徐美蓉，李曉蓉，李婷

摘要：測(cè)定葡萄葉片中的可溶性糖，對(duì)葡萄葉片可溶性糖提取條件進(jìn)行了比較；利用響應(yīng)面法（RSM）對(duì)測(cè)定可溶性糖含量的蒽酮-硫酸顯色方法參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并得到回歸模型。結(jié)果表明，葡萄葉片可溶性糖提取的最佳提取劑為水，采用21.9%乙酸鋅和10.6%亞鐵氰化鉀可以最大限度的去除共提物干擾，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為625 nm。用0.2 mg/mL蒽酮-硫酸試劑12 mL，在沸水浴中加熱12 min。在此條件下測(cè)定的可溶性糖平均含量為2.54%～6.93%，精密度實(shí)驗(yàn)RSD為0.68%～0.81%，平均加標(biāo)回收率99.4%，RSD=2.7%（n=3）。

關(guān)鍵詞：葡萄葉片；可溶性糖；蒽酮-硫酸法；響應(yīng)面法

中圖分類(lèi)號(hào)：S132 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1463（2017）11-0025-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2017.11.008

Determination of Soluble Sugar from Grape Leaves by Optimizing of

Anthrone-Sulfuric Acid Method by Response Surface Methodology

XU Meirong， LI Xiaorong， LI Ting

（Institute of Agricultural Quality Standards and Detection Technology， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：An anthrone-sulfuric acid method for the extraction of soluble sugar from grape leaves is optimized using response surface methodology （RSM）. The result indicates the optimum extraction agent of soluble sugar glucose is water， adding 21.9% zinc acetate and 10.6% potassium ferrocyanide could not interfere with co-extract extremely， and detection wavelength is 625 nm. In addition， we suggest 12 mL of 0.2 mg/mL anthrone-sulfuric acid agent should be added and perform water-bathing for 12 min. on the basis of the conditions， the content of soluble sugar is found in the range of 2.54～6.93%， the relative standard deviation （RSD） ranged from 0.68% to 0.81%， and the average recovery is 99.4% （RSD=2.7%， n=3）.

Key words：Grape leaves；Soluble sugar；Anthracenone-sulfate method；Response surface method （RSM）

葡萄在我國(guó)屬于六大水果之一，在果樹(shù)種植中有著舉足輕重的作用[1 - 2 ]?？扇苄蕴遣粌H是高等植物的主要光合產(chǎn)物，而且是碳水化合物代謝和暫時(shí)貯藏的主要形式。在研究葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，掌握整個(gè)植物體內(nèi)可溶性糖含量變化，特別是葉片的可溶性糖含量變化，有助于了解其光合性能和糖份及干物質(zhì)積累等過(guò)程[3 - 7 ]。一般以葡萄糖作為可溶性糖的測(cè)定指標(biāo)，其測(cè)定方法主要有蒽酮-硫酸法[8 ]、苯酚-硫酸法[9 ]、3，5-二硝基水楊酸比色法[10 ]和鐵氰化鉀法[11 ]等。3，5-二硝基水楊酸比色法適用于直接測(cè)定植株中還原糖。苯酚-硫酸法測(cè)定時(shí)影響因素較多，苯酚試劑見(jiàn)光或遇氧即逐漸氧化成淡紅色，而且加入試劑反應(yīng)劇烈，容易濺出，往往導(dǎo)致結(jié)果偏差[12 ]。鐵氰化鉀法操作繁瑣，整個(gè)操作過(guò)程需要在微沸狀態(tài)下進(jìn)行，試劑的滴定速度、加熱時(shí)間、熱源穩(wěn)定程度等對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度都有很大的影響[9 ]。蒽酮-硫酸比色法則顯色穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定。目前對(duì)葡萄葉片可溶性糖含量測(cè)定的報(bào)道并不多見(jiàn)。我們對(duì)葡萄葉片中可溶性糖的含量進(jìn)行了測(cè)定，并通過(guò)優(yōu)化前處理提取條件，利用響應(yīng)面法對(duì)蒽酮-硫酸比色法測(cè)定條件進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化，以期準(zhǔn)確測(cè)定葡萄葉片中可溶性糖的含量，為實(shí)現(xiàn)葡萄高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)栽培及其副產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供參 考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

供試葡萄鮮葉片采自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所葡萄園。用烘箱低溫烘干至恒重，粉碎過(guò)40目篩，放入封口袋備用。所用試劑有葡萄糖、蒽酮、濃硫酸、乙醇、丙酮，葡萄糖為GR，其余試劑均為AR。純水三級(jí)。實(shí)驗(yàn)儀器主要有瓦里安Cary50紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、AG204分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司提供）、高速離心機(jī)、水浴鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖250 mg，混勻后用蒸餾水溶解并定容至250 mL，得到濃度為1.0 mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待用。

