唐 榮,張彩麗,孫博文,劉尊英

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

模擬常溫物流下大菱鲆菌相變化規(guī)律與優(yōu)勢(shì)腐敗菌鑒定

唐 榮,張彩麗,孫博文,劉尊英*

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

以大菱鲆為研究對(duì)象,將傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)基法和16S rDNA序列分析法相結(jié)合,并通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析,探索模擬常溫物流下大菱鲆的菌相變化規(guī)律及優(yōu)勢(shì)腐敗菌。結(jié)果表明:模擬常溫物流下,傳統(tǒng)分析與16S rDNA序列分析均表明,大菱鲆初始菌相與貯藏末期菌相明顯不同。經(jīng)16S rDNA序列、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建表明,大菱鲆末期菌相主要有氣單胞菌(Ameromonassp.)、腸桿菌(Enterobacteriaceaesp.)、紅桿菌(Rhodobacteraceaesp.)、發(fā)光桿菌(Photobacteriumsp.)、變形桿菌(Gammaproteobacteriasp.)、希瓦氏菌(Shewanellasp.)、擬桿菌(Bacteroidalessp.)和腈基降解菌(Nitriliruptoraceaesp.),其中氣單胞菌(Aeromonassp.)和腸桿菌中的檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)和哈夫尼氏菌(Hafniasp.)為大菱鲆模擬常溫物流下的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

大菱鲆,優(yōu)勢(shì)腐敗菌,16S rDNA,選擇性培養(yǎng)基

水產(chǎn)品在養(yǎng)殖、加工、貯藏等過(guò)程中容易受到物理、化學(xué)、微生物等因素的影響而腐敗變質(zhì)。其中,微生物生長(zhǎng)和代謝是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的主要原因。由于生長(zhǎng)環(huán)境、加工過(guò)程和貯藏過(guò)程的不同,優(yōu)勢(shì)腐敗菌能較好地生長(zhǎng)并逐漸占優(yōu)勢(shì),導(dǎo)致食品的腐敗[1-2]。因此優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)于預(yù)測(cè)產(chǎn)品貨架期、控制產(chǎn)品腐敗變質(zhì)具有重要作用。

大菱鲆(Psetta maxima)屬海底層肉食性的鲆鰈魚(yú)類(lèi)[3],1992年,我國(guó)開(kāi)始引進(jìn)并進(jìn)行了工廠化養(yǎng)殖[4]。大菱鲆膠質(zhì)蛋白含量高,味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富。近年來(lái)隨著大菱鲆產(chǎn)量的不斷增加,大菱鲆物流保鮮問(wèn)題日益突出。本文采用傳統(tǒng)分析法和16S rDNA序列分析相結(jié)合,探索模擬常溫物流下大菱鲆的菌相變化規(guī)律與優(yōu)勢(shì)腐敗菌,以期提高大菱鲆在貯藏過(guò)程中的品質(zhì),延長(zhǎng)大菱鲆的貨架期,為常溫物流、短途物流提供基礎(chǔ)性研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活大菱鲆 青島市南山水產(chǎn)市場(chǎng),單只重量(747±47) g,有水充氧快速運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室;假單胞菌、氣單胞菌與葡萄球菌選擇性培養(yǎng)基、鐵瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂 青島海博生物技術(shù)有限公司;2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、引物 27f、1492r、TANamp細(xì)菌基因組DNA提取盒、DL2000Marker 上海生物工程有限公司。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

LDZX-40型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ系列醫(yī)用型潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SHP-2500型低溫生化培養(yǎng)箱 上海精密宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;真空包裝機(jī) 諸城中佳食品包裝機(jī)械有限公司;A300基因擴(kuò)增儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司。

表2 各選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)條件

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大菱鲆的前處理 鮮活大菱鲆于低溫環(huán)境下切斷脊椎放血,去鰓去內(nèi)臟,用自來(lái)水沖洗血液與殘留物,置于0～4 ℃冷風(fēng)中瀝干后,真空包裝。將包裝好的大菱鲆置于泡沫箱(聚氨酯,隔熱系數(shù):0.024 W/M·K,34 cm×30 cm×14 cm)中,每個(gè)箱子中放兩條魚(yú),兩個(gè)冰袋(質(zhì)量為(428±11) g),按照冰-魚(yú)-魚(yú)-冰的方式排列,泡沫箱置于25±1 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貯藏50 h,于貯藏初期(0 h)和貯藏末期(50 h)取樣進(jìn)行細(xì)菌菌相檢測(cè)與鑒定,并每隔3～5 h用溫度計(jì)測(cè)量泡沫箱內(nèi)的溫度變化情況。

