甄文爽　董錫文　杜春梅　柏廣波　王也　韓月新

摘要[目的] 研究氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、制霉菌素和卡那霉素對(duì)黑木耳外觀特征及顯微結(jié)構(gòu)的影響，尋找適合的遺傳篩選標(biāo)記，同時(shí)又不降低黑木耳的產(chǎn)量與品質(zhì)。[方法]以黑木耳黑29為試驗(yàn)材料，采用平板插片培養(yǎng)法、顯微鏡觀察法測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速率、菌落形態(tài)特征和鎖狀聯(lián)合菌絲數(shù)量。[結(jié)果] 適宜濃度的青霉素和硫酸鏈霉素對(duì)黑29菌絲生長(zhǎng)都有顯著的促進(jìn)作用，而制霉菌素和卡那霉素對(duì)菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制作用；制霉菌素和卡那霉素對(duì)菌絲色澤、密度影響較大，菌落隆起現(xiàn)象明顯，偶爾出現(xiàn)褐變現(xiàn)象；隨著4種抗生素濃度的升高，鎖狀聯(lián)合菌絲比率先升高后降低，抗生素在50 μg/mL時(shí)該比率升高顯著。[結(jié)論] 一定濃度的制霉菌素或卡那霉素較適合做遺傳篩選標(biāo)記，又不影響鎖狀聯(lián)合菌絲的比率。該研究對(duì)黑木耳的遺傳育種具有指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞黑29；抗生素；菌絲；鎖狀聯(lián)合

中圖分類號(hào)S646.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）33-0057-03

Effects of Four Kinds of Antibiotics on Mycelial Growth of Auricularia auricular H29

ZHEN Wenshuang1， DONG Xiwen1，2， DU Chunmei1，2* et al

（1.College of Life Science， Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007；2.Institute of Applied Microbiology， Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007）

Abstract[Objective] To study the effect of ampicillin， streptomycin sulphate， nystatin and kanamycin on appearance characteristic and microstructure in Auricularia auricular H29， to find a good genetic screening marker， without reducing the output and quality of the strain. [Method] Mycelial growth rate， colonial morphological features and clamp connection hyphal amount were determined by plate culture and microscopic method with Auricularia auricular H29 as the material. [Result] A proper concentration of ampicillin and streptomycin sulfate significantly promoted the mycelial growth， while nystatin and kanamycin significantly inhibited it. The nystatin and kanamycin had great effects on the color， lustre and density of mycelia. The colony uplift was obvious， and the browning phenomenon occasionally appeared. With the increasing of four antibiotics concentration， the ratio of hyphal clamp connection increased firstly and then decreased. It increased significantly at 50 μg/mL antibiotics concentration. [Conclusion] A certain concentration of nystatin or kanamycin is suitable for genetic screening markers while does not affect the ratio of hyphal clamp connection. This study is of guiding significance for the genetic breeding of black fungus.

Key wordsAuricularia auricular H29；Antibiotics；Mycelia；Clamp connection

黑木耳是世界上最重要的4大栽培食用菌之一，主要生長(zhǎng)在中國和東南亞[1-2]。黑龍江省為黑木耳的主產(chǎn)區(qū)，占全國份額的60%以上[3]。黑木耳質(zhì)地滑嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，是我國珍貴的食藥用真菌，也是國內(nèi)外公認(rèn)的保健品[4-5]。隨著人們生產(chǎn)和消費(fèi)水平的提高，黑木耳產(chǎn)業(yè)正在由數(shù)量型向質(zhì)量型轉(zhuǎn)變，逐步向“高產(chǎn)、高質(zhì)、高端、高效”方向發(fā)展[6]。

