吳潔平

【摘要】 目的 建立一種測(cè)定血清中1， 5-脫水葡萄糖醇（1， 5-AG）的方法， 輔助診斷糖尿病。方法 糖尿病患者（糖尿病組）與健康體檢人員（健康對(duì)照組）各100例， 采用葡萄糖激酶去除血清樣品內(nèi)源葡萄糖干擾， 過氧化氫（H2O2）在4-氨基替比林（4-AAP）、過氧化物酶（POD）的存在下， 可生成紅色醌亞胺化合物， 發(fā)生顯色反應(yīng)進(jìn)行比色測(cè)定。結(jié)果 該方法最低檢測(cè)限為1.98 μmol/L， 1， 5-脫水葡萄糖醇在663 μmol/L以內(nèi)線性良好。測(cè)定100例糖尿病組患者血清1， 5-脫水葡萄糖醇含量為（30.7±16.4）μmol/L， 顯著低于健康對(duì)照組的（170.6±48.2）μmol/L， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 該法簡便快速、靈敏、準(zhǔn)確和穩(wěn)定、特異， 可用于糖尿病的及時(shí)診斷與監(jiān)控， 適合于各類實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 葡糖激酶；糖尿??；1， 5-脫水葡萄糖醇

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.33.045

Determination of serum 1， 5-anhydroglucitol holoenzyme in 100 diabetes mellitus patients in Benxi city WU Jie-ping. Benxi City Sixth Peoples Hospital， Benxi 117002， China

【Abstract】 Objective To establish determination method for serum 1， 5-anhydroglucitol holoenzyme （1， 5-AG） to assist diagnosis of diabetes mellitus. Methods There were diabetes mellitus patients （diabetes mellitus group） and healthy people （healthy control group）， with 100 cases in each group. Glucokinase was applied to eliminate interference by glucose in serum samples. Chromogenic reaction of by hydrogen peroxide （H2O2） generating red quinone-imine compound in 4-amino-antipyrine （4-AAP） and peroxidase （POD） were used in colorimetric determination. Results The lowest detectable limit of this method was 1.98 μmol/L， and 1， 5-anhydroglucitol holoenzyme showed good linearity within 663 μmol/L. Serum 1， 5-anhydroglucitol holoenzyme content was （30.7±16.4） μmol/L in 100 diabetes mellitus patients， which were obviously lower than （170.6±48.2） μmol/L in the control group， and their difference had statistical significance （P<0.05）. Conclusion As an easy， convenient， sensible， accurate， stable and specific method， it can be applied in timely diagnosis and monitoring of diabetes mellitus. This method is suitable for laboratory conventional application.

【Key words】 Glucokinase； Diabetes mellitus； 1， 5-anhydroglucitol

糖尿病是影響人類健康的代謝性疾病， 血清1， 5-脫水葡萄糖醇是一種存在于血液中的多元醇， 其含量在多元醇糖類物質(zhì)中僅次于葡萄糖。血清1， 5-脫水葡萄糖醇的實(shí)驗(yàn)室檢查對(duì)糖尿病的診斷分型以及療效監(jiān)測(cè)都有重要意義。本文旨在探討1， 5-脫水葡萄糖醇在糖尿病中的輔助診斷價(jià)值[1]。該檢測(cè)項(xiàng)目是繼糖化血紅蛋白之后又一頗具前景的糖尿病監(jiān)測(cè)指標(biāo)。目前國外研究較多， 有些發(fā)達(dá)國家列為常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目， 而國內(nèi)研究甚少?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 試劑與標(biāo)準(zhǔn)液 檢測(cè)1， 5-脫水葡萄糖醇的試劑：辣根過氧化物酶（HRP）10 kU， 3-羥基-2、4、6-三碘苯甲酸4.5 mmol。N-2-羥乙基哌嗪N′-2-乙烷磺酸溶液80 kU ； 1， 5脫水葡萄糖醇標(biāo)準(zhǔn)液：4.5 μmol/L ， 1， 5-脫水葡萄糖醇標(biāo)準(zhǔn)液由山東三維公司生產(chǎn)。

1. 2 儀器 貝克曼奧林巴斯型全自動(dòng)生化分析儀；UV-2600型分光光度計(jì)由島津公司生產(chǎn)。

1. 3 血清標(biāo)本 糖尿病組100例患者（1型糖尿病患者21例， 2型糖尿病患者79例）， 均符合1985年WHO糖尿病分類及診斷標(biāo)準(zhǔn)， 其中男60例， 女40例， 年齡17～78歲。病程2個(gè)月～25年。健康對(duì)照組100例， 其中男53例， 女47例。年齡10～70歲， 其中10～29歲38例， 30～49歲32例， 50～70歲

30例。肝功能、腎功能均正常， 空腹血糖（FBG）、果糖胺（FA）， 無既往糖尿病史。

1. 4 方法

1. 4. 1 原理 首先去除葡萄糖的干擾作用：采用葡萄糖激酶處理血清， 經(jīng)由葡萄糖激酶（GK）和丙酮酸激酶（PK）偶聯(lián)系統(tǒng)使血清中葡萄糖徹底轉(zhuǎn)化為不與吡喃糖氧化酶（PROD）反應(yīng)的6-磷酸葡萄糖。然后加檢測(cè)試劑（見上文）， 其中的被測(cè)1， 5-AG氧化成1， 5-脫水果糖和H2O2， 在H2O2在4-AAP、POD的存在下， 可生成紅色醌亞胺化合物， 發(fā)生顯色反應(yīng)進(jìn)行比色測(cè)定[2]。

