梁湘　李俊　陳慧珠　卓秋紅　龍羽燕　屈達(dá)才

摘要：【目的】建立針對(duì)家蠶核型多角體病毒（BmNPV）的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）可視化檢測(cè)技術(shù)，為生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行家蠶血液型膿病早期診斷提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳訠mNPV多角體蛋白基因polh為擴(kuò)增靶標(biāo)，分別設(shè)計(jì)5組內(nèi)/外引物和5條環(huán)引物，根據(jù)擴(kuò)增效率篩選最佳引物組合；優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件，并進(jìn)行LAMP檢測(cè)的特異性、敏感性及臨床樣本檢測(cè)試驗(yàn)；使用羥基萘酚藍(lán)（HNB）染色對(duì)結(jié)果進(jìn)行比色觀察，對(duì)簡(jiǎn)化樣品處理的條件進(jìn)行摸索?！窘Y(jié)果】使用環(huán)引物后LAMP對(duì)BmNPV基因組DNA的最低檢測(cè)濃度為7 fg/μL，檢測(cè)靈敏度得到有效提高，且反應(yīng)時(shí)間縮短。建立的LAMP檢測(cè)方法對(duì)靶標(biāo)DNA擴(kuò)增具有特異性，對(duì)樣本的檢出率高于常規(guī)PCR，其最低檢測(cè)限是常規(guī)PCR的100倍。在反應(yīng)前加入HNB，結(jié)果易判斷且能減少交叉污染。感染家蠶血淋巴進(jìn)行100 ℃煮沸處理后即可直接用于LAMP反應(yīng)，既簡(jiǎn)化了操作步驟，又降低了檢測(cè)成本。【結(jié)論】針對(duì)BmNPV建立的LAMP可視化檢測(cè)技術(shù)具有靈敏、快捷、可靠的特點(diǎn)，適合用于生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的BmNPV感染早期診斷。

關(guān)鍵詞： 家蠶核型多角體病毒（BmNPV）；家蠶血液型膿??；LAMP；早期診斷；可視化

中圖分類(lèi)號(hào)： S884.51 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）01-0163-06

Abstract：【Objective】The present study established loop-mediated isothermal amplification（LAMP） for visual detection of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）， in order to provide support for early diagnosis of nuclear polyhedrosis at work field. 【Method】Taking BmNPV polyhedrin gene polh as amplification target， five groups of inner primer/outer primer and five pieces of loop primer were designed in order to screen the best primer combination based on amplification efficiency. LAMP reaction conditions were optimized and assays on specificity， sensibility as well as clinical sample detection were conducted. The amplification result was observed by colorimetric determination with hydroxynaphthol blue （HNB） staining. The conditions for simplifying treatment were analyzed. 【Result】When using LAMP of loop primer， the lowest detection line of BmNPV genomic DNA could reach 7 fg/μl， the sensitivity of detection was improved effectively and reaction time was reduced. The established LAMP detection specifically amplified the target DNA， and its sample detection rate was superior to conventional PCR. The lowest detection line was as 100 times as that of conventional PCR. The result could be easily judged and the cross-contamination could be reduced by adding HNB before reaction. The hemolymph of infected silkworm boiled at 100 ℃ could be directly applied to LAMP， which could simplify operation steps and reduce detecting cost. 【Conclusion】The visual LAMP detection targeting BmNPV established in this study is sensitive， quick and reliable， which is appropriate to use for early diagnosis of BmNPV infection at work field.