選育優(yōu)良的栽培品種是推動(dòng)黑木耳產(chǎn)業(yè)科技進(jìn)步的首要問題。原生質(zhì)體融合和轉(zhuǎn)化育種有可能從子代中篩選出具有優(yōu)良性狀的新種[7]，但是利用哪種篩選標(biāo)記篩選重組子成為育種工作者面臨的一道難題?？顾幮赃z傳穩(wěn)定、容易保持，是微生物各菌種自身特征之一?？顾幮詷?biāo)記是根據(jù)不同菌種對(duì)某一藥物的抗性存在差異而進(jìn)行的。黑木耳黑29是黑龍江省科學(xué)院微生物研究所選育出來的菌種，產(chǎn)量高，且性狀優(yōu)良，是黑龍江省主栽品種之一，也是用于融合育種的重要備選菌種。尋找到適合黑木耳黑29的遺傳篩選標(biāo)記，對(duì)黑木耳新品種的選育具有重要的意義。鑒于此，筆者以黑木耳黑29為試驗(yàn)材料，采用平板插片培養(yǎng)法、顯微鏡觀察法測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速率、菌落形態(tài)特征和鎖狀聯(lián)合菌絲數(shù)量。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。

黑木耳品種黑29（H29）購于黑龍江省微生物研究所。

1.1.2培養(yǎng)基。

PDA固體培養(yǎng)基[8]和抗生素—PDA固體培養(yǎng)基（即在PDA固體培養(yǎng)基中加入不同濃度的氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、制霉菌素和卡那霉素），pH 5.6。

1.1.3試劑。

氨芐青霉素（50萬單位，國藥準(zhǔn)字H13020653，華北制藥股份有限公司）；硫酸鏈霉素（10萬單位，國藥準(zhǔn)字H37022586，瑞陽制藥有限公司）；制霉菌素片（50萬單位，國藥準(zhǔn)字H330211393，浙江震元制藥有限公司）；卡那霉素（20萬單位，國藥準(zhǔn)字H37020562，齊魯制藥有限公司）。

1.2方法

1.2.1抗生素母液的配制。

分別取5 g抗生素藥品，注入100 mL無菌水中，搖勻，制備成50 mg/mL抗生素母液，過濾除菌后于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2

培養(yǎng)基的制備。

按照常規(guī)方法制備PDA固體培養(yǎng)基?？股亍狿DA固體培養(yǎng)基制備采用PDA固體培養(yǎng)基加藥法，使其終濃度分別為50、100、150、200、300和 400 μg/mL。

1.2.3菌種的活化及接種。

用接種鏟將斜面供試菌株轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基上，26 ℃活化培養(yǎng)6 d。取菌落邊緣直徑0.85 cm健壯的菌絲塊接種到制備好的抗生素—PDA培養(yǎng)基上。同時(shí)，用鑷子夾取滅菌的蓋玻片，以傾斜45°插入接好菌的平板中，蓋玻片距離菌絲塊2～3 cm，每板插入3個(gè)蓋玻片。置于26 ℃恒溫避光培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù)，其中3個(gè)重復(fù)觀察菌絲體生長(zhǎng)狀況，3個(gè)重復(fù)插片用于顯微觀察，以上均以不加抗生素的培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.3項(xiàng)目測(cè)定

1.3.1菌絲體外觀特征。

每隔24 h觀察1次，用游標(biāo)卡尺測(cè)量培養(yǎng)8 d的黑29菌絲體直徑，計(jì)算其平均日長(zhǎng)速。菌絲平均日長(zhǎng)速（cm/d）=（菌絲直徑-接種塊直徑）/（2×天數(shù)）。同時(shí)觀察菌絲組織外觀特征，包括萌發(fā)時(shí)間，菌絲色澤、密度、長(zhǎng)勢(shì)，菌落邊緣，褐變程度，隆起狀況等。

1.3.2顯微觀察。

待蓋玻片上長(zhǎng)滿黑29菌絲，將蓋玻片取出，置于10×40倍顯微鏡下觀察記錄菌絲鎖狀聯(lián)合情況，計(jì)算鎖狀聯(lián)合菌絲比率。菌絲鎖狀聯(lián)合比率=鎖狀聯(lián)合個(gè)數(shù)/菌絲數(shù)[9]。

1.4數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0和Origin 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖。

