曾波　張智　李再新

摘要：【目的】構(gòu)建不同周齡健康家兔及腹瀉家兔腸道微生物的ERIC-PCR指紋圖譜，分析二者腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性及其差異性，為優(yōu)化家兔飼養(yǎng)和疾病防治打下基礎(chǔ)。【方法】收集1～8周齡健康家兔與腹瀉家兔糞便樣本，分離腸道微生物并提取其基因組DNA，PCR擴增其16S rDNA與ERIC，構(gòu)建ERIC-PCR指紋圖譜，對不同周齡健康家兔及腹瀉家兔腸道菌群結(jié)構(gòu)進行分析?！窘Y(jié)果】腸道微生物迅速在1周齡仔兔腸道中定植且總量達最高值，其后不斷減少，5周齡后總量趨于穩(wěn)定，且1周齡仔兔與5周齡后（斷奶后）家兔的腸道微生物總量間均存在顯著差異（P<0.05）。隨著周齡的增加，腸道微生物ERIC條帶特征發(fā)生明顯變化，各周齡出現(xiàn)了不同的特征性ERIC條帶。與同一周齡健康家兔相比，腹瀉家兔腸道微生物ERIC條帶明顯減少，條帶特征存在明顯差異，菌群多樣性低于健康家兔?！窘Y(jié)論】隨著周齡的增加，健康家兔的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生明顯變化。與同一周齡健康家兔相比，腹瀉家兔腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)明顯改變，多樣性明顯降低，且出現(xiàn)健康家兔中未出現(xiàn)過的優(yōu)勢菌群，進一步證明腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)與家兔生長發(fā)育和腹瀉存在關(guān)聯(lián)性。

關(guān)鍵詞： 家兔；腸道微生物；菌群結(jié)構(gòu)；ERIC-PCR；腹瀉

中圖分類號： S858.291 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）01-0139-05

Abstract：【Objective】The present study was conducted to construct intestinal microbial ERIC-PCR fingerprint of healthy rabbits and diarrheal rabbits and analyze structural difference between their intestinal microbial communities， in order to lay a foundation for optimizing rabbit feeding and disease control. 【Method】Intestinal microbes were isolated from fecal samples which was collected from 1-8 week-old healthy rabbits and diarrheal rabbits， and their genomic DNA was extracted. Then 16S rDNA and ERIC were amplified by PCR technique. ERIC-PCR fingerprint was further constructed to analyze structure of intestinal microbial community in different week-old healthy rabbits and diarrheal rabbits. 【Result】Intestinal microbes colonized quickly in 1 week-old rabbits， and total quantity of intestinal microbes reached the highest level， thereafter total quantity of intestinal microbes began to reduce， and became stable after 5 weeks old. And there were some significant differences in total quantity of intestinal microbes between 1 week-old rabbits and more than 5 week-old（after weaning） rabbits（P<0.05）. Characteristic ERIC bands changed obviously with increase of week age， different characteristic ERIC bands were found in different week-old rabbits. Compared with age-matched healthy rabbits， number of ERIC bands in diarrheal rabbits was reduced markedly， and characteristics of ERIC bands were also markedly different， and diversity of intestinal microbial communities in healthy rabbits were lower than that in diarrheal rabbits. 【Conclusion】With increase of week age， structure and diversity of intestinal flora in healthy rabbits change obviously. Compared with age-matched healthy rabbits， structure of intestinal microbial communities of healthy rabbit changes obviously， and diversity is also reduced， but dominant bacterial communities which do not appear in healthy rabbits are found in diarrheal rabbits. It is suggested that structure of intestinal microbial communities is significantly correlated with development and diarrhea of rabbits.

