鄧慧儀 李美嬌 王瑋豪 黃雪琨 黃健聰 張革化 楊欽泰

【摘要】目的檢測(cè)Yes相關(guān)蛋白（YAP）在慢性鼻竇炎伴鼻息肉（CRSwNP）中的表達(dá)情況，初步探討YAP在CRSwNP發(fā)病機(jī)制中的作用。方法收集對(duì)照組（13例）的下鼻甲黏膜和CRSwNP組（27例）的鼻息肉，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)組織中YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA的表達(dá)情況，并分析相關(guān)性。結(jié)果鼻息肉組織中YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<005）。YAP mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別與TEAD1、TSLP、IL33、Ki67 mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs=0568；rs=0693；rs=0745；rs=0561；P均<001）。結(jié)論YAP可能參與了CRSwNP的發(fā)病機(jī)制，并且可能與TSLP、IL33等上皮因子的表達(dá)增加從而介導(dǎo)鼻息肉細(xì)胞增殖有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】Yes相關(guān)蛋白；鼻息肉；上皮因子；細(xì)胞增殖；Ki67

Correlation analysis between expression levels of Yesassociated protein and cell proliferation in chronic rhinosinusitis with nasal polypsDeng Huiyi， Li Meijiao， Wang Weihao， Huang Xuekun， Huang Jiancong， Zhang Gehua， Yang Qintai Department of OtorhinolaryngologyHead and Neck Surgery， the Third Affiliated Hospital of Sun Yatsen University， Guangzhou 510630， China

Correspongding author，Yang Qintai， Email：yangqt@163com

【Abstract】ObjectiveTo measure the expression levels of Yesassociated protein （YAP） in chronic sinusitis with nasal polyps（CRSwNP） and preliminarily investigate the effect of YAP upon the pathogenesis of CRSwNP MethodsThe inferior turbinates mucosa was collected in the control group（n=13） and nasal polyp tissue was obtained in the CRSwNP group（n=27） Fluorescent quantitative RTPCR was performed to quantitatively measure the expression levels of YAP， TEAD1， TSLP， IL33 and Ki67 mRNA， and correlation analysis was conducted ResultsThe relative expression levels of YAP， TEAD1， TSLP， IL33 and Ki67 mRNA in the CRSwNP tissues were significantly higher compared with those in the control group（all P<005） The relative expression level of YAP mRNA was positively correlated with that of TEAD1 （rs=0568， P=0002）， TSLP （rs=0693， P<0001）， IL33 （rs=0745， P<0001） and Ki67 mRNA （rs=0561， P<0001） ConclusionsYAP is probably involved with the pathogenesis of CRSwNP It can mediate the cell proliferation of CRSwNP probably through upregulating the expression levels of TSLP， IL33 and other epithelial factors

【Key words】Yesassociated protein； Chronic sinusitis with nasal polyps； Epithelial factor；

Cell proliferation； Ki67

慢性鼻竇炎伴鼻息肉（CRSwNP）是耳鼻喉科最常見(jiàn)的疾病之一，變態(tài)反應(yīng)和感染性炎癥反應(yīng)均為重要病因，但具體發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明[1]。有研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞增殖的核蛋白Ki67抗原在鼻息肉組織中表達(dá)增加，提示鼻息肉組織中存在細(xì)胞過(guò)度增殖、組織重塑等表現(xiàn)，但鼻息肉細(xì)胞增殖如何被調(diào)控則未進(jìn)一步探討[23]。Yes 相關(guān)蛋白（YAP）是Hippo通路的關(guān)鍵蛋白，研究表明該通路可調(diào)控器官體積、細(xì)胞增殖、組織再生等，目前在腫瘤細(xì)胞增殖中研究較多，且YAP廣泛存在于機(jī)體各主要細(xì)胞中，但YAP是否調(diào)控鼻息肉細(xì)胞非正常的增殖則未見(jiàn)報(bào)道，故本研究旨在檢測(cè)YAP在鼻息肉組織中表達(dá)情況并初步探討YAP是否與鼻息肉細(xì)胞增殖有關(guān)[48]。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