1.2.2 蒽酮試液的配制 精密稱(chēng)取蒽酮0.2 g，加入85%濃硫酸溶液中，完全溶解后定容至100 mL，放于棕色瓶?jī)?nèi)，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 吸取一定體積的葡萄糖標(biāo)品溶液，經(jīng)蒽酮-硫酸比色法處理，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)550～700 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，以最大吸收值確定檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 依次吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00 mL，置于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，定容。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL，在冰水浴中緩緩加入12.0 mL的蒽酮試劑，100 ℃水浴反應(yīng)12 min，迅速冷卻，室溫放置20 min，待顯色穩(wěn)定后測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 樣品測(cè)定方法 準(zhǔn)確稱(chēng)取烘干粉碎的葡萄葉片0.500 0 g，放入50 mL塑料離心管，置于80 ℃水浴中，用一定體積提取液提取30 min，取出離心，收集提取液于量杯中。用此方法對(duì)殘?jiān)貜?fù)提取2次，使糖提取完全。加入去干擾劑后定容，過(guò)濾，待測(cè)。

1.2.6 提取劑的選擇 由于可溶性糖易溶于水及乙醇，因此 GB/T 5009.7-2008、GB/T 5009.8-2008、GB/T 5513-2008 以及一些糖的測(cè)定方法中，用于糖的提取溶液最常用是水和80%乙醇。選取處理好的葡萄葉片，分別用水和80%乙醇提取，進(jìn)行測(cè)定可溶性糖的比較試驗(yàn)，方法同1.2.5。

1.2.7 去干擾劑的選擇 蒽酮比色法產(chǎn)生的糖醛顯色反應(yīng)，往往會(huì)受到樣品共提物的影響，所以在植物樣品提取，特別是從含有較多色素以及蛋白質(zhì)的樣品中提取可溶性糖，需要去干擾劑。根據(jù)國(guó)標(biāo)以及其他文獻(xiàn)，采用21.9%乙酸鋅和10.6%亞鐵氰化鉀（A）、30%硫酸鋅和16%亞鐵氰化鉀（B）、酸洗活性炭（C）3種組合進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，測(cè)定方法同1.2.5。

1.2.8 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 用一定濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)蒽酮顯色反應(yīng)中的試劑用量、顯色時(shí)間、顯色溫度因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比對(duì)，以吸光度為指標(biāo)，確定各因素對(duì)結(jié)果的影響。

①蒽酮試劑用量的選擇 分別取0.3 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 mL，置于8支10 mL的具塞試管中，分別加入0.2 mg/mL的蒽酮試劑10.00、10.50、 11. 00、11.50、12.00、12.50、13.00、13.50 mL，于100 ℃水浴中反應(yīng)10 min，冷卻至室溫，靜置20 min，于625 nm下測(cè)定吸光值。

②顯色溫度的選擇 按①步驟，在4支試管中加入蒽酮試劑12.00 mL分別在25、50、75、100 ℃水浴中進(jìn)行顯色反應(yīng)10 min，冷卻，靜置，測(cè)定吸光值。

③顯色時(shí)間的選擇 按①步驟，在試管中加入蒽酮試劑12.00 mL，在100 ℃水浴中加熱4、6、8、10、12、14、16 min，冷卻，靜置，測(cè)定吸光值。

1.2.9 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 依據(jù)1.2.8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)方案，優(yōu)化可溶性糖含量測(cè)定條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL，經(jīng)1.2.4進(jìn)行顯色反應(yīng)，在550～700 nm處掃描（圖1）?？梢钥闯觯冢?25±1） nm處吸收值最大，因此確定測(cè)定波長(zhǎng)為625 nm。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。線性方程為Y=0.0082X+0.0296，R2=0.9994。結(jié)果表明，糖含量在0～0.9 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好。

2.3 提取液的比較

水和80%乙醇提取液實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示?？梢钥闯?，2種提取液測(cè)定的葡萄葉片可溶性糖的結(jié)果相差不大，3次平行測(cè)定的結(jié)果差值為0.13%，低于算數(shù)平均值的10%。因此，對(duì)于葡萄葉片中可溶性糖的提取，水和80%乙醇提取結(jié)果無(wú)明顯差別，均可作為提取液?？紤]到實(shí)驗(yàn)成本，我們選擇用水做提取液。

2.4 去干擾劑比較

通過(guò)圖3可以看出，通過(guò)對(duì)21.9%乙酸鋅和10.6%亞鐵氰化鉀（A）、30%硫酸鋅和16%亞鐵氰化鉀（B）、酸洗活性炭（C）對(duì)可溶性糖的測(cè)定結(jié)果的比較，酸洗活性炭的測(cè)定結(jié)果明顯低于其他2種，因?yàn)樗嵯椿钚蕴浚–）在去除色素方面具有一定優(yōu)勢(shì)，但含有其它共提物時(shí)，去除效果并沒(méi)有組合沉淀劑好，并且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，最后處理過(guò)的提取液還有一定的渾濁，易導(dǎo)致結(jié)果偏低。而乙酸鋅-亞鐵氰化鉀（A）沉淀速度快速、易混勻，故選用硫酸鋅-亞鐵氰化鉀作為測(cè)定葡萄葉片可溶性糖的沉淀劑。