1.2.2 感官評(píng)價(jià) 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。由7名經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)培訓(xùn)的感官評(píng)價(jià)人員對(duì)大菱鲆的體表粘液、氣味、肌肉顏色、肌肉彈性、蒸煮后滋味、蒸煮后湯汁形態(tài)進(jìn)行打分,評(píng)分范圍為1～5分,其中1分代表品質(zhì)最差,5分代表品質(zhì)最好,3分代表感官可接受的臨界值。取平均分計(jì)入最后結(jié)果。

1.2.3 菌落總數(shù)、TVB-N值 菌落總數(shù)測(cè)定方法參照GB 47892-2010;TVB-N值測(cè)定方法參照SC/T 3032-2007。

1.2.4 大菱鲆菌相的選擇性培養(yǎng)基分析方法 稱(chēng)取大菱鲆背部肌肉25 g,置于225 mL生理鹽水中,用滅菌的打漿機(jī)均勻打碎,魚(yú)肉懸浮后,取下清液,10倍系列梯度稀釋后,用于各菌落計(jì)數(shù)。各選擇性培養(yǎng)基分別用于假單胞菌、乳酸菌、氣單胞菌、腸桿菌、葡萄球菌、霉菌酵母菌、菌落總數(shù)的測(cè)定,其具體培養(yǎng)條件如表2所示。

1.2.5 16S rDNA高通量測(cè)序分析 稱(chēng)取大菱鲆背部肌肉25 g,置于225 mL生理鹽水中,用滅菌的打漿機(jī)均勻打碎。打漿液經(jīng)4層滅菌紗布過(guò)濾后8000 r/min離心5 min,棄上清液。取100 mg沉淀物至2 mL離心管,加入200 μL溶菌酶,漩渦混合均勻后37 ℃水浴40 min。按照試劑盒步驟提取DNA,提取的DNA用于PCR擴(kuò)增和測(cè)序。

1.2.6 16S rDNA單一菌落測(cè)序分析 選取貯藏末期菌落數(shù)為30～300的平板,根據(jù)菌落基本形態(tài)特征將平板上的菌落分為若干組,并對(duì)每組進(jìn)行計(jì)數(shù)。經(jīng)平板純化、NB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后,離心獲得菌體沉淀用于DNA提取、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序。

1.2.7 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 登錄NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),將測(cè)序獲得的16S rDNA序列通過(guò)BLAST與基因庫(kù)中已有的序列進(jìn)行比對(duì)。選取基因庫(kù)中與測(cè)序片段比對(duì)結(jié)果相似度大于98%的序列,通過(guò)MEGA5.1進(jìn)行多重序列比對(duì),構(gòu)建Neighbor-Joining-analysis(近鄰結(jié)合法)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)的記錄,采用IBM SPSS Statistics 19軟件中的單因素ANOVA進(jìn)行顯著性差異(p<0.05)分析,采用Origin8.5軟件作圖,采用MEGA5.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬常溫物流下新鮮度指標(biāo)的測(cè)定

2.1.1 模擬常溫物流下溫度的變化 用溫度計(jì)對(duì)泡沫箱內(nèi)溫度的變化進(jìn)行監(jiān)控,溫度變化曲線如圖1所示。結(jié)果表明,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),溫度呈先升高然后平穩(wěn)最后又升高的趨勢(shì)。0 h為4 ℃,然后不斷升高,30 h達(dá)到18 ℃,平穩(wěn)一段時(shí)間后,54 h后繼續(xù)升高至室溫條件。

圖1 貯藏過(guò)程中溫度的變化Fig.1 The change of temperature during storage

2.1.2 模擬常溫物流下感官評(píng)分的變化 模擬常溫物流下的感官評(píng)分結(jié)果如圖2所示。根據(jù)感官評(píng)分結(jié)果可知,隨著時(shí)間延長(zhǎng),大菱鲆新鮮度逐漸下降,且呈現(xiàn)先緩慢后迅速的趨勢(shì)。大菱鲆在0、18、30 h時(shí)感官評(píng)分較高,新鮮度較好,三者之間沒(méi)有顯著性差異(p>0.05);42 h感官評(píng)分顯著降低(p<0.05),新鮮度有所下降;54 h感官評(píng)分進(jìn)一步降低,感官評(píng)分低于感官評(píng)分的臨界值。因此,選擇50 h作為感官可接受的終點(diǎn)。