鼻息肉標(biāo)本27例，來(lái)自2017年1月至5月在我院住院手術(shù)治療的CRSwNP患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照2012年歐洲鼻竇炎和鼻息肉指南[9]。男21例、女6例，年齡（3454±1167）歲。所有患者術(shù)前至少4周內(nèi)無(wú)全身或局部使用過(guò)任何激素類(lèi)藥物。另取下鼻甲黏膜13例作對(duì)照組，其中男11例、女2例，年齡（4193±1384）歲，該標(biāo)本來(lái)自腦脊液鼻漏、視神經(jīng)管骨折或慢性淚囊炎等患者，因術(shù)中暴露解剖結(jié)構(gòu)的需要而切除的正常下鼻甲（表1）。所有患者均已簽署知情同意書(shū)，并且已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

表1患者臨床特點(diǎn)匯總表組別男∶女年齡病程對(duì)照組11∶23454±1167373±165CRSwNP組21∶64193±1384423±221t值--1658-0718P值1000a01050477注：aFisher確切概率法

二、方法

1標(biāo)本采集與處理

采集對(duì)照組下鼻甲或?qū)嶒?yàn)組鼻息肉組織1份，用生理鹽水洗去血跡和分泌物后，把組織浸潤(rùn)于RNALater中并剪碎，4℃過(guò)夜，吸取RNALater后，-80℃保存，備qRTPCR。分別檢測(cè)各組織中YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA的表達(dá)。

2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法

組織在液氮中研磨后，采用Trizol試劑提取組織總RNA，以1 μg RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，兩步法逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)： 42℃ 2 min去除基因組DNA； 37℃ 15 min，85℃ 5 s逆轉(zhuǎn)錄。三步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：95℃ 5 min預(yù)變性；95℃ 15 s退火，60℃ 15 s解鏈，72℃ 32 s延伸，40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表2。結(jié)果分析：ΔCT= （ΔCT。xΔCT β2M），基因相對(duì)表達(dá)量=2ΔCT，其中x為目標(biāo)基因，β2M為內(nèi)參。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 200軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示。2組性別的組間差異采用Fisher確切概率法，年齡和病程的組間差異采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。CRSwNP組與對(duì)照組的YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA的表達(dá)差異采用MannWhitney檢驗(yàn)。CRSwNP組的YAP mRNA與TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA之間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA在鼻息肉和正常下鼻甲組織中的表達(dá)水平

CRSwNP組鼻息肉組織和對(duì)照組下鼻甲均可檢測(cè)到Y(jié)AP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA表達(dá)（表3）。CRSwNP組中各指標(biāo)的表達(dá)均高于對(duì)照組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<005）。

二、YAP mRNA分別與TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA之間的相關(guān)性分析

Spearman秩相關(guān)性分析表明，在鼻息肉組織中（n=27），YAP mRNA相對(duì)表達(dá)水平與TEAD1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs=0568；P=0002，圖1A）；YAP mRNA相對(duì)表達(dá)水平與TSLP mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs=0693；P<0001，圖1B）； YAP mRNA相對(duì)表達(dá)水平與IL33 mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs=0745；P<0001，圖1C）；YAP mRNA相對(duì)表達(dá)水平與Ki67 mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs=0561；P=0002，圖1D）。

討論

鼻息肉形成的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚，鼻息肉上皮細(xì)胞增殖過(guò)度活躍是鼻息肉典型的病理特征之一。Ki67是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)記，本研究中發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織中Ki67表達(dá)水平高于對(duì)照組的鼻黏膜組織，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示鼻息肉組織的細(xì)胞增殖活性高于正常鼻黏膜組織，符合鼻息肉上皮增生、間質(zhì)水腫，腺體增多的病理狀態(tài)，也與Zhao等[10]研究結(jié)果相符。但正常的鼻黏膜如何發(fā)

表3YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA在對(duì)照組下鼻甲及

鼻息肉組織中的表達(dá)水平中位數(shù)（四分位數(shù)間距）組別YAPTEAD1TSLPIL33Ki67對(duì)照組0372（0388）0176（0182）0017（0033）04390（0366）0008（00115）CRSwNP組290（267）0322（1032）0047（013）0703（0983）0066（0081）Z值-4260-2469-2744-3119-4232P值<000100130005<0001<0001

