林春花 徐軒 戈玉琪 牟保輝 劉文波 繆衛(wèi)國(guó) 鄭服叢

摘 要 炭疽病是橡膠樹(shù)上一種重要的葉部病害，主要病原有膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌。為了解中國(guó)各植膠區(qū)炭疽菌對(duì)咪鮮胺的敏感性，采用生長(zhǎng)速率法室內(nèi)測(cè)定來(lái)自海南、云南、廣東和廣西4?。▍^(qū)）22株橡膠樹(shù)膠孢炭疽病菌和15株尖孢炭疽菌對(duì)咪鮮胺的敏感性。結(jié)果表明：供試的37株橡膠炭疽病菌菌株對(duì)咪鮮胺的EC50值為0.022 0～0.272 1 mg/L，平均為（0.061 7 ±0.055 4）mg/L，EC50最大值是最小值的12.5倍。其中89.2%參試菌株的EC50值介于0～0.100 0 mg/L。根據(jù)成組t檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，目前中國(guó)4個(gè)植膠區(qū)的2種橡膠炭疽病菌對(duì)咪鮮胺敏感性無(wú)明顯差異。除了來(lái)自海南和云南地區(qū)的尖孢炭疽菌有顯著性差異外，其他來(lái)自不同省份的膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌對(duì)咪鮮胺敏感性均無(wú)明顯差異。研究顯示中國(guó)橡膠炭疽菌對(duì)咪鮮胺仍具有較高的敏感性，但菌株間敏感性有一定的差異，存在一定的潛在抗性風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞 橡膠樹(shù)；膠孢炭疽菌；尖孢炭疽菌；咪鮮胺；敏感性

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Comparison of Sensitivity Between Two Colletotrichum Species from Hevea brasiliensis to Prochloraz in China

LIN Chunhua， XU Xuan， GE Yuqi， MOU Baohui， LIU Wenbo， MIAO Weiguo*， ZHENG Fucong*

College of Environment and Plant Protection， Hainan Universtity/Key Laboratory of Protection and

Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Colletotrichum gloeosporioides and C. acutatum have been reported as the main pathogens of the rubber anthracnose， which is one of the main leaf diseases of rubber tree in China. Twenty-two isolates of C. gloeosporioides and 15 isolates of C. acutatum were isolated from diseased Hevea brasiliensis collected from 4 different provinces in China. The sensitivity of these isolates to prochloraz was determined by the mycelium growth rate method. The results indicated that the EC50 values of the 37 isolates ranged from 0.022 0 to 0.272 1 mg/L， with an average value of （0.061 7±0.055 4）mg/L， and the maximum EC50 value was 12.5 times as much as the minimum. Among them， the EC50 value of 33 isolates（89.2%）was from 0 to 0.100 0 mg/L. There were no significant difference between the average EC50 value of C. gloesporioides and C. acutatum to prochloraz in total. Except for the difference observed in the C. acutatum isolates between Hainan and Yunnan， there were no significant difference between the average EC50 values of the isolates from different provinces. The results indicated high sensitivity of the two Colletotrichum species to prochloraz in China， however， the potential prochloraz-resistant risk should be paid attention due to considerable variation in sensitivity to prochloraz among the isolates of Colletotrichum spp. from Hevea brasiliensis.

Key words Hevea brasiliensis； Colletotrichum gloeosporioides； C. acutatum； prochloraz； sensitivity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.019

由炭疽菌（Colletotrichum spp.）引起的炭疽病是世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)生最為普遍、危害較重的植物病害[1]。炭疽菌種類繁多，遺傳多態(tài)性豐富。橡膠樹(shù)炭疽病是橡膠樹(shù)重要葉部病害之一，在中國(guó)植膠墾區(qū)普遍發(fā)生，其病原菌主要有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）和尖孢炭疽菌（C. acutatum Simmons）[2-3]。這2種炭疽菌為復(fù)合種，種間及種下遺傳多態(tài)性豐富，二者在生物學(xué)特性、菌落形態(tài)和保守基因序列上也都存在較大差異[4-6]。也有研究結(jié)果顯示，二者在對(duì)藥劑的敏感性存在差異[7]，如云南橡膠樹(shù)2種炭疽病菌對(duì)咪鮮胺、多菌靈、甲基托布津敏感性有顯著性差異，膠孢炭疽菌顯著高于尖孢炭疽菌[7]。