圖2 貯藏過(guò)程中感官評(píng)分的變化Fig.2 The change of sensory score during storage注：標(biāo)注不同字母表示顯著差異(p<0.05)。

2.1.3 模擬常溫物流下菌落總數(shù)的變化 微生物是導(dǎo)致食品腐敗的主要原因[5],每年世界上有三分之一的食品腐敗是由于微生物的作用[6]。模擬常溫物流下菌落總數(shù)變化如圖3所示。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),菌落總數(shù)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。若以6 logCFU/g為水產(chǎn)品貨架期的標(biāo)準(zhǔn),則大菱鲆在50 h已達(dá)到6 logCFU/g,達(dá)到貨架期,這與2.1.2中的感官評(píng)分結(jié)果相一致。

圖3 貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)的變化Fig.3 The change of total viable counts during storage

2.1.4 模擬常溫物流下TVB-N值的變化 TVB-N值的增長(zhǎng)與多種因素有關(guān),如核酸和游離氨基酸的降解、微生物活動(dòng)、自溶反應(yīng)等[7]。模擬常溫物流下TVB-N值如圖4所示。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),TVB-N值與為微生物增長(zhǎng)趨勢(shì)一致。以20 mg/100 g 為水產(chǎn)品腐敗的標(biāo)準(zhǔn),則大菱鲆在50 h左右達(dá)到產(chǎn)品貨架期。

圖4 貯藏過(guò)程中TVB-N值的變化Fig.4 The change of TVB-N value during storage

總之,感官評(píng)分、菌落總數(shù)和TVB-N值結(jié)果均表明,大菱鲆在模擬常溫物流下50 h時(shí)達(dá)到貨架期的終點(diǎn)。因此選用貯藏50 h作為大菱鲆模擬常溫物流條件下的末期菌相(腐敗菌相)。

2.2 模擬常溫物流下大菱鲆的初始菌相與末期菌相

采用選擇性培養(yǎng)基分析大菱鲆貯藏過(guò)程的菌相變化,結(jié)果如圖5與圖6所示。貯藏初期,腸桿菌比例較高,占到了菌落總數(shù)的46.74%,乳酸菌占菌落總數(shù)的7.93%,其余四類(lèi)菌假單胞菌、氣單胞菌、霉菌酵母菌、葡萄球菌分別占菌落總數(shù)的不足1%。貯藏末期,腸桿菌的比例增長(zhǎng)到了69.6%,乳酸菌的種類(lèi)稍有下降,占菌落總數(shù)的6.83%,假單胞菌的比例增大,占菌落總數(shù)的16.19%,氣單胞菌的比例有所增加,占菌落總數(shù)的0.9%,其余菌的比例為6.48%。

圖5 大菱鲆貯藏初期菌相組成Fig.5 Bacterial flora composition in fresh turbot

圖6 大菱鲆貯藏末期菌相組成Fig. 6 Bacterial flora composition of turbot at the end of the storage

采用16S rDNA高通量測(cè)序分析大菱鲆貯藏過(guò)程的菌相變化,結(jié)果如表3所示。貯藏初期,腸桿菌、紅桿菌、氣單胞菌比例較高,分別占總數(shù)的50.51%、17.04%、和10.06%。其次是希瓦氏菌、腈基降解菌、擬桿菌和放線菌等;貯藏末期,菌相組成發(fā)生了明顯變化,氣單胞菌和腸桿菌比例較高,分別占總數(shù)的30.37%、28.50%。其次為紅桿菌、發(fā)光桿菌、變形桿菌、希瓦氏菌、擬桿菌和腈基降解菌等。