2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

2.5.1 蒽酮試劑用量 顯色溫度為100 ℃，反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)，蒽酮試劑用量對(duì)吸光值的影響結(jié)果見(jiàn)圖4?？梢钥闯?，隨蒽酮試劑用量增加，吸光值呈先增高后遞減趨勢(shì)，說(shuō)明蒽酮試劑用量不夠；反應(yīng)沒(méi)有達(dá)到完全；當(dāng)用量到12 mL時(shí)，吸光值達(dá)到最大，蒽酮試劑用量再繼續(xù)增加反而使吸光值有明顯的降低，因此，初步選擇蒽酮試劑用量為12 mL。

2.5.2 顯色溫度 通過(guò)圖5可以看出，蒽酮試劑用量為12 mL、反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)，隨著顯色溫度的升高，吸光值逐步增加。綜合考慮顯色溫度對(duì)吸光值的影響，顯色溫度定為100 ℃。

2.5.3 顯色時(shí)間 蒽酮試劑用量為12 mL、顯色溫度為100 ℃時(shí)，顯色時(shí)間對(duì)吸光值的影響見(jiàn)圖6。可以看出，顯色時(shí)間在12 min以前時(shí)，隨著時(shí)間增加吸光值不斷增加，超過(guò)12 min后吸光值有明顯的降低，因此，確定顯色時(shí)間12 min左右為最佳。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.6.1 因素的選取及模型評(píng)價(jià) 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用3因素3水平共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)（5個(gè)中心點(diǎn)）的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（表3）可以看出，利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得到數(shù)學(xué)模型Y=0.12-0.014X1+0.099X2-0.011X3+0.006 85X1X2- 0.028X1X3+0.004 525X2X3-0.051X12-0.019X22-0.049X32。從方差分析結(jié)果（表4）和各項(xiàng)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，模型的F=9.28、P=0.000 1（注：P < 0.05為差異顯著，P < 0.01為差異極顯著），說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所采用的二次模型顯著。模型的X2、X1X3、X12、X32的P值均小于0.05，說(shuō)明顯色溫度、蒽酮試劑用量和顯色時(shí)間的交互項(xiàng)、蒽酮試劑用量和顯色時(shí)間的二次項(xiàng)都具有顯著影響；決定因素R2值為0.972 3，說(shuō)明模型能夠很好的反應(yīng)響應(yīng)值的變化，擬合度好。各關(guān)系的效應(yīng)關(guān)系為顯色溫度 > 蒽酮試劑用量 > 顯色時(shí)間。

2.6.2 響應(yīng)面分析 通過(guò)圖7可以看出，當(dāng)蒽酮試劑用量和顯色時(shí)間都固定時(shí)，吸光值隨顯色溫度的變化幅度較大，而隨著蒽酮試劑用量以及顯色時(shí)間的變化幅度相對(duì)較小，所以顯色溫度對(duì)吸光值的影響較為顯著。通過(guò)最優(yōu)化分析，確定的最佳測(cè)定條件為蒽酮試劑用量11.79 mL、顯色溫度99.79 ℃、顯色時(shí)間11.26 min?？紤]到實(shí)際操作的局限性，將實(shí)驗(yàn)條件修正為蒽酮試劑用量12 mL、顯色溫度100 ℃、顯色時(shí)間12 min，以此條件做5次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得吸光值平均為0.277 6，與預(yù)測(cè)值基本相符，證實(shí)了響應(yīng)面法所得的回歸方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

2.7.1 精密度與回收率實(shí)驗(yàn) 選擇可溶性糖含量不同的葡萄葉片B、C，進(jìn)行方法的精密度與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果如表5。平行測(cè)定6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的RSD值為0.68%～0.81%，均符合實(shí)驗(yàn)要求，表明本方法具有良好的精密度。

2.7.2 準(zhǔn)確度與加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 通過(guò)表6可以看出，加標(biāo)回收率為97.5%～102.5%，平均加標(biāo)回收率為99.4%，RSD值為2.7%，表明本方法的準(zhǔn)確度較好。

2.7.3 葡萄葉片中可溶性糖含量 根據(jù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)得不同批次葡萄葉片中的可溶性糖含量范圍為2.54%～6.93%。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)葡萄葉片可溶性糖提取及測(cè)定過(guò)程中的單因素條件，并在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法（RSM）對(duì)蒽酮-硫酸測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化。得出葡萄葉片可溶性糖含量的測(cè)定方法是提取劑為水，用21.9%乙酸鋅和10.6%亞鐵氰化鉀作為去除顯色干擾物沉淀劑，定容過(guò)濾，吸取2 mL濾液，加入0.2 mg/mL蒽酮-硫酸試劑12 mL，在沸水浴中加熱12 min，冷卻后在波長(zhǎng) 625 nm 處測(cè)定其吸光度。

在最優(yōu)條件下，得到蒽酮-硫酸法測(cè)定葡萄葉片可溶性糖含量的精密度實(shí)驗(yàn)RSD為0.68%～0.81%，平均加標(biāo)回收率 99.4%，RSD=2.7%（n=3）。用該方法測(cè)得不同時(shí)期葡萄葉片中可溶性糖的平均含量為2.54 %～6.93%。該方法測(cè)定葡萄葉片中可溶性糖含量，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

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（本文責(zé)編：陳 偉）