Key words： Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）； nuclear polyhedrosis； LAMP； early diagnosis； visua-

lization

0 引言

【研究意義】家蠶血液型膿病是廣西養(yǎng)蠶業(yè)中最常見(jiàn)及危害最嚴(yán)重的一種病毒性傳染病，由于傳染性強(qiáng)、病死率高，且目前尚無(wú)有效的治療方法，對(duì)蠶繭生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。家蠶血液型膿病病原為家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV），其特點(diǎn)是病毒粒子可在多角體結(jié)構(gòu)的保護(hù)下長(zhǎng)期保存感染活力，病毒多角體在自然環(huán)境中廣泛富集，極易對(duì)桑葉和蠶作環(huán)境造成污染。BmNPV多角體被蠶體攝食后即引起原發(fā)性感染，繼而傳播感染蠶室內(nèi)的其他健康蠶體（Fuxa，2004；Liang et al.，2013）。因此，建立針對(duì)BmNPV的特異、靈敏、快速、適合基層使用的可視化檢測(cè)技術(shù)，對(duì)有效防控家蠶血液型膿病暴發(fā)流行及減少病毒多角體在生產(chǎn)環(huán)境中的富集具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】分子生物學(xué)診斷技術(shù)是近年來(lái)蠶病診斷研究的新方向，主要是基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對(duì)病原微生物核酸進(jìn)行擴(kuò)增克隆。目前，國(guó)內(nèi)已有關(guān)于BmNPV檢測(cè)常規(guī)PCR（涂納新等，1994；劉吉平等，2011；唐芬芬等，2013b）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（姚勤等，2005）、二溫式PCR（覃玥和陳保善，2015）和多重PCR（專(zhuān)利號(hào)CN102605106A，浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院）的研究報(bào)道；也有關(guān)于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道，但未涉及擴(kuò)增效率的改善（唐芬芬等，2013a；覃玥等，2015）。本課題組通過(guò)對(duì)BmNPV多角體蛋白基因polh進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析，獲得了廣西多個(gè)毒株的polh基因序列信息（Liang et al.，2013），為L(zhǎng)AMP的靶標(biāo)選擇和引物設(shè)計(jì)打下了基礎(chǔ)。LAMP是一種操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、高度特異和靈敏的核酸擴(kuò)增技術(shù)（Nimitphak et al.，2000），自其問(wèn)世以來(lái)，經(jīng)過(guò)不斷的優(yōu)化和改進(jìn)，目前已廣泛應(yīng)用到不同領(lǐng)域的生物基因檢測(cè)及鑒別研究，如畜禽病原微生物L(fēng)AMP檢測(cè)方法的建立為生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的快速診斷提供了技術(shù)支持（Liu et al.，2011；彭宜等，2013；Pawar et al.，2014；Xie et al.，2014；鄧顯文等，2015；胡成等，2015；潘宏等，2015）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前生產(chǎn)上對(duì)家蠶血液型膿病的診斷主要依靠典型病征的肉眼觀察診斷，但BmNPV感染家蠶后的病程與家蠶齡期、病毒數(shù)量和毒力、飼養(yǎng)環(huán)境及家蠶體質(zhì)等因素有關(guān)，且該病為亞急性傳染病，可確診時(shí)期通常已發(fā)展到感病晚期，因此亟需建立一種特異、靈敏、快速、適合基層使用的可視化檢測(cè)技術(shù)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】建立針對(duì)BmNPV的LAMP檢測(cè)技術(shù)，為生產(chǎn)開(kāi)展家蠶血液型膿病早期診斷提供技術(shù)支持，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病情并采取有效防治措施，控制該病的擴(kuò)散傳播。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

BmNPV病毒、家蠶質(zhì)型多角體病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosisvirus，BmCPV）、家蠶微孢子蟲(chóng)（Nosemabombycis，N.b）、靈菌敗血病菌（Serratia marcescens，S.m）、白僵病菌（Beauveria bassiana，B.b）由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院蠶病研究室保存提供，DNA抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，ExTaq購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，Bst DNA聚合酶、甜菜堿（Betaine）、MgSO4、dNTPs、鈣黃綠素（Calcein）、MnCl2等購(gòu)自榮研（中國(guó)）生物科技有限公司，羥基萘酚藍(lán)（HNB）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：分光光度計(jì)Thermo Scientific NANODROP 1000購(gòu)自Scientific Thermo公司，LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀購(gòu)自日本Eiken Chemical公司。