Key words： rabbit； intestinal microbiotas； microbial community structure； ERIC-PCR； diarrhea

0 引言

【研究意義】腸道微生物在宿主消化、免疫和抗病等方面發(fā)揮著不可替代的作用，腸道菌群失調(diào)可能導致自身免疫性疾病、肥胖、過敏反應(yīng)等疾?。ㄍ晷暮土河海?014），尤其是腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變與人和動物腹瀉存在關(guān)聯(lián)性（劉開朗等，2007；李琳和李巖，2014；童雨心和梁迎春，2014）。因此，了解腸道菌群結(jié)構(gòu)變化與家兔生長發(fā)育、罹患腹瀉的關(guān)聯(lián)性對家兔的飼養(yǎng)和疾病防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】傳統(tǒng)的微生物分類鑒定方法主要基于其表型特征，如生長特性、生理生化、血清型等（Popoff et al.，1998；吳清平等，2006；張國林和景榮先，2014）。但受動物年齡、食物、斷奶和健康狀況等因素的影響，腸道微生物菌群組成極易發(fā)生變化，且絕大多數(shù)腸道微生物至今仍缺乏有效的分離培養(yǎng)方法，致使傳統(tǒng)的分類鑒定方法在分析腸道菌群結(jié)構(gòu)方面存在一定的局限性（湯文杰等，2016）。目前，一些基于微生物遺傳物質(zhì)分類鑒定的分子生物學方法，如ERIC-PCR、DGGE、RAPD-PCR、RFLP及復(fù)合PCR等（Cao et al.，2008；楊柳等，2011；伊麗娜等，2014；范志宇等，2015；Zeinali et al.，2015），有效規(guī)避了傳統(tǒng)分類鑒定方法的不足。其中，ERIC-PCR是根據(jù)ERIC高度保守序列設(shè)計引物，以基因組DNA為模板進行PCR擴增，構(gòu)建DNA指紋圖譜，并通過構(gòu)建的ERIC-PCR指紋圖譜，建立快速檢測的分子分型平臺，具有靈敏度高、重復(fù)性好、可靠性強、省時省力等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于微生物分類鑒定、環(huán)境微生物動態(tài)分析等研究領(lǐng)域（Peng et al.，2007；Cao et al.，2008）。胡波等（2016）采用ERIC-PCR分析流行性腹脹家兔的腸道菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患病家兔腸道微生物多樣性降低，且存在特定的腸道優(yōu)勢菌群。李云飛等（2016）通過構(gòu)建ERIC-PCR指紋圖譜并用于家兔糞便中微生物的鑒定分析，從而建立了一種可快速分析檢測家兔腸道菌群結(jié)構(gòu)變化的方法?！颈狙芯壳腥朦c】雖然ERIC-PCR已應(yīng)用于家兔腸道微生物DNA指紋圖譜的構(gòu)建，但鮮見運用該技術(shù)進行不同周齡家兔及腹瀉家兔腸道微生物DNA指紋圖譜構(gòu)建并比較二者腸道菌群結(jié)構(gòu)差異的文獻報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】運用ERIC-PCR構(gòu)建家兔腸道微生物DNA指紋圖譜，并分析腸道微生物結(jié)構(gòu)在低齡家兔生長發(fā)育過程中的變化，比較健康家兔和腹瀉家兔腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異，確定與家兔生長發(fā)育和腹瀉相關(guān)的特征性腸道菌群，為探究家兔腸道微生物結(jié)構(gòu)變化與其生長發(fā)育和健康狀況間的關(guān)聯(lián)性提供參考，為優(yōu)化家兔飼養(yǎng)和疾病防治打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試家兔由四川自貢市某家兔場提供。DNA Stool Mini Kit購自QIAamp公司；dNTP、pfu酶、PCR Buffer、DNA Marker等購自Thermo公司；50×TAE購自南京美博生物科技有限公司；Gelview核酸染料購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。16S rDNA和ERIC的特異性引物均由華大基因科技有限公司合成。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 引物設(shè)計與合成 參照Versalovic等（1991）的方法設(shè)計ERIC特異性引物，上游引物ERIC-F：5'-

ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAA-3'；下游引物ERIC-

R：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'。細菌16S rDNA引物為通用引物，上游引物27F：5'-AGAGTTTG

