秦航 林燁 常婷 郭鵬 李柱一

Th22細(xì)胞及相關(guān)因子在重癥肌無力患者外周血中的表達(dá)

秦航 林燁 常婷 郭鵬 李柱一

目的 研究重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)患者外周血輔助性T細(xì)胞22(T helper 22 cells,Th22)和白細(xì)胞介素-22(interleukin-22，IL-22)的表達(dá)以及兩者間的相關(guān)性。方法 收集25例MG患者和24例健康對照者，其中眼肌型重癥肌無力(ocular myasthenia gravis，OMG)患者14例，全身型重癥肌無力(general myasthenia gravis，GMG)患者11例。采用流式細(xì)胞儀檢測MG患者和健康對照者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中Th22細(xì)胞的比例，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血漿IL-22的表達(dá)。比較各組間Th22細(xì)胞比例和IL-22表達(dá)水平差異，以及Th22細(xì)胞比例和IL-22表達(dá)間的相關(guān)性。結(jié)果 MG患者PBMC中Th22細(xì)胞比例、血漿IL-22表達(dá)水平均顯著低于健康對照組〔(0.60±0.07)%比(0.92±0.09)%，P<0.01；(18.65±1.38)pg/mL比(24.54±1.85)pg/mL，P<0.05〕；OMG與GMG患者間Th22細(xì)胞比例、IL-22表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)；MG患者PBMC中Th22細(xì)胞比例與IL-22表達(dá)水平間呈中度正相關(guān)(r=0.59，P<0.01)。結(jié)論 MG患者體內(nèi)Th22細(xì)胞比例及血漿IL-22表達(dá)水平減低可能導(dǎo)致免疫功能紊亂進(jìn)而影響MG的發(fā)病。

重癥肌無力；T淋巴細(xì)胞亞群；輔助性T細(xì)胞22；白細(xì)胞介素22

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種T細(xì)胞依賴、B細(xì)胞介導(dǎo)、補(bǔ)體參與的獲得性自身免疫性疾病，主要由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)介導(dǎo)引起神經(jīng)肌肉接頭傳遞障礙所致[1-2]。研究表明CD4+輔助性T細(xì)胞可輔助漿細(xì)胞產(chǎn)生AChR-Ab[3]，Ahlberg等[4]也曾報(bào)道通過人鼠嵌合抗CD4單克隆抗體可改善MG患者癥狀，可見CD4+輔助性T細(xì)胞在MG的發(fā)生中起至關(guān)重要的作用。

輔助性T細(xì)胞22(T helper 22 cells，Th22)作為一種新型CD4+輔助性T細(xì)胞亞群，主要分泌特征性的細(xì)胞因子——白細(xì)胞介素-22(interleukin-22，IL-22)，但不分泌IL-17和γ干擾素(IFN-γ)，細(xì)胞表型為CD4+IL-22+IL-17-IFN-γ-[5]。人體內(nèi)的IL-22主要由Th22細(xì)胞分泌，它是Th22細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要效應(yīng)因子[5-7]。Th22細(xì)胞與很多自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，許多自身免疫性疾病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中Th22細(xì)胞比例及血漿IL-22表達(dá)水平較健康者升高[8]，然而在狼瘡腎炎患者中Th22細(xì)胞和IL-22卻顯著下降[9]。目前，尚未檢索到國內(nèi)外有關(guān)Th22細(xì)胞在MG發(fā)病中作用的研究。本研究通過檢測MG患者外周血Th22細(xì)胞及IL-22的表達(dá)，旨在探究Th22細(xì)胞在MG發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 對象和方法

1.1 研究對象 收集2015-10—2016-06在第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診就診的MG患者25例，MG確診標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《中國重癥肌無力診斷和治療指南(2015)》[10]，入組患者均未進(jìn)行免疫抑制劑或激素治療，且不合并其他自身免疫性疾病。其中男性14例，女性11例，伴胸腺異常5例(胸腺瘤4例，胸腺增生1例)，年齡3.8～82歲，平均(40.4±3.2)歲。所有患者進(jìn)行MGFA分型，其中Ⅰ型14例，Ⅱa型5例，Ⅱb型5例，Ⅲa型1例。Ⅰ型患者定義為眼肌型重癥肌無力(ocular myasthenia gravis，OMG)組，另11例為全身型重癥肌無力(general myasthenia gravis，GMG)組。健康對照24名，均來自作者醫(yī)院體檢的健康者，無自身免疫性疾病，其中男性13名，女性11名，年齡21～64歲，平均(40.1±2.7)歲。所有MG患者和健康對照均簽署知情同意書。兩組間性別構(gòu)成和年齡間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

1.2 主要試劑和儀器 流式單克隆抗體FITC-anti-human CD4、PerCP/Cy5.5-anti-human IFN-γ、APC-anti-human IL-17A、PE-anti-human IL-22及對應(yīng)的同型抗體購自Biolegend公司，固定/破膜試劑及洗液為BD公司產(chǎn)品，離子霉素、佛波酯以及莫能霉素購自Sigma公司，人IL-22 ELISA試劑盒為Mabtech公司產(chǎn)品。主要儀器包括流式細(xì)胞儀(BD公司)、酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)、離心機(jī)(Eppendorf公司)。

