蔣美麗，久保輝幸(日)，王正裔，郭 嘉

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430073)

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取金銀花中綠原酸

蔣美麗，久保輝幸(日)，王正裔，郭 嘉*

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430073)

采用超聲輔助乙醇從金銀花中提取綠原酸，通過單因素實(shí)驗(yàn)考察pH值、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件。確定最佳工藝條件為：pH值5.2、提取時(shí)間21 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)63%、料液比1∶13.5(g∶mL)。在該優(yōu)化條件下，綠原酸的提取率達(dá)到10.862%。

金銀花；綠原酸；響應(yīng)面法；超聲輔助提取

金銀花(Lonicera japonica)為忍冬科植物，在我國(guó)分布廣泛，具有較高的藥用價(jià)值[1-2]。綠原酸具有殺菌、抗病毒等作用，廣泛用于醫(yī)藥、保健、化工和食品等領(lǐng)域[3-5]。采用超聲波法提取金銀花中的綠原酸，不僅可以縮短提取時(shí)間，還能提高提取率[6-7]。響應(yīng)面法(responsesurfacemethodology，RSM)是采用Design-Export優(yōu)化軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，用多元二次回歸方程近似擬合實(shí)驗(yàn)中的多因素與指標(biāo)之間的相互關(guān)系[8]，獲得最優(yōu)條件。商小金等[9]通過響應(yīng)面法對(duì)中藥延胡索中生物堿的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得較好的效果。作者采用超聲輔助乙醇提取金銀花中的綠原酸，采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

金銀花，河南省密縣。

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、蒸餾水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.2 方法

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱量5mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品放入50mL容量瓶中，加70%乙醇定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL標(biāo)準(zhǔn)溶液置于25mL容量瓶中，加70%乙醇定容，配制成不同濃度的系列綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用紫外分光光度計(jì)在200～400nm范圍內(nèi)掃描，測(cè)出綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)為328nm。在328nm波長(zhǎng)處測(cè)定系列綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)、濃度c為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 綠原酸提取率的計(jì)算

根據(jù)下式計(jì)算綠原酸的提取率：

式中：c為綠原酸濃度，μg·mL-1；V為樣液體積，mL；n為提取液的稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

將金銀花打磨成粗粉。準(zhǔn)確稱取2.5 g金銀花粗粉置于250 mL錐形瓶中，加入適量一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液。將錐形瓶置于超聲波清洗器中提取綠原酸，抽濾，收集濾液，測(cè)定綠原酸含量。

分別取pH值3～8、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%～90%、料液比1∶(6～14)(g∶mL，下同)以及提取時(shí)間10～50 min進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇影響綠原酸提取效果比較顯著的4個(gè)因素：pH值、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間為考察對(duì)象，以綠原酸提取率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，其因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of RSM experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)

根據(jù)圖1擬合綠原酸的回歸方程：A=0.03187c-0.01272(R2=0.99905)，綠原酸的吸光度在4～24μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。

圖1 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 pH值的影響(圖2)

圖2 pH值對(duì)綠原酸提取率的影響

由圖2可知，綠原酸的提取率隨著pH值的增大先升高后降低，在pH值為5時(shí)提取率最高。這是因?yàn)?，在堿性條件下綠原酸發(fā)生了水解，導(dǎo)致提取率降低。因此，pH值取5較適宜。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響(圖3)

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響

由圖3可知，綠原酸提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先升高后降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)提取率最高。這是因?yàn)?，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)金銀花中有效成分的解析能力不同，過高會(huì)增加醇溶性雜質(zhì)的溶出，過低會(huì)減少綠原酸的溶出。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)取70%較適宜。該結(jié)論與肖卓炳等[10]的結(jié)論一致。

2.2.3 料液比的影響(圖4)

圖4 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響

由圖4可知，隨著料液比的減小(即溶劑量的增加)，綠原酸的提取率逐漸升高；當(dāng)料液比為1∶12時(shí)，提取率達(dá)到最高；繼續(xù)減小料液比，綠原酸的提取率反而下降。這是由于，在相同的超聲加熱時(shí)間內(nèi)，體系的溶劑量大，溫度就比較低，影響溶質(zhì)在溶劑中的擴(kuò)散，提取率降低。因此，料液比取1∶12較適宜。

2.2.4 提取時(shí)間的影響(圖5)

圖5 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

由圖5可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，綠原酸的提取率先升高后降低，在30 min時(shí)達(dá)到最高。這是因?yàn)椋S著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液中的雜質(zhì)會(huì)大量增多，綠原酸的提取率降低。因此，提取時(shí)間取30 min較適宜。

2.3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，共進(jìn)行29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of RSM experiment

2.3.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析(表3)

表3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析

Tab.3Variance analysis of RSM results

注：*表示差異在0.05水平上顯著；**表示差異在0.001水平上非常顯著。

從表3可知，模型的P<0.0001，說明回歸方程非常顯著；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9653，表明實(shí)驗(yàn)中96.53%的數(shù)據(jù)是合理的；失擬項(xiàng)F=1.44、P=0.3862，大于0.01不顯著，表明方程具有很好的模擬性；變異系數(shù)0.52%小于10%，表明該模型的可信度和精確度高；方程的精密度等于21.643，大于4視為合理[11]，所以此模型是合理的，適應(yīng)性較好，可以用于該實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 響應(yīng)面圖分析