圖1鼻息肉組織中YAP與TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA的相關(guān)性分析展成鼻息肉以及鼻息肉細(xì)胞過(guò)度增殖又是如何被調(diào)控的目前研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織中存在凋亡相關(guān)蛋白Fas、FasL和Ki67的平衡失調(diào)，鼻息肉細(xì)胞凋亡抑制而增殖活性加強(qiáng)從而導(dǎo)致上皮組織增生、重塑[1112]。也有研究發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致鼻黏膜組織損傷，病理狀態(tài)下上皮修復(fù)從而導(dǎo)致組織增生[1315]。但這些研究并未解答鼻息肉組織中Ki67活性是如何被調(diào)控增強(qiáng)從而使鼻息肉細(xì)胞增殖過(guò)度活躍最后導(dǎo)致組織增生。

YAP是Hippo通路的主要蛋白，在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和組織大小等方面發(fā)揮重要作用。該通路主要由哺乳動(dòng)物 STE20 樣激酶1/2（MST1/2）和磷酸化腫瘤抑制基因（LATS1/2）組成的激酶級(jí)聯(lián)激活，最終使 Hippo信號(hào)通路的主要效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子YAP和具有 PDZ 結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄輔激活物（TAZ）去磷酸化入核，然后結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TEAD14，從而轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平參與細(xì)胞的增殖、分化和死亡等[4]。目前YAP在腫瘤方面研究較多，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中Hippo通路活化，YAP表達(dá)增加可使Ki67表達(dá)增加從而使肝癌細(xì)胞增殖活躍，提示機(jī)體在病理狀態(tài)下可由YAP調(diào)控Ki67表達(dá)從而使細(xì)胞增殖過(guò)度活躍[16]。但在鼻息肉組織中YAP是否與Ki67表達(dá)有關(guān)則未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)檢測(cè)鼻息肉組織中YAP及其核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TEAD1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織中YAP及TEAD1表達(dá)均比對(duì)照組高，提示病理狀態(tài)下鼻黏膜組織中YAP激活。本研究接著探討鼻息肉組織中YAP活化是否與細(xì)胞過(guò)度增殖有關(guān)，通過(guò)分析鼻息肉組織中YAP和Ki67 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)，提示鼻息肉細(xì)胞增殖過(guò)度活躍與YAP有關(guān)，即YAP參與了鼻息肉的形成機(jī)制，調(diào)控細(xì)胞過(guò)度增殖導(dǎo)致組織增生。

鼻息肉形成與上皮受損激發(fā)炎癥反應(yīng)有關(guān)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)鼻黏膜上皮受到刺激后可分泌TSLP、IL33等固有免疫因子[2， 1720]。因此，本研究還進(jìn)一步探討TSLP、IL33等因子是否與YAP調(diào)控Ki67從而使細(xì)胞增殖過(guò)度活躍有關(guān)，發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織中TSLP、IL33的mRNA相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組高，且均與YAP高表達(dá)呈正相關(guān)，提示鼻息肉組織中YAP活化可能與上皮受損釋放TSLP、IL33等因子有關(guān)。

Hippo通路作為一種控制組織和器官大小的新型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，目前在鼻黏膜慢性炎癥發(fā)病中仍未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)鼻息肉YAP、TEAD1、Ki67、TSLP、IL33等mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)鼻息肉中存在Hippo通路的活化，再進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)YAP與Ki67表達(dá)增加呈正相關(guān)，初步提示鼻息肉中細(xì)胞過(guò)度增殖與YAP有關(guān)。同時(shí)鼻黏膜上皮受損后釋放的TSLP、IL33表達(dá)上調(diào)也與YAP正相關(guān)，表明鼻黏膜上皮受損可能活化了YAP的活性，從而介導(dǎo)細(xì)胞、組織的過(guò)度增殖，但具體機(jī)制仍需更多的研究進(jìn)一步證實(shí)。

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（收稿日期：20170606）

（本文編輯：楊江瑜）