李謙盛 趙偉 沈娟 周純亮

摘 要 以王氏唇柱苣苔（Chirita wangiana）葉片為外植體進(jìn)行組培離體快繁研究，并利用流式細(xì)胞術(shù)對組培苗進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析。結(jié)果表明：最佳初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS添加0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；最適繼代培養(yǎng)基為MS添加0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基添加0.5 mg/L IBA和15 g/L蔗糖，所有生根培養(yǎng)基獲得的組培苗移栽馴化成活率達(dá)到92%以上。組織學(xué)切片檢測表明，王氏唇柱苣苔葉片為外植體所形成芽體均為器官發(fā)生方式形成。流式細(xì)胞術(shù)檢測表明，組培苗倍性沒有變化，基因組大小與母本相比僅發(fā)生了1.86%的減少；染色體數(shù)目為2n=36，跟母本一致，植株形態(tài)特征上也無變異。研究結(jié)果可為王氏唇柱苣苔的園藝應(yīng)用快速提供大量遺傳穩(wěn)定的種苗。

關(guān)鍵詞 王氏唇柱苣苔；組織培養(yǎng)；流式細(xì)胞術(shù)；染色體數(shù)

中圖分類號 Q944.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

In vitro Rapid Propagation of Chirita wangiana

and Genetic Stability

LI Qiansheng*， ZHAO Wei， SHEN Juan， ZHOU Chunliang

School of Ecology，Shanghai Institute of Technology， Shanghai 201418， China

Abstract In vitro rapid propagation of Chirita wangiana using the leaf section as the explant was studied，and the genetic stability of the regenerated plantlets was analyzed by flow cytometry and chromosome number. The results showed that the most optimal bud induction medium was MS medium supplemented with 0.5 mg/L 6-BA and 0.1 mg/L NAA； the suitable subculture medium was MS medium with 0.5 mg/L 6-BA and 0.05 mg/L NAA； 1/2 MS medium supplemented with 15 g/L sucrose and 0.5 mg/L IBA was suitable for rooting. Histological investigation revealed that the buds and plantlets regenerated through organogenesis. Ploidy investigation by flow cytometry showed that there was no ploidy variation among the regenerated plantlets，though there was only a 1.86% decrease in the genome size. Both the mother plant and in vitro regenerated plantlets had the same chromosome numbers（2n=36）and unchanged morphological characteristics. The results could be used for large scale rapid propagation of genetic stable seedlings of C. wangiana in horticultural application.

Key words Chirita wangiana； tissue culture； flow cytometry； chromosome number

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.018

唇柱苣苔屬（Chirita Buch.-Ham. Ex D. Don）為苦苣苔科（Gesneriaceae）重要野生花卉，約140種，分布于不丹、中國南部、印度、尼泊爾、印度尼西亞、緬甸、馬來西亞、泰國、越南等地，中國有99種[1]。唇柱苣苔屬植物花葉俱美，條件適宜可四季開花，十分耐陰，適應(yīng)性強(qiáng)，是良好的室內(nèi)觀賞花卉，也可作為花壇、花境和盆景應(yīng)用，唇柱苣苔屬植物在觀賞方面的巨大潛力和價(jià)值越來越被園藝界所重視[2-3]。

王氏唇柱苣苔（Chirita wangiana Z. Y. Li）為唇柱苣苔屬多年生草本植物，具根狀莖，葉片厚紙質(zhì)，橢圓形或卵狀橢圓形，2～4×1.4～3.5 cm，蓮座葉，葉片被稀疏絨毛；聚傘花序1～3朵，花序梗長4～4.5 cm，連同花梗被紫色短柔毛；苞片2（～3），常對生；花萼5裂，花冠長3～3.5 cm，白色，內(nèi)面具紫色斑紋，花期7月，產(chǎn)于廣西融安縣[1]。王氏唇柱苣苔株型優(yōu)美，葉色翠綠，十分耐陰，可作為極佳的室內(nèi)盆花材料，與其它唇柱苣苔屬植物一樣在觀賞方面的巨大潛力和價(jià)值越來越被園藝界所重視[2-3]。

