04△GSPE中20095.01±2.07△GSPE低10083.53±1.50

如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠INS顯著下降（P<0.05），與模型組比較格列本脲組、GSPE高劑量組的小鼠的血清INS含量明顯增加（P<0.05），GSPE中劑量組INS含量增加但無顯著性差異。結果表明，GSPE可提高糖尿病小鼠血清的胰島素水平。

2.4 GSPE對實驗性糖尿病小鼠血脂的影響

GSPE對實驗性糖尿病小鼠血脂的影響見表3。

表3 GSPE對STZ致糖尿病小鼠血脂的影響Table 3Effect of GSPE on blood lipids of STZ diabetic mice（±s）

表3 GSPE對STZ致糖尿病小鼠血脂的影響Table 3Effect of GSPE on blood lipids of STZ diabetic mice（±s）

注：-為蒸餾水；△與模型組比較P＜0.05。

組別劑量/（mg/kg）動物數(shù)/只TG/（mmol/L）TC/（mmol/L）HDL-C/（mmol/L）LDL-C/（mmol/L）正常-101.17±0.262.64±0.323.05±0.450.84±0.10模型-92.32±0.184.29±0.342.23±0.341.22±0.21格列本脲250101.36±0.13△3.63±0.55△3.02±0.31△0.87±0.13△GSPE高400101.38±0.12△3.21±0.42△2.94±0.42△1.10±0.19 GSPE中20091.66±0.14△3.89±0.58△2.49±0.441.13±0.25 GSPE低10082.15±0.374.15±0.302.59±0.231.16±0.24

如表3所示，與正常組比較，模型組小鼠血清TG、TC、LDL-C含量顯著升高，而HDL-C含量顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，GSPE高劑量組、中劑量組及格列本脲組小鼠的血清TG、TC的含量顯著下降（P< 0.05），GSPE高劑量組及格列本脲組小鼠的血清HDLC含量顯著升高。結果表明，GSPE對糖尿病小鼠血脂具有一定促進恢復的作用。

2.5 GSPE對實驗性糖尿病小鼠IL-6、CRP的影響

GSPE對實驗性糖尿病小鼠IL-6、CRP的影響見表4。

表4 GSPE對STZ致糖尿病小鼠IL-6、CRP的影響Table 4Effect of GSPE on IL-6，CRP of STZ diabetic mice（±s）

表4 GSPE對STZ致糖尿病小鼠IL-6、CRP的影響Table 4Effect of GSPE on IL-6，CRP of STZ diabetic mice（±s）

注：-為蒸餾水；△與模型組比較P＜0.05。

組別劑量/（mg/kg）動物數(shù)/只IL-6/（pg/mL）CRP/（ng/mL）正常-1082.96±13.544.01±0.98模型-9124.83±20.6416.51±4.08格列本脲25010100.44±19.86△7.32±3.42△GSPE高40010105.45±9.84△10.27±3.47△GSPE中2009111.41±23.43△13.92±4.22△GSPE低1008117.81±12.1315.08±3.48

如表4所示，與正常組比較，模型組小鼠血清中IL-6、CRP的含量明顯升高（P＜0.05）。與模型組小鼠比較，格列本脲組和GSPE高、中劑量組小鼠的血清IL-6、CRP含量顯著降低（P＜0.05），結果表明，GSPE能降低糖尿病小鼠炎癥因子的含量。

2.6 GSPE對實驗性糖尿病小鼠SOD、MDA的影響

GSPE對實驗性糖尿病小鼠SOD、MDA的影響見表5。

表5 GSPE對STZ致糖尿病小鼠SOD、MDA的影響Table 5Effect of GSPE on SOD，MDA of STZ diabetic mice（±s）

表5 GSPE對STZ致糖尿病小鼠SOD、MDA的影響Table 5Effect of GSPE on SOD，MDA of STZ diabetic mice（±s）

注：-為蒸餾水；△與模型組比較P＜0.05。

組別劑量/（mg/kg）動物數(shù)/只SOD/（U/mL）MDA/（ng/mL）正常-101.90±0.3311.53±4.73模型-91.07±0.2720.47±4.08格列本脲250102.00±0.64△12.40±1.08△GSPE高400102.00±0.68△16.38±2.84△GSPE中20091.74±0.22△18.14±3.74 GSPE低10081.44±0.2020.17±4.48

如表5所示，與正常組相比，模型組小鼠血清的SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增加（P<0.05）。與模型組比較，格列本脲組、GSPE高劑量組和中劑量組的小鼠血清SOD活性與模型組相比顯著性增加（P< 0.05）；格列本脲組、GSPE高劑量組的小鼠血清MDA含量顯著性降低（P<0.05）。結果表明，GSPE對提高糖尿病小鼠機體的抗氧化能力有顯著性的意義。

2.7 胰腺形態(tài)學觀察

胰腺形態(tài)學觀察見圖1。

圖1 糖尿病小鼠胰臟組織病理切片（HE染色，400×）Fig.1Pathologys of pancreas the tissue of diabetic mice（HE staining，400×）

正常組小鼠的胰島形態(tài)和數(shù)目均大于糖尿病模型組，分布均勻、邊界清晰，與正常組小鼠比較，模型組小鼠胰島數(shù)目減少，形狀不規(guī)則，邊界不清，部分胰腺外分泌細胞破裂，胰島細胞與周圍組織混合，難以識別；GSPE高、中劑量組小鼠胰臟組織顯示出現(xiàn)好轉，小鼠胰島數(shù)目逐漸增多，形態(tài)逐漸恢復，并且逐漸恢復均勻分布，且這種改變與劑量呈正相關，典型圖片見圖1。說明GSPE對糖尿病小鼠損傷的胰島組織具有保護和修復作用。

