張?chǎng)? 國(guó)振宇 趙曉迪 龔明波 李世貴 顧金剛 楊禮富

摘 要 采用對(duì)扣法研究11株木霉菌株揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果，采用固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行成分分析。結(jié)果表明，不同木霉菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量差異較大。11株木霉共檢出257種揮發(fā)性物質(zhì)，均能檢測(cè)到六甲基環(huán)三硅氧烷、八甲基環(huán)四硅氧烷兩種化合物；聚類分析在相關(guān)系數(shù)距離為19時(shí)，可將11株木霉菌株歸為三大類；257種揮發(fā)性物質(zhì)可簡(jiǎn)化為3個(gè)主成分，包含30種揮發(fā)性物質(zhì)，不同木霉揮發(fā)性物質(zhì)主成分得分與拮抗尖孢鐮刀菌的抑菌率之間極顯著相關(guān)，表明11株木霉菌株對(duì)尖孢鐮刀菌均有抑制作用。

關(guān)鍵詞 木霉；尖孢鐮刀菌；揮發(fā)性有機(jī)物；抑菌率；主成分分析

中圖分類號(hào) S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The inhibitory effects and compounds of volatile substances from 11 Trichoderma strains against Fusarium oxysporum were analyzed. The results showed that there were significant differences between the contents and types of volatile substances of different Trichoderma species. 11 species of Trichoderma were detected 257 kinds of volatile substances， Which can be detected hexamethyl cyclotrisiloxane， octamethyl cyclotetrasiloxane two compounds； When the cluster analysis in the correlation coefficient distance was 19 hours， the 11 Trichoderma could be divided into 3 components. The results showed that ACCC33104 had the highest total score of 30 volatile substances， and the difference of the volatile components of T. viride was different from that of its antagonistic effect on F. oxysporum. The effect of bacteria have a certain relevance. The results showed that Trichoderma had inhibitory effect on F. oxysporum.

Key words Trichoderma； Fusarium oxysporum； volatile organic compounds； antimicrobial rate； principal component analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.019

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是一種世界性分布的土傳病原真菌，寄主范圍廣泛，可引起瓜類、茄科、棉、豆科及花卉等多種植物枯萎病的發(fā)生，如香蕉枯萎病就是由古巴尖孢鐮刀菌引起的一種土傳病害[1]。微生物能夠產(chǎn)生多種揮發(fā)性的次級(jí)代謝產(chǎn)物[2]，且具有分子量低、弱極性、低沸點(diǎn)和親脂性等特點(diǎn)[3-4]，能夠長(zhǎng)距離傳播，并介導(dǎo)有機(jī)體間非直接接觸的相互作用。木霉菌是一類重要的植物病害生防菌[5]，不同種屬的木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量不同，且對(duì)病原真菌有不同的抗菌活性[6-7]。Klaus Fiedler[8]等測(cè)定哈茨木霉和擬康寧木霉的揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)它們能夠產(chǎn)生乙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇和3-辛酮等化合物，并且產(chǎn)生的倍半萜類顯示了1個(gè)典型的特征圖譜；Tarus[9]等測(cè)定了哈茨木霉和長(zhǎng)枝木霉的揮發(fā)性有機(jī)物及其對(duì)細(xì)菌和蜜環(huán)菌的抑制作用，結(jié)果表明6-戊基-2H-吡喃-2-酮具有最高的抗真菌和抗菌活性，且在200 ppm時(shí)完全抑制蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)；Samantha Lee等[10]檢測(cè)了生長(zhǎng)5 d和14 d深綠木霉的揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)隨著木霉的生長(zhǎng)，有極少的揮發(fā)性物質(zhì)不再能被檢測(cè)，而產(chǎn)生了更多的新的揮發(fā)性物質(zhì)，這就說(shuō)明木霉產(chǎn)生的種類與木霉菌株本身的年齡有關(guān)。本研究針對(duì)香蕉枯萎病研究11株木霉所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)其的拮抗效果，同時(shí)對(duì)不同種屬的木霉菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行成分分析，以探索木霉揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量及其對(duì)尖孢鐮刀菌抑制效果之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