唇柱苣苔屬植物人工繁殖可以通過種子、扦插、分株和組織培養(yǎng)進(jìn)行。種子繁殖受到種源和發(fā)芽率的限制，且幼苗生長較慢；扦插運(yùn)用于具有肥厚革質(zhì)、硬質(zhì)葉片的種類效果較好[4]。如葉片為革質(zhì)的園藝雜交品種卡柱苣苔（Chirita‘Kazu）葉片可進(jìn)行分段式扦插，成活率高[5]。而葉片紙質(zhì)或草質(zhì)的壽城唇柱苣苔（Chirita shouchengensis）和心葉唇柱苣苔（Chirita cordifolia）扦插的生根率較低，分別只有69%和40%[6]，利用扦插繁殖這類唇柱苣苔受到一定限制。

建立高效穩(wěn)定的外植體離體再生體系，可為苦苣苔科植物的園藝開發(fā)奠定基礎(chǔ)；同時(shí)，通過組織培養(yǎng)建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，可以開展利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行改良育種[7]。唇柱苣苔屬組織培養(yǎng)有的以種子作為外植體消毒后進(jìn)行無菌播種，如崀山唇柱苣苔（Chirita langshanica）[8]；也有以花梗為外植體的，如尖萼唇柱苣苔（Chirita pungentisepala）[9]、三苞唇柱苣苔（Chirita tribracteata）[10]、黃花牛耳朵（Chirita lutea）[11]；但多數(shù)以葉片作為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織后分化產(chǎn)生不定芽，進(jìn)而獲得組培苗，如大苞短毛唇柱苣苔（Chirita brachytricha var. magnibracteata）[12]、條葉唇柱苣苔（Chirita ophiopogoides）[13]、文采唇柱苣苔（Chirita wentsaii）[14]、菱葉唇柱苣苔（Chirita subrhomboidea）[15]、荔波唇柱苣苔（Chirita liboensis）[16]等。這些唇柱苣苔組培快繁技術(shù)的成功，為唇柱苣苔屬植物大規(guī)模園藝應(yīng)用的種苗供應(yīng)提供了技術(shù)保障，也為解決一些瀕危唇柱苣苔屬植物的遷地保育奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。而王氏唇柱苣苔尚未有組培快繁的研究報(bào)道，研發(fā)適合于王氏唇柱苣苔高效、穩(wěn)定的組培快繁技術(shù)體系可為王氏唇柱苣苔的園藝開發(fā)和可持續(xù)利用提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

將采集于廣西融安縣的野生王氏唇柱苣苔引種栽培位于上海市奉賢區(qū)海灣的上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)的實(shí)驗(yàn)溫室內(nèi)栽培，溫室為1 000 m2的文洛型玻璃溫室，配備內(nèi)外遮陽，夏季通過濕簾風(fēng)機(jī)系統(tǒng)降溫，冬季通過暖風(fēng)系統(tǒng)加溫，最低夜溫在10 ℃以上。引種植株正常生長后用于組培外植體取材（圖1-A）。實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基除生根培養(yǎng)基為1/2 MS外，初代與繼代階段培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基均加入3%蔗糖、0.6%瓊脂粉、滅菌前pH調(diào)到6.0，分裝后于121 ℃高溫滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) ①外植體處理：將引種成活后的植株置于通風(fēng)處1周后，取長約3 cm、寬2 cm的健壯無病斑嫩葉，用洗潔精輕輕擦洗后于流動的自來水下沖洗1 h；取該葉片放置于超凈臺下，先用70%酒精清洗10 s后用無菌水沖洗3次（每次15 s左右），再移入0.1%升汞中加1滴吐溫20，振蕩5～8 min，最后用無菌水漂洗7～10次。