ATCCTGGCTCAG-3'；下游引物1492R：5'-TACGGCT

ACCTTGTTACGACTT-3'。

1. 2. 2 糞便收集 選取6只剛出生的仔兔（來自不同母兔），前4周與其母兔同窩喂養(yǎng)母乳兼飼料，第5周后斷奶，飼喂飼料至第8周。從母乳喂養(yǎng)1周后，每周收集每只仔兔糞便6 g至8周齡。另外，選取4只7～8周齡未使用過抗生素類藥物的腹瀉家兔，在出現(xiàn)腹瀉的第2 d收集其糞便。

1. 2. 3 腸道微生物分離 在收集的不同周齡健康家兔及腹瀉家兔糞便中分別加入60.0 mL無菌PBS，重懸糞便中的微生物，過濾除去大顆粒雜質(zhì)，再用60.0 mL無菌PBS沖洗濾渣，合并兩次濾液至滅菌的離心管中，800 r/min離心5 min，取上清液，10000 r/min離心5 min，棄上清液，用1.0 mL無菌PBS重懸沉淀，移至1.5 mL離心管中，10000 r/min離心5 min，棄上清液，即得家兔腸道微生物初提物，稱其質(zhì)量，并加入30%甘油于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 4 基因組DNA提取 分別取同一周齡6只仔兔腸道初提物各2 mg，充分混合后，參照DNA提取試劑盒說明提取腸道微生物的基因組DNA，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 2. 5 PCR擴增 測定基因組DNA濃度，將同一周齡健康家兔基因組DNA等量混合，以5 ng混合基因組DNA為模板，分別PCR擴增16S rDNA和ERIC。16S rDNA擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 30 s，進行32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。ERIC擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 8 min，進行35個循環(huán)；65 ℃延伸18 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1. 3 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 17.0對兔腸道微生物的初提物質(zhì)量進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 健康家兔腸道微生物的分離結(jié)果

從收集得到的1～8周齡健康家兔糞便樣品中分離腸道微生物，結(jié)果如圖1所示，每克家兔糞便的腸道微生物初提物中，微生物總量隨周齡的增長整體上呈減少趨勢，1周齡仔兔腸道微生物的總量最高，其后不斷減少，5周齡后總量趨于穩(wěn)定，且1周齡仔兔與5周齡后（斷奶后）家兔的腸道微生物總量間均存在顯著差異（P<0.05）。

2. 2 家兔腸道微生物基因組DNA的提取結(jié)果

家兔腸道微生物基因組DNA的提取結(jié)果如圖2所示，從不同周齡家兔腸道微生物初提物中均能提取到條帶較單一且完整的基因組DNA。

2. 3 家兔腸道微生物16S rDNA的PCR擴增結(jié)果

以提取的基因組DNA為模板，PCR擴增16S rDNA，結(jié)果如圖3所示，擴增條帶大小與預(yù)期一致，表明提取的基因組DNA可作為模板進行下一步的ERIC- PCR分析。

2. 4 家兔腸道微生物ERIC-PCR指紋圖譜分析結(jié)果

通過構(gòu)建ERIC-PCR指紋圖譜并分析家兔腸道微生物種類菌群結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如圖4所示。家兔ERIC豐量隨周齡的增加而發(fā)生明顯變化，No.1 ERIC條帶在1周齡家兔中豐量最高，3周齡后逐漸減少，在8周齡家兔中幾乎檢測不到；No.2 ERIC條帶在1周齡家兔中幾乎檢測不到，2周齡后其豐量急劇升高，6周齡后有所下降并趨于穩(wěn)定，且在腹瀉家兔中亦可檢測到；No.3 ERIC條帶豐量從1周齡逐漸升高，4周齡達最高值，之后急劇降低；No.4 ERIC條帶從5周齡才出現(xiàn)，之后其豐量持續(xù)增加。

將健康家兔與腹瀉家兔的ERIC條帶進行比較，結(jié)果（圖4和圖5）發(fā)現(xiàn)，與同一周齡健康家兔相比，腹瀉家兔腸道微生物的ERIC條帶數(shù)目明顯減少，除No.2 ERIC條帶被檢出外，腹瀉家兔與健康家兔ERIC條帶特征無一致性，且腹瀉家兔間ERIC條帶一致性也較差。此外，從腹瀉家兔中均檢出多條大小明顯低于No.2 ERIC的條帶（No.5 ERIC條帶），但條帶在健康家兔中幾乎檢測不到。

