李明璐，鄒本革，畢可東，徐 玉

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東萊陽 265200；）

替米考星長效混懸劑的研制與質(zhì)量評價

李明璐1，鄒本革2，畢可東1，徐 玉1

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東萊陽 265200；）

[目的]利用現(xiàn)代緩釋技術(shù)，以替米考星為原料藥，研制出溶解度較高、療效強(qiáng)、可減少給藥次數(shù)的替米考星長效混懸劑，并對其進(jìn)行質(zhì)量評價，為該藥的批量生產(chǎn)提供可靠依據(jù)。[方法]通過正交優(yōu)化法選擇最優(yōu)處方，并對最優(yōu)處方進(jìn)行含量測定試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)和藥動學(xué)試驗(yàn)。[結(jié)果]替米考星長效混懸劑最佳處方為：替米考星原料藥2.5g/100 mL，有機(jī)溶媒（1，2-丙二醇:乙醇=9:1）占比65%，潤濕劑（吐溫-80）0.3%，助懸劑（羥丙甲纖維素）5%，抗氧劑（無水亞硫酸鈉）0.03%；含量測定結(jié)果為合格；影響因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)替米考星長效混懸劑對高溫和強(qiáng)光照敏感，對濕度不敏感；加速試驗(yàn)和長期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)替米考星長效混懸劑穩(wěn)定性良好；藥動學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)替米考星長效混懸劑和實(shí)驗(yàn)室自制替米考星溶液的AUC分別為43.164 9 μg·h·mL-1和26.206 5 μg·h·mL-1，替米考星長效混懸劑的相對生物利用度為164.71%。[結(jié)論]本試驗(yàn)制得的替米考星長效混懸劑含量合格、穩(wěn)定性良好、相對生物利用度高，可以批量生產(chǎn)，用于大型養(yǎng)殖場的大規(guī)模給藥。

替米考星；混懸劑；含量；穩(wěn)定性；藥動學(xué)；生物利用度

替米考星是由泰樂菌素半合成的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其抗菌活性強(qiáng)，主要作用于革蘭氏陽性菌，對某些革蘭氏陰性菌、支原體等也有效。替米考星對胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、畜禽支原體的抗菌活性高，被廣泛應(yīng)用于由敏感菌引起的畜禽肺炎和乳房炎[1-3]。替米考星味極苦，限制了其在預(yù)混劑和飲水劑方面的應(yīng)用，而普通注射液又需要大量的人力頻繁給藥，不便于大規(guī)模養(yǎng)殖場的使用。故本試驗(yàn)利用現(xiàn)代緩釋技術(shù)，以替米考星為原料藥，研制出溶解度較高、療效強(qiáng)、可減少給藥次數(shù)的替米考星制劑。

我國在獸藥長效制劑方面的研究起步較晚，目前主要有口服緩釋制劑、注射用緩釋制劑、透皮緩釋制劑、植入緩釋制劑及其他固體分散體、脂質(zhì)體、微球、微囊等[4-9]?？紤]到替米考星的理化性質(zhì)及注射用緩釋制劑生物利用度高、毒性低、給藥方便、起效快等因素，本試驗(yàn)決定制備一種替米考星長效混懸劑。

1 材料

1.1 試驗(yàn)儀器

LC-1000高效液相色譜儀，山東魯南瑞紅化工儀器有限公司生產(chǎn)；KQ5200E超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司生產(chǎn)；DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；BCM-100型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；YP-250GSP綜合穩(wěn)定性試驗(yàn)箱，上海邁捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)藥品

替 米 考 星 原 料 藥（96.3%）， 批 號A20130401，山東齊魯制藥有限公司產(chǎn)品；1,2-丙二醇，批號20141130，天津市博迪化工有限公司產(chǎn)品；無水乙醇，批號20141201，青島愛得旺化工科技有限公司產(chǎn)品；吐溫-80，批號20150302，青島愛得旺化工科技有限公司產(chǎn)品；羥丙甲纖維素，批號20140822，青島愛得旺化工科技有限公司產(chǎn)品；無水亞硫酸鈉，批號20140707，天津市巴斯夫化工有限公司產(chǎn)品；注射用水，批號20150610，實(shí)驗(yàn)室自制；普通營養(yǎng)瓊脂，批號20140701，北京陸橋技術(shù)有限公司產(chǎn)品；0.9%氯化鈉溶液，批號20141118，青島愛得旺化工科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)動物