1.3 方法

1.3.1 PBMC中Th22細(xì)胞比例檢測：采用密度梯度沉降法獲取PBMC，收集約1×106個(gè)PBMC，加入離子霉素、佛波酯以及莫能霉素，置37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2多功能細(xì)胞孵育箱中孵育6 h，破膜、固定細(xì)胞，加入FITC-anti-human CD4、PerCP/Cy5.5-anti-human IFN-γ、APC-anti-human IL-17A、PE-anti-human IL-22單克隆抗體，4℃避光孵育30 min，洗滌、多聚甲醛固定后通過流式細(xì)胞儀檢測CD4+IL-22+IL-17-IFN-γ-的細(xì)胞比例。同型對照組加入FITC-anti-human CD4、PerCP/Cy5.5-anti-human IFN-γ單克隆抗體，APC、PE同型抗體。

1.3.2 血漿IL-22表達(dá)檢測：將前期凍于-80℃的兩組血漿樣本于4℃解凍，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)進(jìn)行檢測，具體步驟按人IL-22 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，Th22細(xì)胞比例與IL-22表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。以雙側(cè)P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組PBMC中Th22細(xì)胞比例 MG患者PBMC中Th22細(xì)胞比例低于健康對照組〔(0.60±0.07)%比(0.92±0.09)%，P<0.01〕。OMG組患者Th22細(xì)胞比例與GMG組比較雖有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(0.64±0.10)%比(0.55±0.09)%，P>0.05〕。某例MG患者與健康對照者流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果見圖1。

2.2 血漿IL-22表達(dá)水平 MG患者血漿IL-22表達(dá)水平顯著低于健康對照組〔(18.65±1.38)pg/mL比(24.54±1.85)pg/mL，P<0.05〕。OMG患者IL-22表達(dá)水平雖有高于GMG患者的趨勢，但兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(20.82±1.92)pg/mL比(15.89±1.69)pg/mL，P>0.05〕。

2.3 MG患者外周血Th22細(xì)胞比例與IL-22的相關(guān)性 MG患者PBMC中Th22細(xì)胞比例與血漿IL-22表達(dá)水平呈中度正相關(guān)(r=0.59，P<0.01)。結(jié)果見圖2。

注：MG：重癥肌無力,圖2同；PBMC：外周血單個(gè)核細(xì)胞 圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測某例MG患者和健康對照PBMC中Th22細(xì)胞比例結(jié)果

注：IL-22：白細(xì)胞介素-22；IFN-γ：干擾素γ 圖2 MG患者外周血Th22細(xì)胞比例與IL-22表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討論

Th22細(xì)胞在許多自身免疫性疾病中均發(fā)揮了重要作用，但有關(guān)Th22細(xì)胞在MG方面的研究目前尚未檢索到。本研究對MG患者PBMC中Th22細(xì)胞比例、血漿IL-22的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，并探討了Th22細(xì)胞與IL-22表達(dá)間的關(guān)系，結(jié)果顯示，MG患者PBMC中Th22細(xì)胞比例、血漿IL-22表達(dá)水平均顯著低于健康對照組，MG患者PBMC中Th22細(xì)胞比例與IL-22表達(dá)水平間存在中度正相關(guān)。

Th22細(xì)胞在腫瘤壞死因子α(TNF-α)和IL-6等細(xì)胞因子的刺激下由初始CD4+T細(xì)胞分化而來，而轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)作為一種主要的內(nèi)源性免疫抑制因子具有抑制Th22細(xì)胞分化的功能[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)，MG合并胸腺瘤患者的瘤組織中TGF-β1表達(dá)水平較單純胸腺瘤患者高[11]；MG患者外周血中TGF-β1也顯著高于健康者[12]。TGF-β1在所有的TGF-β亞型中生物學(xué)活性最強(qiáng)，這似乎部分解釋了MG患者PBMC中Th22細(xì)胞比例減低的原因。有研究表明IL-22與AChR-Ab之間存在顯著負(fù)相關(guān)[13]。IL-22主要由Th22細(xì)胞分泌，本研究發(fā)現(xiàn)Th22與IL-22之間存在顯著正相關(guān)，推測Th22細(xì)胞可能抑制了B細(xì)胞的功能，減少了AChR-Ab的分泌。MG患者Th22細(xì)胞減少，降低了其對B細(xì)胞的抑制，從而促進(jìn)了AChR-Ab的分泌，可能導(dǎo)致了MG的發(fā)生發(fā)展。