②不定芽誘導(dǎo)和初代培養(yǎng)：起始培養(yǎng)基以MS+0.5 mg/L 6-BA為基本培養(yǎng)基，再分別添加0.1 mg/L NAA、IBA和IAA共4種培養(yǎng)基（表1）。選擇消毒后無褐化的葉片作為外植體，切割成0.5 cm×0.5 cm的小塊接入培養(yǎng)基中，每瓶5個(gè)外植體（圖1-B），每種培養(yǎng)基5瓶。培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，先暗培養(yǎng)1周后，而后置于光強(qiáng)為40 μmol/（m2·s）的組培架上，光照時(shí)間12 h。6周后統(tǒng)計(jì)外植體上的芽數(shù)。

③繼代增殖：取初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)6周后的幼苗葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小塊轉(zhuǎn)接到MS空白以及含6-BA（0.1、0.3、0.5 mg/L）和NAA（0、0.01、0.05 mg/L）正交組合設(shè)計(jì)的10種MS培養(yǎng)基上。每瓶接種5個(gè)葉塊、每個(gè)培養(yǎng)基處理5瓶。每周進(jìn)行觀察、固定、拍照并統(tǒng)計(jì)生長情況，取生長6周產(chǎn)生的芽數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

④生根培養(yǎng)：將繼代增殖培養(yǎng)6周的瓶苗接種分別轉(zhuǎn)接至空白MS培養(yǎng)基上3周后，選擇大小一致的試管苗，轉(zhuǎn)接至含不同IBA（0.1、0.3、0.5 mg/L）和蔗糖（15、30 g/L）濃度組合的1/2 MS培養(yǎng)基上。每瓶接種5株，每個(gè)培養(yǎng)基8瓶，統(tǒng)計(jì)生根率、平均根數(shù)和根長。2個(gè)月后隨機(jī)選擇其中20株，統(tǒng)計(jì)葉數(shù)、根數(shù)、根長、株高。

⑤煉苗移栽：植株冠幅達(dá)到3～4 cm時(shí)，將組培苗從瓶內(nèi)取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽到裝滿草炭、蛭石、珍珠巖體積比3 ∶ 1 ∶ 1混合基質(zhì)的32孔穴盤中，澆透水，放入育苗盒中保濕。日后每隔3 d往育苗盒噴霧1次，保持空氣濕度在90%以上，最高光照強(qiáng)度150 μmol/（m2·s），溫度為18 ℃～25 ℃。2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.2.2 測定項(xiàng)目與方法 ①生長發(fā)育觀察和形態(tài)學(xué)解剖：每周對外植體用體視顯微鏡（Olympus SXZ 1000）進(jìn)行觀察，對葉片外植體的形態(tài)拍照記錄。對葉片外植體定期采用FAA固定液（70%酒精 ∶ 冰醋酸 ∶ 甲醛=90 ∶ 5 ∶ 5）進(jìn)行固定。分別在接種前和接種后，每周從每個(gè)處理分別取一片葉片外植體，放于20倍體積的FAA固定液中，固定3 d后轉(zhuǎn)入70%酒精中保存。將固定好的切片材料用酒精和二甲苯進(jìn)行梯度脫水和透明后，進(jìn)行梯度滲蠟，后采用Leica Plus 60 ℃溶點(diǎn)高純度石蠟進(jìn)行包埋。包埋好的石蠟塊采用Leica R2015切片機(jī)切片，切片厚度8～10 μm。采用鐵釩蘇木精法染色后，用中性樹膠封片，在Olympus BX51下進(jìn)行觀察和拍照。

②染色體計(jì)數(shù)：染色體計(jì)數(shù)材料采用馴化移栽前生長旺盛的組培苗。于早晨8點(diǎn)采集生長旺盛的根尖，在0.1%秋水仙素常溫處理2 h后，卡諾固定液（無水酒精 ∶ 冰醋酸=1 ∶ 1）4 ℃固定2 h，用去離子水漂洗3次，用1 mol/L HCl 60 ℃解離2 min，蒸餾水清洗3～5次后，將根尖材料輕輕放于載玻片上，用解剖針分散根尖樣品后，采用卡寶品紅溶液在常溫下染色3 min，蓋上蓋玻片，壓片后，Olympus BX51顯微鏡鏡檢，觀察和拍照。