12只體重（4±0.5）kg的成年健康中華田園犬，雌雄各半，購自青島市城陽區(qū)動物市場。試驗(yàn)過程飼喂不含抗生素的全價日糧。

2 方法

2.1 替米考星長效混懸劑處方的篩選與優(yōu)化

采用單因素法篩選各藥物輔料，篩選出4種輔料：機(jī)溶媒為（1,2-丙二醇:乙醇=9:1），潤濕劑為（吐溫-80），助懸劑為（羥丙甲纖維素），抗氧劑為（無水亞硫酸鈉）。根據(jù)上述篩選結(jié)果，選定溶媒、潤濕劑、助懸劑、抗氧化劑4個因素，每個因素3個水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。按正交表所列處方分別制備20 mL 25%替米考星長效混懸劑9份，過濾、滅菌后進(jìn)行替米考星含量測定試驗(yàn)、重分散性試驗(yàn)和沉降容積比試驗(yàn)。含量變化值要求在2%以內(nèi)，重分散性次數(shù)越少越好，沉降容積比不低于50%，綜合考察后選擇最優(yōu)處方。

2.2 含量測定試驗(yàn)

采用高效液相色譜法測定供試替米考星長效混懸劑的含量，共3批，每批2瓶。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.1 影響因素試驗(yàn)。包括高溫、高濕和強(qiáng)光照射試驗(yàn)[10]。取3批不同批次的供試替米考星長效混懸劑，分別于60 ℃，25 ℃、相對濕度75%，照度為（4 500±500）Lx的條件下放置10天，在第5天和第10天取樣，用高效液相色譜法測定其含量、重分散性和沉降容積比。

2.3.2 加速試驗(yàn)。取3批不同批次的供試替米考星長效混懸劑于溫度（40±2）℃、相對濕度（75±5）%條件下放置6個月，分別于試驗(yàn)期間的第1、2、3和6個月末取樣，用高效液相色譜法測定其含量、重分散性和沉降容積比。

2.3.3 長期試驗(yàn)。取3批不同批次的供試替米考星長效混懸劑于溫度（25±2）℃、相對濕度（60±10）%條件下放置12個月，分別于試驗(yàn)期間的第0、3、6、9和12個月末取樣，用高效液相色譜法測定其含量、重分散性和沉降容積比。

2.4 藥動學(xué)試驗(yàn)

選用12只體重（4±0.5）kg的成年健康中華田園犬，隨機(jī)分為兩組，雌雄各半。給藥前，取每只犬的空白血漿1 mL作為空白對照。分別將替米考星長效混懸劑和實(shí)驗(yàn)室自制替米考星溶液（方法：精密稱定磷酸替米考星2.5 g，溶于100 mL注射用水，置于數(shù)顯恒溫磁力攪拌器攪拌至完全溶解，過濾、滅菌得25%磷酸替米考星注射液）以20 mg/ kg.b.w的劑量肌肉注射兩組犬。給藥后，分別于15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，前臂橈靜脈采血2 mL裝于有肝素鈉的離心管中，3 000 r/min離心20 min，取血漿-20 ℃冷藏備用。

向裝有血樣的離心管加入4 mL乙腈，充分混勻后，3 000 r/min離心20 min。取上層的含藥層，加入適量1 moL/L NaOH溶液至pH=9，使用氯仿提取2次，3 000 r/min離心20 min，合并氯仿層，置于通風(fēng)櫥中揮發(fā)至干燥，加入流動相溶解，漩渦震蕩1 min，冷藏備用。取樣，使用高效液相色譜法檢測。

采用WinNonlin軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行非房室模型分析，得出藥動學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 替米考星長效混懸劑處方篩選與優(yōu)化

根據(jù)表1試驗(yàn)結(jié)果，以含量為X、重分散性為Y、沉降容積比為Z，進(jìn)行綜合評分。綜合得分=X+1/Y+Z。對綜合得分進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見表2。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知：極差大小順序?yàn)锳＞B＞C＞D，表明溶媒比例影響最大，其次是潤濕劑和助懸劑，抗氧劑影響最小。其中A因素：K1＜K2＜ K3；B因素：K1＜K2＜K3；C因素：K2＜K1＜K3；D因素：K1＜K3＜K2。由此得出最優(yōu)處方為A3B3C3D2，即有機(jī)溶媒占比為65%，潤濕劑占比為0.3%，助懸劑占比為5%，抗氧劑占比為0.03%。