表3 大菱鲆貯藏過(guò)程中的菌相組成

比較選擇性培養(yǎng)與16S rDNA高通量測(cè)序的方法,在初始菌相中,兩種分析方法均表明腸桿菌占據(jù)優(yōu)勢(shì),分別占總數(shù)的46.74%和50.51%。貯藏末期,兩種方法的結(jié)果有一定的差異。選擇性培養(yǎng)中,腸桿菌和假單胞菌為優(yōu)勢(shì)菌,而16S rDNA高通量測(cè)序中氣單胞菌和腸桿菌比例較高。這些差異可能與傳統(tǒng)鑒定方法培養(yǎng)出的生物多樣性偏低,致使部分微生物不能夠檢測(cè)出有關(guān)[8]。

2.3 模擬常溫物流下大菱鲆優(yōu)勢(shì)腐敗菌鑒定

根據(jù)菌落基本形態(tài)特征,如:菌落大小、菌落顏色、菌落透明度、菌落隆起程度、菌落邊緣形態(tài)以及菌落光澤度等的不同,從貯藏末期的平板上共挑取26株菌。經(jīng)過(guò)分離純化擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。由圖7可知,PCR產(chǎn)物的電泳條帶清晰穩(wěn)定,重復(fù)性好,片段長(zhǎng)度約為1600 bp,可以用于16S rDNA的序列分析。

圖7 菌株的16S rDNA電泳圖譜Fig.7 Elevtrophoresis analysis of PCR amplified products of 16S rDNA gene fragments注：M為Maker DL2000,X1、X2、X3分別為 哈夫尼氏菌、檸檬酸桿菌、氣單胞菌。

通過(guò)16S rDNA序列分析表明,模擬常溫物流下,大菱鲆的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為氣單胞菌和腸桿菌,分別占到了腐敗末期菌落總數(shù)的30.37%、28.50%(表3)。其中腸桿菌經(jīng)進(jìn)一步分析,主要菌為檸檬酸桿菌和哈夫尼氏菌,分別占腸桿菌的53%和38%(表4)。

表4 大菱鲆優(yōu)勢(shì)腐敗菌腸桿菌組成

2.4 大菱鲆優(yōu)勢(shì)腐敗菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

研究認(rèn)為,同源性≥98%即可認(rèn)為是同一菌種[9]。由圖8可以看出,X1菌株和吉林檸檬酸桿菌(Citrobacter gillenii)(登錄號(hào):KM515970.1)的同源性最高,可以達(dá)到98%,說(shuō)明X1與吉林檸檬酸桿菌親緣關(guān)系最近;X2菌株與蜂窩哈夫尼氏菌(Hafnia alvei genomosp.2)(登錄號(hào):FM179944.1)同源性最高,可以達(dá)到96%,說(shuō)明X2與蜂窩哈夫尼氏菌親緣關(guān)系最近;X3菌株與溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)(登錄號(hào):JN555613.1)同源性最高,可以達(dá)到99%,說(shuō)明X3菌株與溫和氣單胞菌親緣關(guān)系最近。說(shuō)明模擬常溫物流下大菱鲆的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為氣單胞菌、檸檬酸桿菌和哈夫尼氏菌。

圖8 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

本研究中的大菱鲆的腐敗菌主要為氣單胞菌、檸檬酸桿菌和哈夫尼氏菌,這與前人在低溫條件下研究的海水魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌有所差別。蔣慧亮等[10]研究表明,大菱鲆在0 ℃與25 ℃條件下優(yōu)勢(shì)腐敗菌分別為假單胞菌與腐敗希瓦氏菌。Gram等[11]認(rèn)為冷藏條件下海水魚(yú)、氣調(diào)或者真空包裝魚(yú)及淡水魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌分別為腐敗希瓦氏菌、發(fā)光桿菌和假單胞菌。Surendran等[12]認(rèn)為相比于溫帶水域細(xì)菌組成,熱帶魚(yú)類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性菌與腸桿菌含量偏高。鄭振霄等[13]研究表明,冷水魚(yú)冷藏過(guò)程中,希瓦氏菌屬與腸桿菌屬在腐敗過(guò)程中占主導(dǎo)地位。本研究結(jié)果與這些研究差異的原因可能與貯藏原料不同與貯藏條件不同有關(guān)。

3 結(jié)論

模擬常溫物流過(guò)程中,泡沫箱加冰環(huán)境的溫度從0 h的4 ℃逐漸上升到30 h的18 ℃,30 h至50 h貯藏末期溫度保持平穩(wěn);結(jié)合傳統(tǒng)分析與16S rDNA序列分析的結(jié)果,最終確定模擬常溫物流下大菱鲆的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為氣單胞菌、檸檬酸桿菌和哈夫尼氏菌。

[1]Dalgarrd P. Qualitative and quantitative characterization of spoilage bacteria from packed fish[J]. Int. J. Food Microbiol,1995(26):319-333.