③流式細(xì)胞術(shù)變異性檢測：以自交系玉米（Zea mays L.）B73為內(nèi)參，王氏唇柱苣苔母本與組培苗分別與玉米幼嫩的葉片共切，大小均約0.5 cm2，置于冰盒內(nèi)的1次性培養(yǎng)皿中。加400 μLD API核提取液，使用尖銳的刀片快速切割樣品，浸泡2～5 min之后將懸浮液用300目的尼龍網(wǎng)過濾到樣品管中，再加入1 600 μL的染色液，轉(zhuǎn)速14 000離心10 s后，去除上清液，加2 mL蒸餾水補(bǔ)給，隨后于Partec Space型流式細(xì)胞儀上檢測[17]。每種材料3個(gè)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 王氏唇柱苣苔初代培養(yǎng)

王氏唇柱苣苔在添加0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)啟動所需時(shí)間短，平均誘導(dǎo)芽數(shù)卻最多，首先在葉緣處長出芽點(diǎn)（圖1-D），而后葉塊中間也出現(xiàn)不定芽，芽均勻但較?。▓D1-C）；而僅有0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基對誘導(dǎo)不定芽時(shí)間最長，芽數(shù)則最少，但芽相對較大（表1）。

2.2 王氏唇柱苣苔的繼代增殖培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)中未添加植物生長調(diào)節(jié)劑的MS空白培養(yǎng)基誘導(dǎo)芽數(shù)最少，平均為7.4個(gè)，且啟動最晚，外植體邊緣褐化。6-BA濃度對王氏唇柱苣苔葉片的繼代增殖芽產(chǎn)生有顯著影響，相同NAA水平下每個(gè)外植體產(chǎn)生的芽數(shù)隨著6-BA濃度的提高而增加；而NAA濃度則影響不顯著；6-BA與NAA的交互作用對增殖芽產(chǎn)生影響顯著。最高誘導(dǎo)芽數(shù)是添加0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基，芽數(shù)達(dá)到46.4個(gè)，芽小生長密集，但出現(xiàn)明顯的玻璃化現(xiàn)象。在MS無激素培養(yǎng)基和低濃度6-BA（0.1 mg/L）培養(yǎng)基中，增殖過程中均出現(xiàn)生根現(xiàn)象。在0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上芽增殖也達(dá)到39個(gè)，且未出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，因此，該培養(yǎng)基可作為最佳增殖培養(yǎng)基（表2）。

2.3 王氏唇柱苣苔的生根培養(yǎng)

王氏唇柱苣苔在不同生根培養(yǎng)基中幼苗均能100%生根（表3），除蔗糖濃度對葉數(shù)和根長沒有顯著影響外，IBA、蔗糖和IBA的交互作用對王氏唇柱苣苔的葉片數(shù)、根數(shù)、根長和株高均有顯著影響，而蔗糖僅對根數(shù)和株高產(chǎn)生顯著影響。王氏唇柱苣苔生根培養(yǎng)60 d后，單株葉片數(shù)可達(dá)到8～10.5片。在2種濃度蔗糖條件下，根數(shù)在IBA濃度為0.5 mg/L時(shí)顯著增多，分別為18.6條和16條；根長也有同樣趨勢。在所有IBA水平下，蔗糖濃度15 g/L時(shí)植株株高均顯著高于蔗糖濃度30 g/L的培養(yǎng)基。各處理植株生長均良好，綜合考慮成本和效果，王氏唇柱苣苔的生根培養(yǎng)基可以選用1/2 MS培養(yǎng)基添加0.5 mg/L IBA和15 g/L蔗糖。各處理獲得的生根苗移栽成活率在92%以上（圖1-F）。

2.4 王氏唇柱苣苔組培過程形態(tài)發(fā)生組織學(xué)觀察

王氏唇柱苣苔葉片外植體器官發(fā)生過程的組織切片觀察結(jié)果見圖2。由圖2可見，接種前王氏唇柱苣苔細(xì)胞排列整齊，規(guī)則（圖2-A）；接種3周后，外植體的上下表皮均可形成分生組織（圖2-B，C）；第4周后分生細(xì)胞繼續(xù)分裂，形成葉、芽原基，維管束與外植體相聯(lián)接，故為器官發(fā)生途徑（圖2-E，F(xiàn)，G）。

