李俊輝　羅燕秋　鐘雅詩(shī)　黃怡　黃榮蓮　王慶恒　鄧岳文

摘要：【目的】探討近交對(duì)馬氏珠母貝生長(zhǎng)性狀、遺傳結(jié)構(gòu)及礦化基因表達(dá)的影響，闡明近交引起子一代性狀退化的遺傳原理，為貝類(lèi)品種培育提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳?xún)蓚€(gè)黃殼色全同胞家系（M和N）為親本，按照因子設(shè)計(jì)構(gòu)建4個(gè)家系組合（F1：M1♀×M1♂；F2：M1♀×N1♂；F3：N1♀×M1♂；F4：N1♀×N1♂），比較4個(gè)家系成貝生長(zhǎng)性狀差異，利用9對(duì)SSR引物分析其遺傳多樣性，并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)家系間礦化基因nacrein、pearlin和pif177的表達(dá)差異?！窘Y(jié)果】4個(gè)家系間的平均殼長(zhǎng)、平均殼高、平均殼寬、平均體重和平均殼重存在明顯差異，且近交家系（F1和F4）的平均殼長(zhǎng)、平均殼高、平均殼寬、平均體重和平均殼重均小于雜交家系（F2和F3），其生長(zhǎng)性狀退化率（ID）為11.7%～29.4%。家系F1、F2、F3和F4的平均觀測(cè)雜合度分別為0.2525、0.3116、0.3178和0.2752，平均期望雜合度分別為0.3451、0.3822、0.4005和0.3549，平均多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.4591、0.5389、0.4878和0.4810。雜交家系（F2和F3）礦化基因nacrein、pearlin和pif177的相對(duì)表達(dá)量均高于近交家系（F1和F4），且4個(gè)家系的生長(zhǎng)性狀平均值與3個(gè)礦化基因的相對(duì)表達(dá)量存在明顯正相關(guān)?！窘Y(jié)論】近交能導(dǎo)致馬氏珠母貝生長(zhǎng)性狀、遺傳多樣性及礦化基因表達(dá)量明顯降低，因此制定馬氏珠母貝育種方案時(shí)應(yīng)構(gòu)建合理的交配組合系統(tǒng)，防止因近交導(dǎo)致性狀退化與遺傳多樣性指標(biāo)降低而影響育種進(jìn)程。

關(guān)鍵詞： 馬氏珠母貝；近交；生長(zhǎng)性狀；遺傳多樣性；礦化基因

中圖分類(lèi)號(hào)： S968.316 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）01-0132-07

Abstract：【Objective】The effects of inbreeding on growth traits， genetic diversity and biomineraliazation gene expression were evaluated with an aim to clarify genetics principle of trait degradation in first filial generation caused by inbreeding and provide valuable information for breeding shellfish varieties. 【Method】Two yellow colored full-sib families（M and N） were taken as parents， four family combinations（F1， M1♀×M1♂； F2， M1♀×N1♂； F3， N1♀× M1♂； F4， N1♀×N1♂）were constructed based on factorial design. Growth traits of the shells at adult stage from the four families were compared. Genetic diversity of the four families were analyzed by nine pairs of SSR primers. The expression differences among nacrein， pearlin and pif177 genes were evaluated by real-time PCR. 【Result】There were significant differences on mean shell length， mean shell height， mean shell width， mean total weight and mean shell weight among the four families（P<0.05）. Mean shell length， mean shell height， mean shell width， mean total weight and mean shell weight of inbreeding families（F1 and F4） were smaller than those of hybrid families（F2 and F3）， growth trait degradation rate（ID） was 11.7%-29.4%. The observed heterozygosity values of F1， F2， F3 and F4 were 0.2525， 0.3116， 0.3178 and 0.2752， while the expected heterozygosity values of F1， F2， F3 and F4 were 0.3451， 0.3822， 0.4005 and 0.3549. Average polymorphism information content（PIC） of F1， F2， F3 and F4 were 0.4591， 0.5389， 0.4878 and 0.4810. The expressions of biomineraliazation genes nacrein， pearlin and pif177 in hybrid families（F2 and F3） were higherer than those in inbreeding families（F1 and F4）. There was positive correlation between mean growth traits and relative expressions of the three biomineraliazation genes.【Conclusion】Inbreeding can lead to decrease in growth traits， genetic diversity and gene expression in P. fuctada martensii. Therefore， rational mating combination system should be established when formulating P. fuctada martensii breeding plan. In this way， traits degradation and genetics diversity indexes decreasing caused by inbreeding can be prevented， and breeding process is not to be infected.