1. 4. 2 參數(shù)設(shè)置 定標(biāo)液O濃度（蒸餾水）和304.5 μmol/L 1， 5-脫水葡萄糖醇。主波長545 nm， 次波長710 nm， 兩點(diǎn)終點(diǎn)法， 溫度37℃， 樣品量10 μl， （試劑1）200 μl， 反應(yīng)5 min、（試劑2） 110 μl， 反應(yīng)6 min， 讀取18和30點(diǎn)吸光度（A）。

1. 4. 3 分光光度計(jì)手工測(cè)試 空白管調(diào)零， 波長546 nm。樣品和試劑量按比例增減。讀取各管A。計(jì)算1， 5-AG（μmol/L）濃度=（測(cè)定管A/標(biāo)準(zhǔn)管A）×304.5。

1. 4. 4 干擾試驗(yàn)對(duì)照方法 ①血糖（BG）測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法。②糖化血紅蛋白（HbA1c）測(cè)定采用微柱親和層析法。③FA測(cè)定采用化學(xué)比色法。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2. 1 反應(yīng)動(dòng)力曲線 對(duì)蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)液及樣品的測(cè)定結(jié)果表明：呈一條靠近橫軸的基本平坦曲線， 蒸餾水空白加試劑1和吸光度A無大變化。標(biāo)準(zhǔn)液和樣品加入后反應(yīng)過程相同， 只是加入試劑2后顯色急劇增加， 監(jiān)測(cè)至25點(diǎn)時(shí)顯色達(dá)頂點(diǎn)。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的零濃度標(biāo)準(zhǔn)（蒸餾水）重復(fù)測(cè)定20次， 求出平均數(shù)， 再加上3 s， 對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的1， 5-AG濃度為最低檢測(cè)限， 即1.98 μmol/L。與文獻(xiàn)報(bào)道[3]接近。

2. 2 線性與最低檢測(cè)限 G10膠聯(lián)葡聚糖凝膠電泳1份健康人混合血清， （反復(fù)測(cè)得1， 5脫水葡萄糖醇為1.4 μmol/L）一分為二， 1份內(nèi)加入1， 5脫水葡萄糖醇標(biāo)準(zhǔn)物， 混勻后反復(fù)測(cè)定1， 5脫水葡萄糖醇為663 μmol/L。再用另一份混合血清作基樣將其稀釋成不同濃度（39、77、254、443、663 μmol/L）， 用本法連續(xù)作1， 5-AG定標(biāo)5次， 生化分析儀自動(dòng)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線， 回歸方程（X為濃度， Y為平均吸光度）為Y=（4.72×10-4）X+0.01555， r=0.9996。結(jié)果顯示在663 μmol/L以內(nèi)線性符合要求。

2. 3 精密度實(shí)驗(yàn) 連續(xù)測(cè)定20 d。取各種濃度混合血清各1份， 做批內(nèi)和批間精密度實(shí)驗(yàn)。變異系數(shù)（CV）≤5%， 實(shí)驗(yàn)精密度相關(guān)性要求。

2. 4 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 按回收試驗(yàn)的方法進(jìn)行操作， 得到平均回收率為99.8%。符合實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度相關(guān)性要求[4]。

2. 5 特異性 ①糖類干擾試驗(yàn)：取健康人混合血清1份， 再分別加入生理鹽水、10 g/L葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇及2.5 g/L麥芽糖溶液0.1 ml， 按本法測(cè)得基礎(chǔ)管1， 5-AG為223 μmol/L， 其余各管結(jié)果依次為237、233、223、228、224、231及240 μmol/L。干擾率≤±5%為允許誤差， 上述干擾物濃度不影響本法。②脂類及血紅蛋白（Hb）干擾物試驗(yàn)：受檢人群血清中甘油三酯（TG）≤5.9 mmol/L， Hb≤3.4 g/L時(shí)都不會(huì)影響1， 5-AG測(cè)定結(jié)果。③膽紅素（Bil）干擾試驗(yàn)：干擾率為-2.8%， 提示受檢人群上述膽紅素濃度存不影響1， 5-AG測(cè)定。④飲食物的干擾試驗(yàn)： 健康人空腹與餐后2 h1， 5-AG、BG、FA及HbA1c結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示1， 5-AG測(cè)定不受即時(shí)進(jìn)食。

2. 6 正常參考值 用本法對(duì)100例健康對(duì)照組測(cè)得1， 5-AG為（170.6±48.2）μmol/L， 呈正態(tài)分布。男女比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義意義（t=0.41， P>0.05）；各年齡段比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2. 7 糖尿病患者的檢測(cè)結(jié)果 100例糖尿病組患者血清1， 5-AG濃度為（30.7±16.4）μmol/L， 顯著低于健康對(duì)照組的（170.6±48.2）μmol/L（P<0.05）。若以健康組結(jié)果的95%界限

（ x-±1.96 s）為參考范圍， 取1， 5-AG下限（76.1 μmol/L）， HbA1c （7.24%）和FA（2.3 mmol/L）的上限及FBG（>6.66 mmol/L）作為診斷糖尿病的臨界值， 則對(duì)糖尿病診斷的敏感性分別為95.8%（46/48）。與文獻(xiàn)報(bào)道[5-12]接近。

3 小結(jié)

該法簡便快速、靈敏、準(zhǔn)確和穩(wěn)定、特異， 可用于糖尿病的及時(shí)診斷與監(jiān)控， 適合于各類實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用。

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[收稿日期：2016-11-14]