2.5 染色體計(jì)數(shù)和變異性檢測

隨機(jī)對50株王氏唇柱苣苔組培苗的染色體壓片觀察表明，王氏唇柱苣苔染色體較小，在所有觀察個(gè)體中，染色體均為2n=36（圖3），與母本觀察到的染色體數(shù)一致，表明組培并沒未使其染色體數(shù)量發(fā)生改變。

利用流式細(xì)胞儀測定的王氏唇柱苣苔相對DNA含量如圖4所示，RN2為內(nèi)參玉米B73，其2C DNA含量為4.85 pg，通過峰值比較，王氏唇柱苣苔母本基因組大小是玉米的52.8%（圖4-A），2C DNA含量為2.561 pg，基因組大小為1 235 Mb；王氏唇柱苣苔組培苗基因組大小是玉米的51.8%（圖4-B），2C DNA含量為2.512 pg，基因組大小為1 212 Mb，組培苗與母本相比，基因組大小發(fā)生1.86%的減少。

3 討論

唇柱苣苔屬植物組培快繁的誘導(dǎo)分化階段常用激素范圍為0.1～1.0 mg/L 6-BA和0～0.2 mg/L NAA，6-BA高于1.0 mg/L 便易造成試管苗玻璃化[7]。本研究中，王氏唇柱苣苔最佳誘導(dǎo)激素組合為0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，其在誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)芽數(shù)目方面優(yōu)于6-BA與IBA、IAA組合。在繼代增殖階段，6-BA對增殖有顯著影響，NAA的影響則不顯著，但是2種激素混合使用的交互作用對誘導(dǎo)具有顯著影響。這與單座苣苔的植株再生時(shí)細(xì)胞分裂素（TDZ或6-BA）與生長素（NAA）配合使用可誘導(dǎo)更多不定芽的結(jié)果一致[18]。在苦苣苔科植物中，最常用的生根培養(yǎng)基為1/2 MS，生根激素為IBA和NAA，濃度一般為0～0.5 mg/L[7]。王氏唇柱苣苔組培苗生根比較容易，2種蔗糖濃度對根數(shù)沒有顯著影響；但I(xiàn)BA濃度的增加則顯著提高了生根數(shù)量，說明王氏唇柱苣苔的生根對生長素濃度比較敏感。

愈傷組織在繼代過程中會發(fā)生大量變異，長期繼代的愈傷組織不僅分化能力下降，而且繼代時(shí)間越長，變異越復(fù)雜，變異率越高，流式細(xì)胞術(shù)是快速鑒定是否存在變異的有效方法[19]。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測，王氏唇柱苣苔組培苗與母本相比，基因組大小發(fā)生1.86%的減少，變異系數(shù)小于5%，可認(rèn)為沒有發(fā)生變異[20]。通過本方法快繁得到的王氏唇柱苣苔在形態(tài)上與母本保持一致，染色體數(shù)量和形態(tài)特征也沒有發(fā)生變化?？傮w而言，王氏唇柱苣苔組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)可保留母本遺傳性狀，具有遺傳穩(wěn)定性。在組培過程中可進(jìn)一步調(diào)整培養(yǎng)基配方和減少繼代培養(yǎng)次數(shù)，減少通過愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽途徑，增加直接產(chǎn)生不定芽比例，進(jìn)一步降低基因組大小的變化，提高組培過程的遺傳穩(wěn)定性。通過組培快繁可短時(shí)間內(nèi)為王氏唇柱苣苔今后的園藝應(yīng)用提供大量優(yōu)質(zhì)種苗，降低生產(chǎn)成本，進(jìn)而減少園藝愛好者對野生資源的采挖，有效保護(hù)其自然生境和資源。

4 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)建立了一套簡單有效的王氏唇柱苣苔離體快速繁殖體系，以葉片為外植體時(shí)，其最佳初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS添加0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；最適繼代培養(yǎng)基為MS添加0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基添加0.5 mg/L IBA和15 g/L蔗糖。所獲得的組培苗在無土栽培基質(zhì)中移栽馴化成活率達(dá)到92%以上，組培苗沒有發(fā)生變異。

參考文獻(xiàn)

[1] Wang W T， Pan K Y， Li Z Y， et al. Gesneriaceae [M]// Wu Z Y， Raven P H eds， Flora of China， Beijing： Science Press； St. Louis： Missouri Botanical Garden Press， 1998， 18： 244-401.