Key words： Pinctada fuctada martensii； inbreeding； growth trait； genetic diversity； biomineraliazation gene

0 引言

【研究意義】馬氏珠母貝（Pinctada fuctada martensii）是我國(guó)南方重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類(lèi)，主要用于生產(chǎn)6.0～8.0 mm的有核珍珠（王大鵬等，2011）。20世紀(jì)50年代馬氏珠母貝人工育苗獲得成功，珍珠產(chǎn)業(yè)在21世紀(jì)初達(dá)到發(fā)展高峰，年產(chǎn)珍珠20 t左右。然而，近年來(lái)馬氏珠母貝珍珠產(chǎn)量與質(zhì)量均呈明顯的下滑趨勢(shì)，其主要原因在于養(yǎng)殖群體性狀退化及養(yǎng)殖海區(qū)環(huán)境污染。馬氏珠母貝的成貝親本懷卵量高，一般育苗過(guò)程中會(huì)從養(yǎng)殖群體選取少量親本進(jìn)行繁殖（鄧岳文等，2008），因加速近親配子結(jié)合機(jī)會(huì)而導(dǎo)致養(yǎng)殖群體出現(xiàn)貝體變小、性早熟、珍珠質(zhì)分泌能力弱等性狀退化現(xiàn)象。因此，有必要通過(guò)構(gòu)建近交與雜交組合，分析近交對(duì)馬氏珠母貝的影響，為其品種培育提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近交與雜交一直是遺傳育種領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。雜交是將沒(méi)有親緣關(guān)系的個(gè)體、群體或物種進(jìn)行交配組合，其雜交子一代群體生長(zhǎng)、成活率等性狀超過(guò)雙親性狀均值的現(xiàn)象稱(chēng)為雜種優(yōu)勢(shì)。雜交育種主要是利用雜交子一代的雜種優(yōu)勢(shì)，張國(guó)范和劉曉（2006）通過(guò)地理群體定向雜交獲得的大連1號(hào)皺紋盤(pán)鮑就是一個(gè)典型的案例，其雜交子一代的成活率顯著高于親本群體。與雜交相對(duì)應(yīng)，近交是指具有親緣關(guān)系個(gè)體間的交配，近交育種的目的是培育純系，然后利用雜交優(yōu)勢(shì)。在育種材料培育過(guò)程中，近交通常導(dǎo)致其子代生理機(jī)能或繁殖能力性狀下降，稱(chēng)為近交衰退現(xiàn)象（Deng et al.，2005）。在貝類(lèi)中，已有文獻(xiàn)報(bào)道近交能降低其子代生長(zhǎng)性狀和成活率，包括美洲牡蠣（Crassostrea virginica）（Mallet and Haley，1983）、長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）（Beattie et al.，1987；Evans et al.，2004；張景曉等，2014）、歐洲大扇貝（Pecten maximus）（Beaumont and Budd，1983）、紫扇貝（Argopecten purpuratus）（Concha et al.，2011）、海灣扇貝（A. irradians）（張國(guó)范等，2003；鄭懷平等，2004；Zheng et al.，2008）、墨西哥灣扇貝（A. irradians concentricus）（Liu et al.，2011）、蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）（傅強(qiáng)等，2015）、皺紋盤(pán)鮑（Haliotis discus hannai）（Deng et al.， 2005； Kobayashi and Kijima，2010）、菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）（梁健等，2013）。但有關(guān)近交對(duì)貝類(lèi)遺傳多樣性與基因表達(dá)影響的報(bào)道相對(duì)較少（Launey and Hedgecock，2001；王宇，2011；傅強(qiáng)，2014；張嘉麗等，2015；張景曉，2015）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于本課題組的前期研究基礎(chǔ)，初步觀測(cè)到近交能導(dǎo)致馬氏珠母貝生長(zhǎng)性狀退化，但引起性狀退化的遺傳解釋尚未清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用親緣關(guān)系清晰的育種材料，構(gòu)建近交與雜交家系，從生長(zhǎng)性狀、遺傳結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)3個(gè)層面探討近交對(duì)馬氏珠母貝的影響，旨在闡明近交引起子一代性狀退化的遺傳原理，為貝類(lèi)品種培育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