1. 2 LAMP引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)BmNPV標(biāo)準(zhǔn)參考毒株日本T3株（GenBank登錄號(hào)L33180.1）的polh基因序列，使用LAMP引物設(shè)計(jì)輔助軟件Primer Explorer V4進(jìn)行在線設(shè)計(jì)。分別設(shè)計(jì)5組內(nèi)/外引物和5條環(huán)引物，再根據(jù)擴(kuò)增效率篩選最佳引物組合。所有引物由廣州華大基因科技股份有限公司合成。

1. 3 DNA提取及陽(yáng)性質(zhì)粒構(gòu)建

按本課題組建立的方法提取所有試材DNA，以分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。采用常規(guī)PCR擴(kuò)增BmNPV的polh基因完整ORF，將目的基因連接至pMD18-T載體，構(gòu)建陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-polh，測(cè)序驗(yàn)證模板的準(zhǔn)確性（Liang et al.，2013）。

1. 4 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

將反應(yīng)溫度從60 ℃逐步提高至65 ℃，選擇最佳反應(yīng)溫度。確定反應(yīng)溫度后對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，在不同濃度的反應(yīng)組分（2～12 mmol/L MgSO4、0.2～1.2 mol/L Betaine、0.6～1.6 mmol/L dNTPs）和不同反應(yīng)時(shí)間（20、40、60和80 min）條件下，在LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀中進(jìn)行LAMP反應(yīng)，每隔6 s測(cè)定1次濁度值。根據(jù)濁度值繪制濁度變化曲線，當(dāng)濁度值大于0.25即可判為陽(yáng)性。

1. 5 環(huán)引物使用效果試驗(yàn)

將陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?0-8～10-1），以此為模板分別進(jìn)行兩組LAMP反應(yīng)，一組使用環(huán)引物，另一組不使用環(huán)引物，濁度儀實(shí)時(shí)測(cè)定反應(yīng)濁度的變化。

1. 6 LAMP特異性試驗(yàn)

分別對(duì)BmNPV、BmCPV、N.b、S.m和B.b的DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)，以健康家蠶的血細(xì)胞DNA為對(duì)照（CT），濁度儀實(shí)時(shí)測(cè)定反應(yīng)濁度的變化。

1. 7 LAMP敏感性試驗(yàn)

將BmNPV基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?0-8～ 10-1），以此為模板分別進(jìn)行LAMP和常規(guī)PCR檢測(cè)，濁度儀實(shí)時(shí)測(cè)定LAMP反應(yīng)的濁度值變化。常規(guī)PCR使用外引物F3/B3進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1. 8 臨床樣本檢測(cè)試驗(yàn)

分別采用LAMP和常規(guī)PCR對(duì)25份蠶病樣本的DNA進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法的檢出率。LAMP反應(yīng)結(jié)果可視化判斷，即在反應(yīng)體系中加入120 μmol/L HNB，或加入20 μmol/L Calcein和0.5 mmol/L MnCl2，自然光下觀察染色結(jié)果。

1. 9 簡(jiǎn)化樣本處理試驗(yàn)

取1.6×108 OBs/mL的BmNPV多角體接種5齡起蠶，接種后第6 d采集感染家蠶的血淋巴，以等量超純水稀釋?zhuān)殖蓛山M。一組添加多角體裂解緩沖液（0.2 mol/L Na2CO3+0.32 mol/L NaCl），另一組不添加多角體裂解緩沖液，然后分別對(duì)兩組樣品進(jìn)行5種不同處理：①100 ℃煮沸10 min，使細(xì)胞破裂，蛋白變性；②加入1/10體積的10% SDS于55 ℃下作用1 h；③加入1/20體積的蛋白酶K于55 ℃下作用1 h；④加入1/10體積的10% SDS和1/20體積的蛋白酶K于55 ℃下作用1 h；⑤抽提DNA。12000 r/min離心10 min，各取2 μL上清液作為模板進(jìn)行LAMP檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 LAMP引物篩選及反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