[2]Ozogul Y,Ozyurt G,Ozogul F,et al. Freshness assessment of European eel(Anguilla anguilla)by sensory,chemical and microbiological methods[J]. Food Chem,2005(92):745-751.

[3]杜佳垠. 世界大菱鲆Scophthalmus maximus(Linnaeus)養(yǎng)殖現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代漁業(yè)信息,2001(2):9-11.

[4]雷霽霖,劉新富,關(guān)長(zhǎng)濤.中國(guó)大菱鲆養(yǎng)殖20年成就和展望-慶祝大菱鲆引進(jìn)中國(guó)20周年[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展,2012(3):123-128.

[5]Mahmoud B,Yamazaki K,Miyashita K,et al. A new technology for fish preservation by combined treatment with electrolyzed NaCl solutions and essential oil compounds[J]. Food Chem,2006,99(4):656-662.

[6]Li T,Li J,Hu W,et al. Quality enhancement in refrigerated red drum(Sciaenops ocellatus)fillets using chitosan coatings containing natural preservatives[J]. Food Chem,2013,138(2-3):821-826.

[7]Hong H,Luo Y,Zhou Z,et al. Effects of low concentration of salt and sucrose on the quality of bighead carp(Aristichthys nobilis)fillets stored at 4 ℃[J]. Food Chem,2012,133(1):102-107.

[8]Fontana C,Sandro CP,Vignolo G. Monitoring the bacterial population dynamics during fermentation of artisanal Argentinean sausages[J]. Int. J. Food Microbiol,2005(103):131-142.

[9]謝麗丹,李蕾蕾,王素英,等. 冰溫貯藏中南美白對(duì)蝦特定腐敗菌的分離鑒定及其腐敗能力分析[J]. 食品工業(yè)科技,2016，37(5):171-176.

[10]蔣慧亮,郭全友,楊憲時(shí),等. 大菱鲆0、25 ℃貯藏的鮮度變化和貨架期[J]. 海洋漁業(yè),2011(4):447-454.

[11]Gram L,Dalgaard P. Fish spoilage bacteria--problems and solutions[J]. Curr. Opin. Biotechnol,2002(13):262-266.

[12]Surendran PK,Joseph J,Shenoy AV,et al. Studies on spoilage of commercially important tropical fishes under iced storage[J].Fish. Res.,1989(7):1-9.

[13]鄭振霄,周聃,馮俊麗,等. 冷海水保藏下鮐魚(yú)菌相變化規(guī)律及優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定[J]. 現(xiàn)代食品科技,2016,32(4):81-86.

Changes of bacterial flora composition and identification of the dominant spoilage bacteria in turbot under simulated of room temperature logistics

TANG Rong,ZHANG Cai-li,SUN Bo-wen,LIU Zun-ying*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Turbots stored under simulated of room temperature logistics were studied in this essay. Selective medium method and 16S rDNA sequence analysis technology were used to study the change of bacterial flora composition in turbot during simulated of room temperature logistics. The results showed that the micro flora composition of turbot were different before and after storage. The 16S rDNA analysis,NCBI database and phylogenetic tree showed that the micro flora composition wereAmeromonassp.、Enterobacteriaceaesp.、Rhodobacteraceaesp.、Photobacteriumsp.、Gammaproteobacteriasp.、Shewanellasp.、Bacteroidalessp.andNitriliruptoraceaesp.. The dominant spoilage bacteria of turbot stored in simulated of room temperature logistics wereAeromonassp.、Citrobactersp.andHafniasp..

Turbot;dominant spoilage organism;16S rDNA;selective medium

2016-07-12

唐榮(1992-),女,碩士生,研究方向：水產(chǎn)品高值化利用,E-mail:956336816@qq.com。

*通訊作者:劉尊英(1974-),女,博士,副教授,研究方向：水產(chǎn)品保鮮與加工,E-mail:naturefoods@163.com。

國(guó)家科技型中小企業(yè)科技技術(shù)創(chuàng)新基金(14C26213712172)。

TS254.4

A

1002-0306(2017)05-0334-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.055