2結(jié)果與分析

2.1不同抗生素培養(yǎng)基對(duì)黑29菌絲平均日長(zhǎng)速的影響

由圖1可知，在300 μg/mL濃度以內(nèi)，青霉素和硫酸鏈霉素對(duì)黑29菌絲生長(zhǎng)都有顯著的促進(jìn)作用（P<0.05）。當(dāng)青霉素濃度在200 μg/mL時(shí)，促進(jìn)作用最強(qiáng)，生長(zhǎng)速率提高了26.5%。硫酸鏈霉素濃度在150～300 μg/mL時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)且無差異顯著性（P>0.05），生長(zhǎng)速率提高了約163%；制霉菌素和卡那霉素對(duì)該菌具有抑制作用，隨著抗生素濃度的增加，抑制作用顯著增強(qiáng)（P<0.05），生長(zhǎng)抑制率分別為31%～57.0%和7.6%～34.4%。在200 μg/mL濃

度以內(nèi)，2種抗生素對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用無差異顯著性

（P>0.05）。在200 μg/mL以上，制霉菌素的抑制作用顯著高于卡那霉素（P<0.05）。

2.2不同抗生素培養(yǎng)基對(duì)黑29菌落形態(tài)特征的影響

在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，含氨芐青霉素和硫酸鏈霉素的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的黑29菌絲的萌發(fā)時(shí)間為<48 h。菌絲潔白、濃密，長(zhǎng)勢(shì)較好，菌落邊緣整齊舒展，無褐變和隆起現(xiàn)象，與對(duì)照菌絲相比無顯著變化。

含制霉菌素和卡那霉素的PDA培養(yǎng)基（圖2）培養(yǎng)的黑29菌絲的萌發(fā)時(shí)間為48～72 h。隨著2種抗生素濃度的升高，菌絲逐漸變得濃白、致密，菌落邊緣整齊有力，菌落背面逐漸出現(xiàn)褐變，隆起生長(zhǎng)現(xiàn)象明顯。

2.3不同抗生素培養(yǎng)基對(duì)黑29鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響

從表1可以看出，隨著4種抗生素濃度的升高，黑29鎖狀聯(lián)合菌絲比率先升高后降低，抗生素濃度在50 μg/mL時(shí)，該比率顯著高于不加抗生素培養(yǎng)的對(duì)照菌株（P<0.05），分別提高了34.6%、42.5%、18.9%和33.0%。濃度在50～300 μg/mL時(shí)，該比率有一定程度的提高，但與對(duì)照菌株相比無差異顯著性（P>0.05）?？股卦诟邼舛认戮@著降低鎖狀聯(lián)合菌絲的比率（P<0.05）。

3結(jié)論與討論

自然抗藥性標(biāo)記主要根據(jù)真菌有較強(qiáng)的對(duì)抗細(xì)菌類抗菌素的能力，在真菌中得到廣泛應(yīng)用。1992年開始應(yīng)用于平菇、香菇等的抗性轉(zhuǎn)化。張國廣等[10-13]對(duì)靈芝、秀珍菇、真姬菇等食用菌進(jìn)行了抗生素的敏感性研究，得到抗生素在不同程度下對(duì)食用菌生長(zhǎng)的影響參數(shù)。胡樂琴[14]進(jìn)行了香菇對(duì)潮霉素的抗性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明香菇對(duì)潮霉素極為敏感，在固定的條件下抗性穩(wěn)定。張學(xué)煒等[15]利用配制不同濃度的潮霉素試液，得出潮霉素對(duì)深黃被孢霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的重要影響。王淑珍等[16]用食用菌對(duì)潮霉素的自然抗性篩選香菇和松茸的融合子。但抗生素對(duì)黑木耳菌絲生長(zhǎng)的影響尚鮮見報(bào)道。該研究結(jié)果顯示，適宜濃度的氨芐青霉素對(duì)菌絲生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，菌落外觀特征與對(duì)照菌株相比沒有

發(fā)生明顯的變化，這與張國廣等的研究結(jié)果類似，硫酸鏈

霉素也具有同樣的作用效應(yīng)。試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的卡那霉素對(duì)菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，與張國廣等人的研究結(jié)果相反，這可能與菌株自身的遺傳特性有關(guān)。制霉菌素具有共軛多烯大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，能抑制真菌的活性，研究結(jié)果顯示適宜濃度的制霉菌素既能抑制黑29菌絲的生長(zhǎng)，又完全抑制雜菌的生長(zhǎng)。在制霉菌素和卡那霉素培養(yǎng)基上，黑29菌落表現(xiàn)明顯的隆起生長(zhǎng)現(xiàn)象，與筆者研究的斜臥青霉A10在潮霉素平板上的生長(zhǎng)狀態(tài)一致，可能是微生物菌體逃避不良環(huán)境的一種自然屬性。