咪鮮胺是屬麥角甾醇生物合成脫甲基抑制劑類（DMIs）殺菌劑，通常被列為中度抗藥性風(fēng)險(xiǎn)藥劑[8]。長(zhǎng)期使用單一藥劑，病菌對(duì)藥劑的敏感性可能降低，甚至出現(xiàn)抗藥菌株。在水稻上已監(jiān)測(cè)到高抗咪鮮胺的水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）菌株[9-10]。咪鮮胺對(duì)炭疽病菌也具有很好的防治效果，在各種炭疽病的防治上廣泛使用。目前對(duì)來(lái)自田間的芒果、葡萄、草莓、柑橘等炭疽病菌進(jìn)行咪鮮胺敏感性測(cè)定，結(jié)果均顯示菌株間對(duì)咪鮮胺的敏感性略有不同，但未見(jiàn)抗藥性菌株[11-14]。

菌株來(lái)源不同，對(duì)藥劑的敏感性可能不同。前人已報(bào)道橡膠炭疽菌對(duì)咪鮮胺的敏感性，但其供試菌株來(lái)源僅局限在單省份，如蔡志英等[7]比較分析了云南1株膠孢炭疽菌和1株尖孢炭疽菌形態(tài)及對(duì)咪鮮胺、多菌靈和甲基托布津等6種藥劑的敏感性，結(jié)果顯示尖孢炭疽菌對(duì)這些藥劑的敏感性低于膠孢炭疽菌；曹學(xué)仁[15]對(duì)來(lái)自海南的23株膠孢炭疽菌和20株尖孢炭疽菌進(jìn)行了多菌靈和咪鮮胺的敏感性測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尖孢炭疽菌對(duì)多菌靈的敏感性要顯著低于膠孢炭疽菌，但二者對(duì)咪鮮胺的敏感性無(wú)顯著差異。至今未見(jiàn)來(lái)自不同省份橡膠炭疽菌菌株對(duì)咪鮮胺敏感性的比較研究，也未見(jiàn)廣東和廣西兩?。▍^(qū)）橡膠炭疽菌對(duì)咪鮮胺敏感性的報(bào)道。本研究首次用來(lái)自中國(guó)4省（區(qū)）的2種橡膠樹(shù)炭疽菌作為供試菌，測(cè)定其對(duì)咪鮮胺敏感性，為更全面了解國(guó)內(nèi)植膠區(qū)橡膠樹(shù)炭疽菌對(duì)咪鮮胺敏感性現(xiàn)狀及病害科學(xué)防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株的分離和鑒定 于2014年12月～2015年2月間在海南、云南、廣東和廣西橡膠四墾區(qū)隨機(jī)采集炭疽病葉帶回實(shí)驗(yàn)室，采用常規(guī)植物病理學(xué)方法進(jìn)行病原菌分離和致病力測(cè)定。將各菌株利用科赫氏法則測(cè)定顯示具有致病力，并通過(guò)分生孢子形態(tài)和基于rDNA-ITS、ACT、GAPDH和CHS-1分析進(jìn)行菌種鑒定[16]。供試菌株的來(lái)源地及菌株鑒定信息見(jiàn)表1，含22株膠孢炭疽菌和15株尖孢炭疽菌。

1.1.2 供試藥劑 供試藥劑為97%咪鮮胺原藥，由海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉17 g，純凈水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 含藥培養(yǎng)基的配置 將97%咪鮮胺原藥用丙酮配制為0.2 mg/mL母液，備用。向融化的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中添加不同體積的咪鮮胺母液，配置成咪鮮胺藥劑質(zhì)量濃度為2、0.5、0.125、0.031 25、0.007 81 mg/L濃度梯度含藥培養(yǎng)基。