根據(jù)二元回歸方程生成等高線圖和三維響應(yīng)面曲線，各因素之間的交互作用可以被直觀反映，見圖6～圖9。

從圖6、8、9中可以看出，X1X2、X1X4、X2X3之間的交互作用不明顯。從圖7可以看出，等高線中心呈橢圓形，則X1X3之間的交互作用較明顯。該實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)面圖均開口向下，4個(gè)制約因素和提取率呈拋物線關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)出現(xiàn)最大值。采用軟件優(yōu)化，獲得最佳實(shí)驗(yàn)條件：pH值5.22、提取時(shí)間21.28 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)62.90%、料液比1∶13.55，綠原酸提取率的理論預(yù)測(cè)值為10.858%。

2.4 響應(yīng)面驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

考慮到實(shí)際操作，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)將最佳條件修正為：pH值5.2、提取時(shí)間21 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)63%、料液比1∶13.5。利用修正后的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，綠原酸平均提取率為10.862%，和理論預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.037%，差異不顯著，表明響應(yīng)面法確定的實(shí)驗(yàn)條件是穩(wěn)定可行的。

圖6 pH值和料液比對(duì)綠原酸提取率的交互影響

圖7 pH值和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的交互影響

圖8 pH值和提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的交互影響

圖9 料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的交互影響

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)確定金銀花中綠原酸超聲輔助提取的最佳工藝條件為：pH值5.2、提取時(shí)間21 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)63%、料液比1∶13.5(g∶mL)。在該條件下綠原酸的提取率達(dá)到10.862%。該優(yōu)化工藝模型準(zhǔn)確可靠，提取率較高，具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

[1] 韋藤幼,趙群莉,阮莉姣.微波預(yù)處理法提取金銀花中的綠原酸[J].中成藥,2003,25(7):534-537.

[2] 藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010：177.

[3] 王輝,田呈瑞,馬守磊,等.綠原酸的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2009,30(5):341-345.

[4] JIANG Y，KUSAMA K，SATOH K，et al.Induction of cytotoxicity by chlorogenic acid in human oral tumor celllines[J].Phytomedicine，2000，7(6)：483-491.

[5] DU F Y，XIAO X X，LUO X J，et al.Application of ionic liquids in the microwave-assisted extraction of polyphenolic compounds from medicinal plants[J].Talanta，2009，78(3)：1177-1184.

[6] 單磊,達(dá)超超,呼延曉穎,等.金銀花中綠原酸提取工藝研究[J].飲料工業(yè),2010,13(4):23-25.

[7] 李萍.超聲輔助提取金銀花中綠原酸的工藝研究[J].口腔護(hù)理用品工業(yè),2010,20(5)：20-22.

[8] MASON R L，GUNST R F，HESS J L.Statistical Design and Analysis of Experiments:with Applications to Engineering and Science[M].John Wiley & Sons，2003.

[9] 商小金,錢俊青,郭輝.響應(yīng)面法優(yōu)化延胡索生物堿乙醇提取工藝研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2010，30(2):32-36.

[10] 肖卓炳,郭瑞軻,郭滿滿,等.金銀花中綠原酸超聲微波雙輔助提取工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué),2012,33(22)：111-114.

[11] 李莉,張賽,何強(qiáng),等.響應(yīng)面法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化中的應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2015,34(8):41-45.

Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Chlorogenic Acid fromLoniceraJaponicaby Response Surface Methodology

JIANG Mei-li，Teruyuki KUBO (Japan)，WANG Zheng-yi，GUO Jia*

(KeyLaboratoryforGreenChemicalProcessofMinistryofEducation，SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy，WuhanInstituteofTechnology，Wuhan430073，China)

ChlorogenicacidfromLonicera japonicawasextractedusingultrasonic-assistedethanol.TheeffectsofpHvalue，solid-liquidratio，ethanolvolumefractionandextractiontimeontheextractionrateofchlorogenicacidwasdiscussedbyasinglefactorexperiment，andtheextractionconditionswereoptimizedbyresponsesurfacemethodology.Theoptimumconditionswereasfollows:pHvalue5.2，extractiontime21min，ethanolvolumefraction63%，solid-liquidratio1∶13.5(g∶mL).Undertheoptimumconditions，theextractionrateofchlorogenicacidreached10.862%.

Lonicera japonica；chlorogenicacid；responsesurfacemethodology；ultrasonic-assistedextraction

教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”(NCET-05-0681)，武漢工程大學(xué)第10期大學(xué)生校長(zhǎng)基金資助項(xiàng)目(2015017)

2016-10-26

蔣美麗(1990-)，女，河南永城人，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物分離與提??；

郭嘉，湖北省“楚天學(xué)者”計(jì)劃特聘教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：guojia@wit.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.03.009

TQ461 R284.2

A

1672-5425(2017)03-0035-05

蔣美麗，久保輝幸(日)，王正裔，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取金銀花中綠原酸[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(3)：35-39，44.