以攜帶polh基因的陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-polh為模板，分別使用5組LAMP引物的外引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均能擴(kuò)增出目的片段。再使用5組內(nèi)/外引物在同等條件下進(jìn)行LAMP檢測(cè)，結(jié)果顯示有4組內(nèi)/外引物能實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)濁度值變化曲線可看出，第3組引物擴(kuò)增的濁度值變化速率最大，表現(xiàn)為陽(yáng)性擴(kuò)增反應(yīng)最快、反應(yīng)用時(shí)最短（圖1-A）。在選擇擴(kuò)增效率最高的第3組內(nèi)/外引物基礎(chǔ)上，再分別使用5條環(huán)引物進(jìn)行LAMP檢測(cè)，結(jié)果顯示，5條環(huán)引物均能使擴(kuò)增效率進(jìn)一步提高，其中以第2條環(huán)引物的提高效果最明顯，濁度值達(dá)陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)最快，與未使用環(huán)引物反應(yīng)相比，用時(shí)縮短近一半（圖1-B）。因此，選擇第3組內(nèi)/外引物和第2條環(huán)引物作為最佳的LAMP引物組合（表1）。對(duì)LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)反應(yīng)體系為25.0 μL：F3和B3引物各5 pmol，F(xiàn)IP和BIP引物各40 pmol，LP引物20 pmol，0.6 mol/L Betaine，8 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，8 U Bst DNA聚合酶，1.0 μL模板DNA；于63 ℃下恒溫反應(yīng)60 min，90 ℃滅活5 min。

2. 2 環(huán)引物使用效果比較結(jié)果

以10倍梯度稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板進(jìn)行LAMP檢測(cè)，結(jié)果顯示，不使用環(huán)引物的LAMP反應(yīng)最低稀釋度為10-5，且在反應(yīng)開(kāi)始約28 min時(shí)檢測(cè)到有polh基因的擴(kuò)增（圖2-A）；使用環(huán)引物的LAMP反應(yīng)最低稀釋度為10-6，最低檢測(cè)限是不使用環(huán)引物的10倍，且在反應(yīng)開(kāi)始約15 min時(shí)即檢測(cè)到有polh基因的擴(kuò)增，較不使用環(huán)引物約提前1倍（圖2-B）。說(shuō)明使用環(huán)引物不僅能使LAMP反應(yīng)時(shí)間縮短，還有利于提高其檢測(cè)敏感性。

2. 3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

由LAMP檢測(cè)的濁度變化曲線可知，BmCPV、N.b、S.m和B.b的LAMP檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，對(duì)健康家蠶血細(xì)胞（CT）的DNA擴(kuò)增也呈陰性，僅對(duì)BmNPV的DNA產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)，且濁度快速達(dá)到陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，表明建立的LAMP檢測(cè)方法對(duì)靶標(biāo)DNA擴(kuò)增具有特異性。

2. 4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)得基因組DNA濃度為70 ng/μL，進(jìn)行10倍梯度稀釋后，以不同濃度的DNA稀釋液為模板分別進(jìn)行LAMP和常規(guī)PCR檢測(cè)。濁度變化曲線（圖3-A）顯示，LAMP檢測(cè)的最低稀釋度為10-7，即最低DNA濃度為7 fg/μL。常規(guī)PCR檢測(cè)的最低稀釋度為10-5（圖3-B），即最低DNA濃度為700 fg/μL。LAMP的最低檢測(cè)限是常規(guī)PCR的100倍，表明LAMP檢測(cè)的敏感性高于常規(guī)PCR。