1.2.2 橡膠炭疽病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性測(cè)定 采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定炭疽病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性。將供試菌株在28 ℃下培養(yǎng)4～5 d，從菌落邊緣切取直徑約6 mm的菌餅，移接至含藥PDA平板中央，帶菌絲面朝下接觸培養(yǎng)基，于28 ℃下培養(yǎng)4 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理濃度設(shè)3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率，將藥劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，抑制率轉(zhuǎn)換為機(jī)率值作為縱坐標(biāo)，用最小二乘法建立毒力回歸方程y=ax+b，把y=5（抑制率為50%的機(jī)率值）代入毒力方程求出x，再對(duì)x進(jìn)行反對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，計(jì)算有效抑制中濃度EC50值。利用SAS軟件的成組t檢驗(yàn)比較2種炭疽菌及來(lái)源不同省區(qū)的炭疽菌對(duì)咪鮮胺的敏感性是否具有顯著性差異。其中計(jì)算公式如下：生長(zhǎng)抑制率=[（對(duì)照菌落凈生長(zhǎng)量-處理菌落凈生長(zhǎng)量）/對(duì)照菌落凈生長(zhǎng)量]×100%；菌落凈生長(zhǎng)量/mm=菌落直徑-菌餅直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠炭疽病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性分析

參試菌株對(duì)咪鮮胺毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50值見(jiàn)表2和表3。 所有參試菌株對(duì)咪鮮胺的EC50值介于0.022 0～0.272 1 mg/L，平均值為（0.061 7±0.055 4）mg/L， EC50最大值是最小值的12.5倍。其中，膠孢炭疽菌EC50值介于0.022 0～0.272 1 mg/L，平均值為（0.072 9±0.069 8）mg/L；尖孢炭疽菌EC50值介于0.028 4～0.058 2 mg/L，平均值為（0.045 1±0.009 7）mg/L；總體來(lái)說(shuō)，從EC50值看，二者對(duì)咪鮮胺的敏感性水平相當(dāng)，無(wú)數(shù)量級(jí)差異，但尖孢炭疽菌對(duì)咪鮮胺的敏感性略高于膠孢炭疽菌。這表明2種病菌之間無(wú)顯著差異（t=1.53， p=0.135 6）。

從菌株來(lái)源看，來(lái)自海南的菌株EC50平均值最高，為（0.074 2±0.072 0）mg/L；來(lái)自云南的菌株EC50平均值最低，為（0.039 6±0.009 4）mg/L。在膠孢炭疽菌中，來(lái)自廣西的菌株EC50平均值最高，為（0.091 7±0.110 0）mg/L；來(lái)自云南的菌株EC50平均值最低，為（0.041 5±0.013 5）mg/L；將各省份兩兩數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示各省份間EC50值無(wú)顯著差異。在尖孢炭疽菌中，海南省與云南省尖孢炭疽菌EC50值有顯著性差異（t=4.00；p=0.016 1<0.05），其余省（區(qū)）來(lái)源的尖孢炭疽菌株EC50值無(wú)顯著性差異（p>0.05）（表3）。

2.2 橡膠炭疽病菌對(duì)咪鮮胺敏感性頻率分布

由圖1可知，在供試的37株橡膠炭疽菌中，大部分菌株的EC50介于0～0.100 0 mg/L，占總參試菌株89.2%（33/37）。其中供試的所有尖孢炭疽菌和大部分膠孢炭疽菌的EC50均介于0～0.100 0 mg/L；只有來(lái)自海南的菌株HN09、HN13、HN14和廣西的GX02大于0.100 0 mg/L。該結(jié)果表明目前中國(guó)橡膠炭疽菌對(duì)咪鮮胺仍具有較高的敏感性，但菌株間敏感性有一定差異，存在一定潛在抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。