IL-22作為白細(xì)胞介素-10家族中的一員，主要由Th22細(xì)胞分泌，通過IL-22R1和IL-10R2組成的異二聚體受體復(fù)合體發(fā)揮功能，IL-10R2廣泛地表達(dá)于各類免疫組織細(xì)胞，但I(xiàn)L-22R1僅分布在某些組織細(xì)胞如骨骼肌、皮膚、小腸等[14-15]。IL-22在不同的組織中具有促進(jìn)炎癥或者抑制炎癥的雙重功效，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[16]等疾病中，表現(xiàn)為促炎的功能，參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，但在急性胰腺炎[17]、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎[18]等動(dòng)物模型以及狼瘡腎炎[9]患者中，IL-22卻表現(xiàn)出抑制炎癥的保護(hù)性作用。在小鼠氣道炎癥模型中，IL-22在氣道組織中表現(xiàn)出促進(jìn)炎癥致病或抑制炎癥保護(hù)的雙重功效，具體取決于IL-17A的表達(dá)。當(dāng)缺乏IL-17A時(shí)，表現(xiàn)出抑制炎癥的保護(hù)性作用；當(dāng)IL-22與IL-17A共表達(dá)時(shí)，表現(xiàn)出促炎的作用[19]。作者課題組既往研究結(jié)果顯示，Th17細(xì)胞和IL-17可能參與了MG的發(fā)病，且MG患者外周血中Th17細(xì)胞比例、IL-17表達(dá)量較健康者明顯升高[20]，推測MG患者IL-17的升高可能與IL-22共表達(dá)，表現(xiàn)出促炎的作用，從而參與了MG的發(fā)生。

芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AHR)是Th22細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Trifari等[21]研究顯示，β-萘黃酮作為AHR的激動(dòng)劑，在人體內(nèi)既可促進(jìn)IL-22的表達(dá)，提高Th22細(xì)胞的比例，又可抑制IL-17的表達(dá)，降低Th17細(xì)胞的比例，提示Th22與Th17細(xì)胞、IL-22與IL-17之間可能存在平衡。Zheng等[13]研究亦發(fā)現(xiàn)MG患者血清中IL-22較健康者顯著降低，IL-17顯著升高，且IL-22與IL-17之間存在負(fù)相關(guān)。本文研究選取未經(jīng)過任何藥物治療的新發(fā)MG患者，入組標(biāo)準(zhǔn)更加嚴(yán)格，并對Th22細(xì)胞在PBMC中的比例變化進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示MG患者Th22細(xì)胞比例、IL-22表達(dá)較健康對照組降低，且Th22細(xì)胞比例與IL-22呈正相關(guān)。這與上述研究結(jié)果基本一致。據(jù)此推測，Th17細(xì)胞、IL-17升高，Th22細(xì)胞、IL-22減低，這種平衡的改變可能導(dǎo)致了MG的發(fā)生。

綜上所述，MG患者PBMC中Th22細(xì)胞比例、血漿IL-22表達(dá)水平降低，可能參與了MG的發(fā)生發(fā)展，Th22細(xì)胞和IL-22可能在MG中起保護(hù)性作用，這為將來MG的治療可能提供了新的療法，但有關(guān)Th22細(xì)胞及相關(guān)因子在MG發(fā)病中的免疫機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

Changes of circulating T helper 22 cells and its related molecules in myasthenia gravis

QINHang,LINYe,CHANGTing,GUOPeng,LIZhuyi*.

*DepartmentofNeurology,TangduHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’anShaanxi710038,China

Corresponding author: LI Zhuyi, Email: lizhuyi@fmmu.edu.cn

Objective To study the expression of T helper 22 (Th22) cells and interleukin-22 (IL-22) in peripheral blood of patients with myasthenia gravis (MG); the correlation between Th22 cells and IL-22 was analyzed. Methods Twenty-five MG patients, consisting of fourteen ocular MG (OMG) patients and eleven general MG patients(GMG), were enrolled. Twenty-four healthy volunteers were used as controls. The percentages of Th22 cells in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of MG patients and healthy controls were detected by flow cytometry. The plasma levels of IL-22 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The differences of the Th22 cells percentages and the concentration of IL-22 were compared between each group; also we investigated the correlation between Th22 cells and IL-22. Results The proportion of Th22 cells and plasma IL-22 levels significantly declined in MG patients compared with healthy controls [(0.60±0.07)%vs. (0.92±0.09)%，P<0.01；(18.65±1.38)pg/mLvs. (24.54±1.85)pg/mL，P<0.05]. There were no significant differences of the proportion of Th22 cells and plasma IL-22 levels between OMG and GMG patients(allP>0.05). Moderate positive correlation was shown between the proportion of Th22 cells and plasma IL-22 levels in PBMC of MG patients(r=0.59，P<0.01).Conclusions The decreased Th22 cells and IL-22 in MG patients might lead to immune disorder, and then were involved in the pathological process of MG.

myasthenia gravis; T-lymphocyte subsets; T helper 22 cells; interleukin-22

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.03.006

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81571218)

710038 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

李柱一，Email: lizhuyi@fmmu.edu.cn

R746.1

A

1006-2963(2017)03-0174-04

2016-10-14)