從馬氏珠母貝黃殼色群體選擇親本構(gòu)建全同胞家系，按照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行苗種培育與海區(qū)養(yǎng)殖；然后又從兩個(gè)全同胞家系（M和N）選取親本，按照因子設(shè)計(jì)構(gòu)建如下組合：近交家系F1（M1♀×M1♂）、雜交家系F2（M1♀×N1♂）、雜交家系F3（N1♀× M1♂）和近交家系F4（N1♀×N1♂）。

1. 2 生長(zhǎng)性狀測(cè)量與取樣

貝齡達(dá)1.5齡時(shí)從每個(gè)家系取樣50個(gè)貝體，測(cè)量其殼長(zhǎng)、殼高、殼寬、體重與殼重。從每個(gè)家系取樣30個(gè)貝體，剪取閉殼肌，以75%酒精固定，用于遺傳多樣性分析；從每個(gè)家系取樣10個(gè)貝體，剪取閉殼肌，置于滅菌抗凍管內(nèi)，立即加入液氮保存，用于礦化基因表達(dá)量分析。

1. 3 遺傳多樣性分析

樣品DNA提取采用生工生物工程（上海）股份有限公司的Universal Genomic DNA Mini-Isolation Kit，參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。選用本課題組開(kāi)發(fā)的9對(duì)SSR引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照張嘉麗等（2015）的方法。PCR反應(yīng)體系15.0 μL，包括：DNA 2.0 μL，10×PCR Buffer（10 mmol/L）1.5 μL，dNTPs（4 mmol/L）1.0 μL，MgCl2（2.5 mmol/L）1.5 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 μ/mol）1.0 μL，引物1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 42 s，相應(yīng)退火溫度下退火50 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1. 4 礦化基因表達(dá)量分析

利用Trizol法提取樣品總RNA，超微量分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280，檢測(cè)RNA的純度和產(chǎn)量，并以1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA樣品完整性。取1.0 μg總RNA，用M-MLVRTase cDNA Synthesis Kit（Invitrogen）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。依據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)原則，運(yùn)用Primer 5.0分別設(shè)計(jì)針對(duì)礦化基因nacrein、pearlin和pif177的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（表2）。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各家系間nacrein、pearlin和pif177基因的表達(dá)差異，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。按照2-△△Ct 計(jì)算礦化基因相對(duì)表達(dá)量。

1. 5 數(shù)據(jù)分析

參考Deng等（2005）的方法計(jì)算馬氏珠母貝生長(zhǎng)性狀近交退化率（ID）：

ID（%）=（M1-M0）/M0×100

式中，M1為雜交家系性狀平均值，M0為近交家系性狀平均值。

同時(shí)，利用Popgene 32計(jì)算等位基因頻率、等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀察雜合度及期望雜合度；根據(jù)各位點(diǎn)的等位基因頻率，通過(guò)PIC-CALC計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）。利用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)各家系生長(zhǎng)性狀和礦化基因表達(dá)量的差異，并以LSD比較均值差異。

2 結(jié)果與分析

2. 1 生長(zhǎng)性狀比較結(jié)果

由表3可看出，4個(gè)家系間的平均殼長(zhǎng)、平均殼高、平均殼寬、平均體重和平均殼重存在明顯差異，且近交家系（F1和F4）的平均殼長(zhǎng)、平均殼高、平均殼寬、平均體重和平均殼重均小于雜交家系（F2和F3）。其中，家系F4的平均殼長(zhǎng)、平均殼高、平均殼寬、平均體重和平均殼重最低，均顯著低于其他3個(gè)家系（P<0.05，下同）。4個(gè)家系的生長(zhǎng)性狀退化率為11.7%～29.4%。

2. 2 遺傳多樣性比較結(jié)果

從Popgen 32處理的數(shù)據(jù)（表4）來(lái)看，本研究選用的9個(gè)微衛(wèi)星引物在4個(gè)家系中均呈多態(tài)性，每個(gè)SSR位點(diǎn)均可檢測(cè)到2～3個(gè)等位基因。家系F1、F2、F3和F4的平均有效等位基因數(shù)分別為1.5938、1.6034、1.5022和1.5698。

從表5可知，4個(gè)家系的平均觀測(cè)雜合度分別為0.2525、0.3116、0.3178和0.2752，平均期望雜合度分別為0.3451、0.3822、0.4005和0.3549，平均PIC分別為0.4591、0.5389、0.4878和0.4810。