3 討論

咪鮮胺是防治炭疽病的有效藥劑之一。自20世紀(jì)90年代開(kāi)始廣泛使用咪鮮胺以來(lái)，鮮有病原菌產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道。目前在水稻上有監(jiān)測(cè)到高抗咪鮮胺的水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）菌株[9-10]。對(duì)來(lái)自田間的芒果、葡萄、草莓、柑橘、油梨等炭疽病菌進(jìn)行對(duì)咪鮮胺敏感性測(cè)定，均未見(jiàn)抗藥性菌株[11-14，17-18]。但王小琴[19]對(duì)芒果炭疽病菌進(jìn)行室內(nèi)馴化，獲得1株在含12 mg/L咪鮮胺培養(yǎng)基能生長(zhǎng)的具有高抗的突變體株。上述研究結(jié)果說(shuō)明了炭疽菌對(duì)咪鮮胺藥劑具有較高的敏感性，在大田中咪鮮胺有很好的防治效果，但有產(chǎn)生抗藥性菌株的風(fēng)險(xiǎn)，仍需監(jiān)測(cè)大田中炭疽菌對(duì)咪鮮胺的敏感性情況。

關(guān)于中國(guó)橡膠樹(shù)炭疽菌對(duì)咪鮮胺的敏感性測(cè)定，主要見(jiàn)蔡志英等和曹學(xué)仁等的報(bào)道。蔡志英等[7]對(duì)2008年采自云南的1株膠孢炭疽菌和1株尖孢炭疽菌進(jìn)行比較，膠孢炭疽菌與尖孢炭疽菌的EC50值分別為0.020 9 mg/L和0.029 0 mg/L。曹學(xué)仁等[15]檢測(cè)了從海南省4個(gè)市縣分離獲得的43株橡膠炭疽菌對(duì)咪鮮胺的敏感性，供試菌株的EC50值分布在0.009 1～0.113 3 mg/L范圍內(nèi)，平均值為0.036 8 mg/L。本研究結(jié)果顯示海南15株供試菌EC50值范圍是0.022 8～0.272 1 mg/L，平均值為（0.074 2±0.072 0）mg/L；云南6株供試菌EC50值范圍是0.031 6～0.056 9 mg/L，平均值為（0.039 6±0.009 4）mg/L。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果[7，15]相比，EC50值雖無(wú)數(shù)量級(jí)差異，但平均值約為前人報(bào)道的2倍。

從不同采集地和植株部位得到的炭疽病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性不同，如楊石有等[20]對(duì)116株芒果炭疽病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，EC50值為0.000 8～0.073 9 mg/L，EC50最大值是最小值的92.4倍。廣東芒果炭疽菌對(duì)咪鮮胺的敏感性（尤其分離自葉片的菌株）最高[20]。至今未見(jiàn)有人測(cè)定來(lái)自廣東和廣西兩?。▍^(qū)）橡膠樹(shù)炭疽病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性，也未見(jiàn)不同省份來(lái)源的橡膠炭疽菌對(duì)咪鮮胺的敏感性比較分析。本研究獲得了廣東的7株炭疽菌和廣西的9株炭疽菌對(duì)咪鮮胺的EC50值，廣東的菌株EC50值范圍是0.032 4～0.085 9 mg/L，平均值為（0.058 6±0.018 8）mg/L；廣西的菌株EC50值范圍是0.022 0～0.218 5 mg/L，平均值為（0.057 9±0.611 0）mg/L；比較分析顯示，除了來(lái)自云南和海南的尖孢炭疽對(duì)咪鮮胺EC50有一定差異外，不同?。▍^(qū)）來(lái)源的橡膠膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌對(duì)咪鮮胺的EC50差異并不明顯。本研究中，由于有的?。▍^(qū)）菌株較少，如云南尖孢炭疽菌只有3株供試菌，因此海南和云南尖孢炭疽菌對(duì)咪鮮胺敏感性具有顯著性差異這一結(jié)果仍需進(jìn)一步增大樣品數(shù)進(jìn)行比較分析。本研究結(jié)果可在一定程度上反映中國(guó)4省（區(qū)）的橡膠炭疽菌對(duì)咪鮮胺的敏感性情況。目前中國(guó)橡膠炭疽菌對(duì)咪鮮胺仍具有較高的敏感性，但菌株間敏感性有一定的差異，存在一定的潛在抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1] 鄧緯萍， 杜 飛， 楊 敏，等. 云南葡萄炭疽病菌遺傳多樣性分析[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015， 30（2）： 173-184.