3 結論與討論

合適的糖尿病模型是糖尿病研究的重要前提。利用STZ對胰島β細胞的選擇性破壞作用，本實驗通過高脂飼喂及對小鼠腹腔注射STZ使實驗動物產生糖尿病[3-4]，在STZ誘導小鼠糖尿病模型摸索過程中發(fā)現(xiàn)，STZ腹腔注射后需喂養(yǎng)一周，才能評價出是否造模成功，若喂養(yǎng)時間太短，小鼠的空腹血糖值還未能達到穩(wěn)定，此時評價造模成功率，容易造成漏判。

本實驗中，糖尿病小鼠與正常組比較，其血糖值顯著升高，血清INS減少，小鼠出現(xiàn)明顯的“三多一少”的癥狀，實驗結果顯示，GSPE能緩解小鼠糖尿病一般癥狀，且對STZ所致糖尿病小鼠有明顯的降血糖，提高血清INS水平的作用，提示GSPE的降血糖機制，可能與修復胰島受損β細胞，提升血清INS水平有關。

糖尿病患者大多存在脂代謝紊亂，特別是2型肥胖糖尿病患者[5-6]。本實驗結果顯示，GSPE可以顯著地降低糖尿病小鼠血清的甘油三脂、總膽固醇和升高高密度脂蛋白，表明GSPE能夠改善糖尿病小鼠的血脂水平。

炎癥因子在糖尿病的發(fā)生及發(fā)展過程中有著重要作用，現(xiàn)已證明一些炎癥因子包括TNF、IL-6、CRP等在多種組織中能影響血糖濃度[7]，炎癥因子與脂肪內分泌、氧化應激、免疫系統(tǒng)等相互作用而引起胰島素抵抗和β細胞結構和功能的障礙[8-9]。本實驗結果顯示，GSPE可降低血清中炎癥因子的含量，表明GSPE降低血糖作用可能與其降低炎癥分子含量緩解胰島細胞受到其攻擊有關。

糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機制復雜，有研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生機制可能與機體的氧化應激水平有關[10-11]。本實驗結果顯示，GSPE能夠提升糖尿病小鼠體內的SOD活性，降低MDA含量，表明GSPE可通過改善機體抗氧化系統(tǒng)的功能，清除機體氧自由基，進而預防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，與文獻結果相似[12]。

葡萄籽提取物原花青素對STZ所導致的糖尿病小鼠有明顯的降低血糖和改善血脂，修復胰臟病變組織的作用，其作用機制可能與其能提高糖尿病小鼠機體抗氧化能力、降低炎癥因子含量有關。

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Protective Effect of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Diabetic Mice Induced by Streptozotocin

WANG Fang1，WANG Jun1，HU Bo1，REN Mei-ping2，*
（1.Pharmacy College of Southwest Medical University，Luzhou 646000，Sichuan，China；2.Research Center for Drug and Functional Food of Southwest Medical University，Luzhou 646000，Sichuan，China）

To study the impact of grape seed extracton diabetic mice induced by Streptozotocin（STZ）.Diabetic mice model was induced by high fat diet combined with intraperitoneal injection of STZ in this paper.Diabetic mouse were randomly divided into model group，Glibenclamide group（250 mg/kg），GSPE high-dose group（400 mg/kg），middle-dose group（200 mg/kg）and low-dose group（100 mg/kg）.Fasting blood glucose was measured after continuous intragastric administration 8 weeks.Blood samples were taken out from the tail of diabetic mice to measure fasting blood glucose；then blood samples were taken out from the eyeball to measure the triglyceride（TG），total cholesterol（TC），high density lipoprotein cholesterol（HDL-C）and low density lipoprotein cholesterol（LDL-C）；IL-6 content，CRP content，activity of superoxide dismutase（SOD），INS content，MDA content were analyzed by using comercial kits.The experiments show that GSPE high and middle-dosegroup can significantly lower the blood glucose level in STZ induced diabetic mice；TG，TC in GSPE high and middle-dose group were lower than the model group significantly；HDL-C content in GSPE high-dose group was higher than the model group significantly（P<0.05）；IL-6、CRP content in GSPE high and middle-dose group were lower than the model group significantly；INS content in GSPE high-dose group was higher than the model group significantly（P<0.05）；SOD activity in GSPE high and middle-dose group was higher than the model group significantly（P<0.05），MDA content in GSPE high-dose group was lower than the model group significantly（P<0.05）；diabetic mice pancreatic tissue were repaired.In summary，the grape seed extract had a significant effect on reducing blood glucose，improving blood lipid level，repair of pancreatic tissue.The mechanism might be related to improving the antioxidant capacity and reducing the content of inflammatory factors in diabetic mice.

grape seed proanthocyanidin extract；diabetes；blood glucose；antioxidation；inflammatory

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.042

2016-11-30

四川省教育廳資助項目（14ZB0154）

王芳（1980—），女（漢），講師，碩士，從事藥物分析教學與科研。

*通信作者：任美萍（1978—），女（漢），副研究員，碩士，從事藥物研發(fā)。