2. 3 礦化基因相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)家系礦化基因nacrein、pearlin和pif177的表達(dá)差異，結(jié)果表明，雜交家系F2和F3礦化基因nacrein、pearlin和pif177的相對(duì)表達(dá)量均高于近交家系F1和F4（表6）。其中，以家系F4礦化基因nacrein、pearlin和pif177的相對(duì)表達(dá)量最低，均顯著低于其他3個(gè)家系。

利用SPSS 17.0計(jì)算4個(gè)家系的生長(zhǎng)性狀平均值與3個(gè)礦化基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明，4個(gè)家系的生長(zhǎng)性狀平均值與3個(gè)礦化基因的相對(duì)表達(dá)量存在明顯正相關(guān)（表7）。其中，平均殼長(zhǎng)、平均殼高、平均體重與pearlin和pif177基因相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，平均殼重與nacrein和pif177基因相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，平均殼寬與pearlin基因相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)。

3 討論

3. 1 近交對(duì)馬氏珠母貝雜交一代生長(zhǎng)性狀的影響

育種過(guò)程中常利用近交培育純系，但近交易導(dǎo)致繁殖力和生理機(jī)能相關(guān)性狀的表型值降低。張國(guó)范等（2003）通過(guò)構(gòu)建海灣扇貝近交家系和雜交家系，并對(duì)比兩個(gè)家系的生長(zhǎng)性狀，結(jié)果表明，與雜交家系相比，近交家系生長(zhǎng)緩慢，幼蟲(chóng)階段與成體階段近交退化率分別為25.9%和12.7%。鄭懷平等（2004）通過(guò)對(duì)比海灣扇貝雜交與近交家系的生長(zhǎng)性狀和成活率，結(jié)果表明，與雜交家系相比，自交家系在幼蟲(chóng)期與養(yǎng)成期的生長(zhǎng)性狀退化率分別為35.34%和21.17%，成活率分別降低25.23%和49.44%。梁健等（2013）以菲律賓蛤仔橙色全同胞家系為材料進(jìn)行近交，結(jié)果表明，橙色家系生長(zhǎng)的近交衰退率為5.38%～26.57%。本研究結(jié)果表明，馬氏珠母貝近交家系的生長(zhǎng)性狀明顯小于雜交家系，成體階段的生長(zhǎng)性狀退化率為11.7%～29.4%，與上述其他貝類(lèi)的研究結(jié)果一致。

母本效應(yīng)來(lái)源于細(xì)胞質(zhì)遺傳、母本營(yíng)養(yǎng)、母性病原物與抗體的傳遞及母子間或同胞間習(xí)性的模仿等，其中，由營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)引起的母本效應(yīng)對(duì)貝類(lèi)早期幼體生長(zhǎng)、成活率及變態(tài)均存在明顯影響（Jones et al.，1996；Deng et al.，2005）。也有研究表明，母本效應(yīng)對(duì)貝類(lèi)稚貝或成貝生長(zhǎng)均可能存在影響（Liu et al.，2005；桑士田等，2012）。本研究通過(guò)雙因子設(shè)計(jì)構(gòu)建了4個(gè)家系組合，近交家系F1與雜交家系F2具有相同母本，但二者間的生長(zhǎng)性狀差異不明顯，可能與母本效應(yīng)對(duì)生長(zhǎng)性狀的影響有關(guān)。