[2] 林春花， 孫董董， 韓 丹， 等. 中國(guó)橡膠樹(shù)苗圃2種炭疽病菌分子鑒定及分布分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（9）： 1 802-1 808.

[3] 張春霞， 何明霞， 李加智，等. 云南西雙版納地區(qū)橡膠炭疽病病原鑒定[J]. 植物保護(hù)， 2008， 34（1）： 103-106.

[4] Weir B S， Johnston P R， Damm U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex[J]. Studies in Mycology， 2012， 73（1）： 115-180.

[5] Damm U， Cannon P F， Woudenberg J H C， et al. The Colletotrichum acutatum species complex[J]. Studies in Mycology， 2012， 73（1）： 37-113.

[6] 張春霞， 李加智， 何明霞，等. 兩種橡膠炭疽病菌生物學(xué)特性的比較[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2008， 21（3）： 667-670.

[7] 蔡志英， 李加智， 王進(jìn)強(qiáng)， 等， 橡膠膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌對(duì)殺菌劑的敏感性測(cè)定[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008， 23（6）：787-789.

[8] 司乃國(guó)， 劉君麗， 李志念， 等. 咪鮮胺的抗菌作用及應(yīng)用[J]. 植物保護(hù)， 1999， 25（2）： 37-39.

[9] 陳夕軍， 盧國(guó)新， 童蘊(yùn)慧， 等.水稻惡苗病菌對(duì)三種浸種劑的抗性及抗藥菌株的競(jìng)爭(zhēng)力[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2007， 34（4）：425-430.

[10] 趙志華， 張錫明， 范潔茹， 等. 咪鮮胺對(duì)水稻惡苗病菌及其抗藥突變體生長(zhǎng)發(fā)育的影響[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2007， 9（3）： 251-256.

[11] 覃麗萍， 史國(guó)英， 謝 玲，等. 芒果炭疽病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性檢測(cè)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2013， 44（4）： 594-597.

[12] 鄧維萍， 楊 敏， 杜 飛. 葡萄膠孢炭疽菌對(duì)3種麥角甾醇脫甲基抑制劑類殺菌劑的敏感性[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 13（3）：245-252.

[13] 韓永超， 曾祥國(guó)， 向發(fā)云，等. 湖北省草莓炭疽病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 16（5）： 535-540.

[14] 楊 媚， 馮淑杰，何 銀. 柑橘炭疽病高效殺菌劑的篩選及抗藥性菌株的發(fā)現(xiàn)[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 34（1）： 28-31.

[15] 曹學(xué)仁， 車(chē)海彥， 楊 毅， 等. 2014年海南省橡膠炭疽病菌對(duì)多菌靈和咪鮮胺的敏感性測(cè)定[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2015， 45（6）： 626-631.

[16] 林春花， 董 瑛， 劉文波，等. 多基因序列比較分析海南橡膠樹(shù)炭疽病菌遺傳種群[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2016， 37（5）： 943-951.

[17] Kuo K C. Sensitivity of mango anthracnose pathogen， Colletotrichum gloeosporioides to the fungicide prochloraz in Taiwan[J]. Proceedings of the National Science Council Republic of China， Part B， Life Sciences， 2001， 25（3）： 174-179.

[18] Sanders G M， Korsten L. Survey of fungicide resistance of Colletrotrichum gloeosporioides from different avocado production area[J]. South African Avocado Growers Association Yearbook， 1999， 22（1）： 35-38.

[19] 王小琴. 芒果炭疽病菌對(duì)咪鮮胺的室內(nèi)抗藥性研究[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)， 2013.

[20] 楊石有， 周慧珍， 張 賀， 等. 116株芒果炭疽病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性測(cè)定[J]. 植物保護(hù)， 2015， 41（3）： 201-204.