表2 正交試驗(yàn)綜合得分

按照最優(yōu)處方制備樣品3批，測定滅菌前后替米考星原料藥含量變化值（表3）。結(jié)果表明，3批樣品滅菌前后含量變化都小于2%，符合標(biāo)準(zhǔn)。且通針性試驗(yàn)結(jié)果為易，表明通針性良好。

表3 三批樣品含量變化值

3.2 含量測定

含量測定結(jié)果（表4）表明，供試品含量變化均小于2%，符合藥典規(guī)定，檢驗(yàn)合格。

表4 供試品含量測定結(jié)果

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

高溫、高濕和強(qiáng)光照射試驗(yàn)結(jié)果表明，在高溫試驗(yàn)和強(qiáng)光照射試驗(yàn)中，供試品藥物含量稍有下降，重分散次數(shù)隨取樣時間延長而增多，沉降容積比稍有下降；高濕試驗(yàn)中，供試品藥物含量幾乎不變，重分散次數(shù)不隨取樣時間延長而增多，沉降容積比幾乎無變化（表5～7）。綜上所述，替米考星長效混懸劑對溫度敏感，儲存運(yùn)輸時應(yīng)避免高溫；對濕度不敏感；對光敏感，成品包裝應(yīng)具有遮光功能。

表5 高溫試驗(yàn)結(jié)果

表6 高濕試驗(yàn)結(jié)果

表7 強(qiáng)光照射試驗(yàn)結(jié)果

加速試驗(yàn)結(jié)果表明，供試替米考星長效混懸劑藥物含量稍有降低，重分散性次數(shù)隨時間延長有增多，沉降容積比數(shù)值稍有減小，但所有變化均符合獸藥典要求（表8）。綜上所述，該替米考星長效混懸劑穩(wěn)定性好。

表8 加速試驗(yàn)結(jié)果

長期試驗(yàn)結(jié)果表明，供試替米考星長效混懸劑藥物含量稍有降低，重分散性次數(shù)隨時間延長，僅增多1～2次，沉降容積比數(shù)值稍有減小，所有變化均符合獸藥典要求（表9）。綜上所述，該替米考星長效混懸劑穩(wěn)定性好。

表9 長期試驗(yàn)結(jié)果

3.4 藥動學(xué)試驗(yàn)

對試驗(yàn)犬肌注給藥后，替米考星長效混懸劑組和實(shí)驗(yàn)室自制替米考星溶液組測得的血藥濃度與時間數(shù)據(jù)見表10，藥時曲線見圖1。

表10 兩種制劑的血藥濃度（n=6）

圖1 兩種制劑血藥濃度-時間曲線

結(jié)果顯示，替米考星長效混懸劑組在2 h達(dá)到峰濃度2.285 μg/mL，而實(shí)驗(yàn)室自制替米考星溶液組1 h即達(dá)到峰濃度2.126 μg/mL，且前者較后者峰濃度高，說明前者較后者在犬體內(nèi)吸收程度高。替米考星長效混懸劑組在犬體內(nèi)血藥濃度可達(dá)96 h，而實(shí)驗(yàn)室自制替米考星溶液組在犬體內(nèi)的血藥濃度在72 h時即低于檢測限，說明前者較后者在犬體內(nèi)作用時間長。

WinNonlin軟件數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，替米考星長效混懸劑在犬體內(nèi)的末端消除半衰期為21.839 0 h，而實(shí)驗(yàn)室自制替米考星溶液在犬體內(nèi)的末端消除半衰期為13.605 1 h，表明后者在犬體內(nèi)的消除速度較前者快；前者的藥時曲線下面積為43.164 9 μg· h·mL-1，而后者為26.206 5 μg·h·mL-1，表明前者在犬體內(nèi)的藥物吸收程度較后者高（表11）。

表11 藥動學(xué)參數(shù)

根據(jù)下面公式計(jì)算得出替米考星長效混懸劑的相對生物利用度為164.71%。

4 討論

在試驗(yàn)中，有機(jī)溶媒使用的是少量乙醇與1,2-丙二醇混合液，目的是提高混懸劑的通針性，而最終選擇的比例為1,2-丙二醇:乙醇=9:1，這是因?yàn)橐掖技∪庾⑸鋾r濃度超過10%對組織刺激性較大。

含量測定及穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果中，替米考星含量均在24.95%～24.99%之間，說明制備的混懸劑中替米考星溶解度高，達(dá)到了替米考星含量為25%的預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)，解決了替米考星可溶性差的難題。但由于時間原因，長期試驗(yàn)只進(jìn)行了12個月。截至第12個月，供試替米考星長效混懸劑含量未見明顯減少，重分散性良好，沉降容積比接近于1。若要測得準(zhǔn)確有效期，還需繼續(xù)觀察。