鎖狀聯(lián)合是黑木耳菌絲生長(zhǎng)發(fā)育過程中明顯的指示特征，形成鎖狀聯(lián)合的菌絲再形成耳基的比例為100%，而不形成鎖狀聯(lián)合的菌絲形成耳基的比例僅為20%左右[17]。研究結(jié)果顯示，較低濃度的抗生素能顯著提高鎖狀聯(lián)合菌絲的比率，即使在敏感的抗生素濃度下，該比率也未受到明顯的影響。

研究結(jié)果表明，卡那霉素或制霉菌素在一定范圍內(nèi)能抑制黑29菌絲的生長(zhǎng)速率，對(duì)鎖狀聯(lián)合菌絲比率無明顯影響，該藥品具有廉價(jià)、無毒的特性，可考慮作為育種的抗性篩選標(biāo)記。

45卷33期甄文爽等4種抗生素對(duì)黑木耳黑29菌絲生長(zhǎng)的影響

參考文獻(xiàn)

[1] YAN P S，LUO X C，ZHOU Q.RAPD molecular differentiation of the cultivated strains of the jelly mushrooms，Auricularia auricula and A.polytrichac[J].World journal of microbiology and biotechnology，2004，20（8）：795-799.

[2] VEERALAKSHMI S，AHILA DEVI P，PRAKASAM V，et al.Molecular characterization and standardization of cultivation for wood ear mushroom[Auricularia polytricha（Mont.）]Sacc[J].International journal of biotechnology research，2014，2（5）：60-64.

[3] 于文志.黑龍江省森工企業(yè)黑木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向[J].中國林副特產(chǎn)，2007，41（6）：93-95.

[4] 戴肖東，馬銀鵬，張介馳，等.黑龍江省木耳主栽品種遺傳多樣性分析[J].生物技術(shù)，2014，24（5）：86-89.

[5] 何容，羅孝坤，尚陸娥，等.24個(gè)黑木耳栽培品種比較試驗(yàn)[J].中國食用菌，2014，33（4）：28-31，34.

[6] 萬魯長(zhǎng)，辛淑榮.山東省食用菌產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢(shì)與產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新方向[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，45（12）：103-106.

[7] 楊國良，楊秀琴，楊曉仙，等.毛木耳與黑木耳的原生質(zhì)體融合育種[J].中國食用菌，1990，9（4）：14-16.

[8] 李秀霞.生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)：下冊(cè)[M].沈陽：東北大學(xué)出版社，2013.

[9] 王妍，杜春梅，姜忠元，等.不同培養(yǎng)基對(duì)黑木耳鎖狀聯(lián)合菌絲比率的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（35）：49-50.

[10] 張國廣，黃家福，陳麗萍，等.靈芝菌絲體對(duì)4種抗生素的敏感性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（14）：7701-7702，7719.

[11] 鄒金美，王栩，黃世玉，等.真姬菇菌絲體對(duì)四種抗生素的敏感性研究[J].北方園藝，2010（18）：201-203.

[12] 張國廣，鄒金美，吳海仙，等.秀珍菇對(duì)4種抗菌素的敏感性研究[J].江西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（5）：350-352.

[13] 張國廣，王麗霞，黃淑惠，等.四種抗菌素對(duì)側(cè)耳科三種食用菌菌絲生長(zhǎng)的影響[J].北方園藝，2010（2）：215-217.

[14] 胡樂琴，潘迎捷.香菇對(duì)潮霉素的抗性實(shí)驗(yàn)[J].微生物雜志，2007，23（4）：14-16.

[15] 張學(xué)煒，王笑梅，李明春，等.以潮霉素B抗性為選擇標(biāo)記的深黃被孢霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[J].生物工程學(xué)報(bào)，2007，23（3）：264-268.

[16] 王淑珍，白晨，高雁，等.松茸與香菇原生質(zhì)體融合的研究[J].食用菌，2003，25（2）：9-10.

[17] 王妍，姜忠元，董錫文.不同黑木耳品種鎖狀聯(lián)合形成的差異性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，56（4）：682-685.