3 討論

自Versalovic等（1991）首次設(shè)計了ERIC的特異性引物并用于分析細菌基因組DNA指紋圖譜以來，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于微生物分類鑒定研究，如羅永久等（2014）研究發(fā)現(xiàn)同一食性動物的腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜條帶相似性較不同食性動物間更高，表明食物來源對腸道菌群結(jié)構(gòu)有較大影響；劉毅等（2015）利用ERIC-PCR能快捷準確地區(qū)分不同菌株系。上述研究證實，ERIC-PCR同樣可用于分析家兔腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)。本研究初步構(gòu)建了不同周齡健康家兔及腹瀉家兔腸道微生物的ERIC-PCR指紋圖譜，并對其腸道菌群結(jié)構(gòu)變化進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自家兔出生后微生物在其腸道迅速定植，微生物總量達峰值，且菌群多樣性豐富，隨著家兔周齡的增加，微生物總量和菌群生物多樣性逐漸下降，部分特征性腸道菌群定植率逐漸降低，甚至消失，其生理功能作用有待深入研究。當仔兔斷奶后，其腸道微生物ERIC條帶發(fā)生改變，表明菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，由此推測從母乳過渡到飼料喂養(yǎng)對家兔腸道菌群結(jié)構(gòu)有較大影響。但某些微生物在腸道定植后，便永久寄居，即使在腹瀉家兔中仍能檢出。由此推測，這些微生物可能與養(yǎng)分的吸收代謝等過程相關(guān)聯(lián)，為家兔腸道的看家菌群。8周齡家兔腸道菌群出現(xiàn)較明顯的特征性ERIC條帶，表明該周齡家兔腸道已形成了成年家兔相關(guān)的優(yōu)勢菌群。李云飛等（2016）在健康德國花巨兔腸道菌群的ERIC-PCR指紋圖譜中發(fā)現(xiàn)了450 bp雙歧桿菌特征性條帶，但在本研究構(gòu)建的ERIC-PCR指紋圖譜中并未發(fā)現(xiàn)該條帶。在后續(xù)研究中，應(yīng)純化ERIC特征性條帶并對其進行測序分析，且分離鑒定出對應(yīng)的家兔腸道微生物，并分析微生物在家兔生長發(fā)育過程中的作用。

目前，已有大量研究證明，腸道菌群結(jié)構(gòu)變化與宿主發(fā)生腹瀉存在極顯著相關(guān)（宋玉財?shù)龋?013；劉海燕等，2014）。本研究通過對比腹瀉家兔與健康家兔腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者在家兔腸道菌群結(jié)構(gòu)上存在明顯差異。除了腹瀉家兔腸道微生物總量和ERIC條帶數(shù)目明顯減少，ERIC條帶特征不同于健康家兔，其ERIC條帶大小明顯偏低等現(xiàn)象外，還出現(xiàn)一些大小低于No.2 ERIC的條帶，如No.5 ERIC條帶，但在健康家兔中幾乎檢測不到。此外，本研究通過比對腹瀉家兔個體間的ERIC-PCR指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)腹瀉家兔個體間腸道菌群結(jié)構(gòu)存在一定差異，表明腹瀉家兔腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，出現(xiàn)了新的外來優(yōu)勢菌群，與胡波等（2016）的研究結(jié)果相近。說明腸道菌群結(jié)構(gòu)與家兔腹瀉密切相關(guān)，但其致病性有待進一步研究。

4 結(jié)論

隨著周齡的增加，健康家兔的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生明顯變化。與同一周齡健康家兔相比，腹瀉家兔腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)明顯改變，多樣性明顯降低，且出現(xiàn)健康家兔中未出現(xiàn)過的優(yōu)勢菌群，進一步證明腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)與家兔生長發(fā)育和腹瀉存在關(guān)聯(lián)性。

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（責任編輯 陳 燕）