藥動學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)制得的替米考星長效混懸劑在犬體內(nèi)的血藥時間延長，生物利用度提高。其原因在于試劑配方中的羥丙甲纖維素具有助懸和緩釋作用，既提高了難溶性藥物替米考星的溶解度，又延緩了替米考星的擴(kuò)散溶出，達(dá)到了長效治療的目的。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)確定了替米考星長效混懸劑的最優(yōu)處方為：替米考星原料藥2.5g，有機(jī)溶媒（1,2-丙二醇：乙醇=9:1）65%，潤濕劑0.3%，助懸劑5%，抗氧化劑0.03%，注射用水至全量100 mL。經(jīng)制劑的含量測定試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)和藥動學(xué)試驗(yàn)，證明其質(zhì)量合格。

[1]劉曉萍，趙恒壽. 替米考星的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J]. 四川畜牧獸醫(yī)，2008，35（4）：33-34.

[2]宋福杰，劉明春，符特. 替米考星的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2006（7）：63-65.

[3] AYLING R D，BAKER S E，NICHOLAS R A，et al. Comparison of in vitro activity of danofloxacin，florfenicol，oxytetracycline，spectinomycin and tilmicosin against Mycoplasma mycoides subspecies mycoides small colony type[J].Veterinary Record，2000，146（9）：243-246.

[4]柴暉麗，喬賽毛措，周毛加. 淺談獸藥緩控釋制劑的研究進(jìn)展[J]. 青海畜牧獸醫(yī)雜志，2014， 44（3）：40-42.

[5]王艷玲，劉晨光，郝智慧. 獸藥緩控釋制劑的研究進(jìn)展[J]. 中國獸藥雜志，2008，42（11）：42-46.

[6] DEWEY D，LEE H J，MARSTON H R. Provision of cobalt to ruminants by means of heavy pellets[J]. Nature，1958，181（4620）：1367-1371.

[7] ROBISON J R. Sustained and Controlled Release Drug Delivery System[M]. New York：Marcel Dekker，1978.

[8] ANDERSON N. Controlled release technology for the control of helminths in ruminants[J]. Vet Parasitol，1985，18（1）：59-66.

[9] FERGUSON T H，NEEDHAM G F，WAGNER J F，et al. Compudose：an implant system for growth promotion and feed efficiency in cattle [J]. J Controlled Release，1988，8：45-54. [10]中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Preparation and Quality Evaluation of Tilmicosin Long-action Suspension

Li Minglu1，Zou Benge2，Bi Kedong1，Xu Yu1

（1. Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shangdong 266109；2. Haidu College of Qingdao Agricultural University，Laiyang，Shangdong 265200）

[Objective]In order to develop the Tilmicosin long-action suspension with characteristics of high solubility，good curative effect and low administration frequency by using modern slow-release technology and taking Tilmicosin ingredient as raw materials，so as to provide reliable basis for mass production on the basis of preliminary quality evaluation.[Methods]Choosing the optimal prescription through orthogonal optimization method，then content determination，stability and pharmacokinetic tests were conducted towards the optimized prescription. [Results]The proportions of the prescription for the Tilmicosin long-action suspension listed below：Tilmicosin ingredients（2.5 g/100 mL），Organic solvent（1,2-propylene glycol:ethanol = 9:1）accounting for 65%，Wetting agent（Twain-80）accounting for 0.3%，Suspended aid（Hydroxypropyl methyl cellulose）accounting for 5%，and Antioxidant（Anhydrous sodium sulfite）accounting for 0.03%. Results of content determination test manifested as qualified. Sensitivity test showed Tilmicosin long-action suspension was sensitive to high temperature and strong light，but it wasn′t humidity-sensitive. Accelerated test and long-term test indicated the long-action suspension had good stability. According to pharmacokinetic test result，the AUC of Tilmicosin long-action suspension and laboratory homemade Tilmicosin solution were 43.164 9 μg·h·mL-1and 26.206 5 μg·h·mL-1，respectively. The relative bio-availability of the suspension was 164.71%. [Conclusions]The developed Tilmicosin long-action suspension was of qualified content determination，good stability and high relative bio-availability，it could be carried out mass production and applied in large-scale farms.

Tilmicosin；suspension；content；stability；pharmacokinetic；bio-availability

S859.79

B

1005-944X（2017）04-0094-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.04.027