3. 2 近交對(duì)馬氏珠母貝雜交一代遺傳多樣性的影響

Botstein等（1980）根據(jù)PIC確定多態(tài)位點(diǎn)的豐度，當(dāng)PIC>0.50時(shí)為高度多態(tài)性位點(diǎn)，0.25近交能導(dǎo)致適合度性狀退化，目前主要有顯性假說(shuō)和超顯性假說(shuō)解釋遺傳退化機(jī)制。但兩種學(xué)說(shuō)均認(rèn)為，近交通過(guò)增加純合位點(diǎn)比例、降低雜合位點(diǎn)比例而造成近交衰退。已有研究表明，近交能降低水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖群體基因頻率變化和稀有基因缺失，遺傳多樣性指標(biāo)降低（李思發(fā)等，2005；劉宇飛等，2007；張嘉麗等，2015；張景曉，2015）。李思發(fā)等（2005）以RAPD分析團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephal）近交群體的遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)近交群體（全同胞交配組合）的多態(tài)位點(diǎn)和有效基因均低于對(duì)照群體。劉宇飛等（2007）利用20對(duì)SSR標(biāo)記分析劍尾魚(yú)（Xiphophorus helleri）RW-H近親交配家系15代的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20個(gè)位點(diǎn)中有17個(gè)位點(diǎn)呈單態(tài)位點(diǎn)。張嘉麗等（2015）利用SSR標(biāo)記比較馬氏珠母貝近交與雜交家系的遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，近交家系觀測(cè)雜合度與期望雜合度指標(biāo)均低于雜交家系。張景曉（2015）利用9對(duì)AFLP引物分析長(zhǎng)牡蠣家系遺傳多樣性，結(jié)果表明，9對(duì)引物在對(duì)照、F1（F=0.250）和F2（F=0.375）3個(gè)家系中擴(kuò)增出的位點(diǎn)總數(shù)分別為215、204和200個(gè)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為7.4、6.4和6.1個(gè)，對(duì)應(yīng)的家系平均多態(tài)位點(diǎn)比例依次為31.16%、28.43%和27.5%。本研究中，近交家系的觀測(cè)雜合度和期望雜合度指標(biāo)均低于雜交家系，進(jìn)一步說(shuō)明近交能導(dǎo)致馬氏珠母貝遺傳多樣性降低。

3. 3 近交對(duì)馬氏珠母貝雜交一代礦化基因表達(dá)的影響

生物礦化是指生物體（從細(xì)胞到整個(gè)有機(jī)體）介入礦物質(zhì)生成的過(guò)程，包括復(fù)雜的生物事件和化學(xué)事件（黃榮蓮，2016）。珍珠貝的生長(zhǎng)也是一個(gè)礦化過(guò)程，多個(gè)礦化基因及相關(guān)蛋白參與該過(guò)程，包括nacrein、pearlin、MSI60、pif177和n19等基因（Zhao et al.，2012）。馬氏珠母貝的生長(zhǎng)性狀與礦化基因表達(dá)量存在相關(guān)性。Zhang和He（2011）報(bào)道，家系F2大、中、小規(guī)格個(gè)體的貝殼基質(zhì)蛋白基因aspein、prismalin-14、n16和nacrein表達(dá)量與殼高、殼重呈顯著正相關(guān)。陳偉耀（2014）研究表明，nacrein、MSI60、pif177和n19礦化基因與馬氏珠母貝珠層厚度呈明顯正相關(guān)。楊創(chuàng)業(yè)等（2015）通過(guò)比較投喂不同餌料對(duì)馬氏珠母貝生長(zhǎng)與礦化基因的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)投喂混合餌料組具有較高的殼寬與殼高增長(zhǎng)率，并證實(shí)生長(zhǎng)率與nacrein、pif177礦化基因表達(dá)量呈正相關(guān)。上述研究結(jié)果均表明，礦化基因表達(dá)量與馬氏珠母貝生長(zhǎng)性狀存在正相關(guān)。

近交除了能導(dǎo)致生長(zhǎng)性狀與遺傳多樣性的降低外，還可導(dǎo)致基因表達(dá)量變化。傅強(qiáng)（2014）研究報(bào)道，蝦夷扇貝自交家系的下調(diào)基因顯著富集在與生長(zhǎng)顯著相關(guān)的EGF家族基因。Shi和He（2014）利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)篩選馬氏珠母貝家系內(nèi)大、小規(guī)格個(gè)體基因差異，并選取34個(gè)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其中19個(gè)基因表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。本研究通過(guò)比較馬氏珠母貝近交與雜交家系礦化基因nacrein、pearlin和pif177的表達(dá)量，結(jié)果表明，近交家系礦化基因的相對(duì)表達(dá)量明顯低于雜交家系，與近交家系生長(zhǎng)緩慢相吻合，即礦化基因也可作為生長(zhǎng)性狀評(píng)價(jià)指標(biāo)。

4 結(jié)論

近交能導(dǎo)致馬氏珠母貝生長(zhǎng)性狀、遺傳多樣性及礦化基因表達(dá)量明顯降低，因此制定馬氏珠母貝育種方案時(shí)應(yīng)構(gòu)建合理的交配組合系統(tǒng)，防止因近交導(dǎo)致性狀退化與遺傳多樣性指標(biāo)降低而影響育種進(jìn)程。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）