2. 5 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

陽(yáng)性LAMP反應(yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂白色沉淀，因此反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液變混濁，靜置或低速離心反應(yīng)管，在管底可見(jiàn)白色沉淀。以HNB染色時(shí)，自然光下可見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)液呈淺藍(lán)色，陰性反應(yīng)液呈較深的藍(lán)紫色；采用鈣黃綠素和MnCl2染色時(shí)，陽(yáng)性反應(yīng)液呈淺綠色，陰性反應(yīng)液呈淺橘色（圖4）。為了驗(yàn)證LAMP檢測(cè)的穩(wěn)定性和實(shí)用性，分別采用LAMP和常規(guī)PCR對(duì)25份蠶病樣本的DNA進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法的檢出率，結(jié)果表明，LAMP共檢測(cè)到21份BmNPV陽(yáng)性樣本，常規(guī)PCR僅檢測(cè)出17份BmNPV陽(yáng)性樣本。說(shuō)明LAMP的檢出率高于常規(guī)PCR，尤其對(duì)于混合感染的樣本，微量的BmNPV DNA也能通過(guò)LAMP檢測(cè)出來(lái)。

2. 6 簡(jiǎn)化樣本處理試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)BmNPV感染的家蠶血淋巴進(jìn)行100 ℃煮沸10 min和抽提DNA處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加多角體裂解緩沖液與否均會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增反應(yīng)，但不添加多角體裂解緩沖液的處理在反應(yīng)開(kāi)始約16 min即產(chǎn)生擴(kuò)增（圖5-A），而添加多角體裂解緩沖液的處理在反應(yīng)開(kāi)始44 min后才出現(xiàn)擴(kuò)增（圖5-B）。抽提DNA的處理均在反應(yīng)開(kāi)始12 min左右產(chǎn)生擴(kuò)增；添加多角體裂解緩沖液的煮沸處理樣本，LAMP擴(kuò)增反應(yīng)起始較慢，可能是由于強(qiáng)堿性裂解樣本改變了反應(yīng)體系的性質(zhì)，對(duì)Bst DNA聚合酶的活性產(chǎn)生影響；其他3種處理方式的LAMP檢測(cè)結(jié)果均為陰性，推測(cè)SDS和蛋白酶K對(duì)Bst DNA聚合酶造成了變性破壞，使其功能受損。

3 討論

LAMP內(nèi)/外引物可識(shí)別靶基因6個(gè)不同區(qū)域的核酸序列，其設(shè)計(jì)較常規(guī)PCR復(fù)雜，對(duì)特異性要求較高。Nagamine等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，在LAMP反應(yīng)中加入環(huán)引物能夠明顯加快擴(kuò)增速度，縮短反應(yīng)時(shí)間，還能提高檢測(cè)的靈敏度。LAMP檢測(cè)的關(guān)鍵是靶標(biāo)基因選擇與引物篩選。在線設(shè)計(jì)LAMP引物時(shí)會(huì)產(chǎn)生多組引物可供選擇，除了根據(jù)引物的Tm、GC含量、末端穩(wěn)定性等進(jìn)行篩選外，反應(yīng)時(shí)間和效率也是決定引物優(yōu)劣的重要因素。在唐芬芬等（2013a）、覃玥等（2015）的BmNPV可視化LAMP方法建立研究中，都只設(shè)計(jì)1組LAMP引物進(jìn)行試驗(yàn)，未對(duì)LAMP引物進(jìn)行篩選。本研究設(shè)計(jì)并合成了5組特異性的LAMP內(nèi)/外引物和5條環(huán)引物，經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)有4組LAMP內(nèi)/外引物能實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)，而5條環(huán)引物均能不同程度改善反應(yīng)效率，表明同一靶標(biāo)基因的LAMP引物，結(jié)合位點(diǎn)不同，其反應(yīng)效率也存在差別，因此需根據(jù)反應(yīng)快慢和擴(kuò)增速率篩選最佳引物組合。本研究通過(guò)濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，能夠具體了解反應(yīng)起始快慢和擴(kuò)增速率等信息，為引物篩選優(yōu)化提供了依據(jù)。此外，利用篩選的最佳引物組合，對(duì)常見(jiàn)家蠶病原微生物進(jìn)行LAMP檢測(cè)，以排除交叉反應(yīng)的可能，結(jié)果顯示篩選出的最佳引物組合僅對(duì)靶標(biāo)DNA的擴(kuò)增具有特異性。