[2] 王莉芳， 黃仕訓(xùn)， 鄧 濤， 等. 廣西唇柱苣苔屬植物及其園林應(yīng)用[J]. 北方園藝， 2009， （4）： 174-177.

[3] 溫 放， 張啟翔， 王 越. 廣西唇柱苣苔屬和小花苣苔屬植物的觀賞性狀評價(jià)與篩選[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2008， 35（2）： 239-250.

[4] 溫 放， 張啟翔. 5種唇柱苣苔屬植物葉插繁殖方式研究[J]. 北方園藝， 2007， （12）： 103-105.

[5] 李謙盛， 瞿家鶯， 沈丹峰， 等. 卡柱苣苔葉片扦插繁殖技術(shù)初探[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2014， 26（3）： 675-679.

[6] 周太久， 黃仕訓(xùn)， 鄧 濤， 等. 6種唇柱苣苔屬植物葉插繁殖試驗(yàn)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2012， 43（3）： 56-59.

[7] 李 翠， 凌征柱， 姚紹嫦， 等. 苦苣苔科植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 38（31）： 17 387-17 388， 17 390.

[8] 金雪瓊， 李霖明， 宋希強(qiáng)， 等. 崀山唇柱苣苔的快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2009， 45（12）： 1 197.

[9] 梁桂友， 溫 放， 李湛東. 尖萼唇柱苣苔的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2007， 43（2）： 321.

[10] 韋 嘯， 唐賽春， 黃素梅. 三苞唇柱苣苔花梗的離體培養(yǎng)[J]. 北方園藝， 2011（16）： 144-147.

[11] 溫 放， 張啟翔， 任翔翔. 黃花牛耳朵的離體培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2008， 44（2）： 301-302.

[12] 文 弢， 婁 麗， 侯 娜， 等. 大苞短毛唇柱苣苔離體培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2016， 28（3）： 350-353.

[13] 付傳明， 冼康華， 何金祥， 等. 條葉唇柱苣苔離體快繁技術(shù)研究[J]. 種子， 2015， 34（4）： 118-122.

[14] 冼康華， 付傳明， 唐鳳鸞， 等. 文采唇柱苣苔的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 2014， 50（7）： 1 065-1 069.

[15] 李 翠， 呂惠珍， 凌征柱， 等. 菱葉唇柱苣苔的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2010， 46（10）： 1 073-1 074.

[16] 侯 娜， 田曉瑞， 婁 麗， 等. 荔波唇柱苣苔離體葉片不定芽的誘導(dǎo)及植株再生[J]. 林業(yè)科技開發(fā)， 2015（4）： 67-70.

[17] 桂毅杰， 王 晟， 全麗艷， 等. 毛竹基因組大小和序列構(gòu)成的比較分析[J]. 中國科學(xué)（C輯： 生命科學(xué)）， 2007， 37（4）： 488-492.

[18] Ma G H， Teixeira da Silva J A， Lu JF， et al. Shoot organogenesis and plant regeneration in Metabriggsia ovalifolia[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult， 2010， 105（3）： 355-361.

[19] 耿小麗， 魏臻武， 姚喜紅. 采用流式細(xì)胞儀鑒定紫花苜?；ㄋ幱鷤M織的變異[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2011， 20（3）： 156-161.

[20] Zhao J， Cui J， Liu J， et al. Direct somatic embryogenesis from leaf and petiole explants of Spathiphyllum ‘Supreme and analysis of regenerants using flow cytometry[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult， 2012， 110： 239-249.