BmNPV的polh基因是病毒極晚期超量表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白基因，編碼的多角體蛋白組裝形成多角體晶體結(jié)構(gòu)。Xu等（2013）通過(guò)對(duì)不同BmNPV毒株的基因組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)polh基因的保守性高于pe38基因。雖然與覃玥等（2015）的研究都選擇polh基因作為靶標(biāo)基因，但本研究設(shè)計(jì)還使用了環(huán)引物，對(duì)BmNPV基因組DNA的最低檢測(cè)濃度為7 fg/μL，明顯低于覃玥等（2015）的研究結(jié)果（25 fg/μL），檢測(cè)敏感性得到改善。此外，使用環(huán)引物的LAMP反應(yīng)時(shí)間比不使用環(huán)引物的縮短近一半，有效提高了反應(yīng)效率，且檢出率高于常規(guī)PCR。BmNPV對(duì)家蠶中腸細(xì)胞造成原發(fā)性感染后，產(chǎn)生的子代病毒即進(jìn)入血腔侵染血細(xì)胞和其他易感組織細(xì)胞，受感染細(xì)胞崩解，細(xì)胞碎片被釋放進(jìn)血腔，病毒隨之釋放到血液中。本研究將感染的血淋巴進(jìn)行煮沸處理，使其中的血細(xì)胞和崩解組織細(xì)胞破裂，蛋白變性，病毒DNA暴露，離心后上清液可直接用于LAMP檢測(cè)，且擴(kuò)增效率與抽提DNA的相近。該處理方法免除了DNA抽提步驟，更有利于生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。

LAMP檢測(cè)靈敏度高，但易受反應(yīng)產(chǎn)物形成的氣溶膠污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。本研究采用濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)，由于采用閉管擴(kuò)增，可從源頭上控制氣溶膠污染。LAMP檢測(cè)結(jié)果可用肉眼觀察反應(yīng)液中的白色沉淀出現(xiàn)與否進(jìn)行判斷（Mori et al.，2001），但有時(shí)會(huì)存在一定誤差。染色檢測(cè)法是通過(guò)添加染料指示劑使反應(yīng)液顏色差別明顯，易于目視判定反應(yīng)結(jié)果（Tomita et al.，2008；Goto et al.，2009）。Goto等（2009）研究表明，使用金屬離子染色劑HNB對(duì)LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行染色，不但在自然光下易判斷結(jié)果，而且檢測(cè)靈敏度高于鈣黃綠素染色、接近SYBR GreenⅠ染色。本研究采用的HNB染色既能保證檢測(cè)的靈敏度，又能降低假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)，有效解決了LAMP檢測(cè)技術(shù)在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的可視化使用問(wèn)題。

本研究建立的BmNPV可視化LAMP檢測(cè)技術(shù)通過(guò)使用環(huán)引物改善了靈敏度，并縮短了反應(yīng)時(shí)間，對(duì)常見(jiàn)的家蠶病原微生物不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，且檢出率高于常規(guī)PCR，具有良好的特異性和實(shí)用性，采用HNB染色的結(jié)果易判定。此外，通過(guò)簡(jiǎn)化樣本處理，使操作更便捷、成本更低，適合生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)對(duì)BmNPV的快速檢測(cè)，為基層對(duì)家蠶血液型膿病的早期診斷和預(yù)防控制提供了技術(shù)支持。

4 結(jié)論

針對(duì)BmNPV建立的LAMP可視化檢測(cè)技術(shù)具有靈敏、快捷、可靠的特點(diǎn)，適合用于生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的BmNPV感染早期診斷，對(duì)及時(shí)發(fā)現(xiàn)病情并控制傳播范圍、減少病毒多角體在生產(chǎn)環(huán)境中富集、保障養(yǎng)蠶業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展具有積極作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）