木霉菌株保存在中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心和本實(shí)驗(yàn)室： Trichoderma atroviride 5-1P1（菌株編號(hào)：ACCC32804）、T. atroviride 16-1M2（菌株編號(hào)：ACCC32818）、T. atroviride 70-1M3（菌株編號(hào)：ACCC32866）、T. harzianum 71-1P2（菌株編號(hào)：ACCC32870）、T. atroviride 193-2P1（菌株編號(hào)：ACCC33007）、T. atroviride 222-2M1（菌株編號(hào)：ACCC33100）、T. harzianum 223-2M1（菌株編號(hào)：ACCC33104）、T. harzianum 226-2P1（菌株編號(hào)：ACCC33114）、T. atroviride 231-1M2（菌株編號(hào)：ACCC33124）、T. atroviride 247-2P2（菌株編號(hào)：ACCC33189）、T. atroviride 258-2M1（菌株編號(hào)：ACCC33205）。植物病原菌：香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種FOC4（菌株編號(hào)：ACCC38875）作為靶標(biāo)病原菌，由中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供，用于木霉揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)其抑制作用的研究。

1.2 方法

1.2.1 木霉揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)尖孢鐮刀菌的作用 采用對(duì)扣法[11]。用打孔器（d=0.5 cm）在培養(yǎng)5 d的木霉菌菌落邊緣打取菌齡相同的菌塊，接種于PDA平板中央，在其上蓋雙層直徑略大于10 cm的無(wú)菌玻璃紙，上方扣一個(gè)直徑同為9 cm，中央剛接種尖孢鐮刀菌（d=0.5 cm）的平板，用封口膜密封。以未接種供試木霉的PDA平板與接病原菌的平板對(duì)扣培養(yǎng)作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。5 d后用十字交叉法測(cè)量病原菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-0.5）×100%

1.2.2 木霉揮發(fā)性物質(zhì)的分離 將供試菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，用打孔器（d=0.5 cm）取1塊菌餅接種在二分隔培養(yǎng)皿一側(cè)小室的PDA培養(yǎng)基上，用雙層封口膜封住培養(yǎng)皿，25 ℃培養(yǎng)7 d。以不接種木霉的空白PDA平板作為對(duì)照。

首先將固相微萃?。⊿PME）針頭插入氣相色譜儀的進(jìn)樣口，推出萃取頭，在氦氣流中240 ℃老化20 min，然后將萃取頭縮回保護(hù)針管，立即將SPME針頭插入二分隔培養(yǎng)皿未培養(yǎng)木霉的一側(cè)小室，推出萃取頭，萃取揮發(fā)性物質(zhì)45 min，再將SPME針頭插入氣相色譜儀的進(jìn)樣口，推出萃取頭，解吸附30 s，隨后取出SPME進(jìn)樣手柄和萃取頭。

1.2.3 木霉揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定 色譜條件[12]：用HP-5MS型毛細(xì)管柱分離揮發(fā)性物質(zhì)，載氣為氮?dú)?，流速? mL/min，不分流模式。升溫程序：30 ℃維持2 min，再以5 ℃/min的速率升溫至220 ℃；post run 270 ℃維持1 min。電離電壓為70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)譜掃描速率為3.35 scans/s，質(zhì)譜范圍20～450 amu。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析與處理采用質(zhì)譜化學(xué)工作站軟件分析（MSD ChemStation G1701DA，安捷倫公司），通過(guò)Agilent NIST13數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定揮發(fā)性物質(zhì)，扣除對(duì)照組檢測(cè)到的色譜峰，用峰面積歸一化法測(cè)定了這些化學(xué)成分在各自樣品中的相對(duì)含量。用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行抑菌率的統(tǒng)計(jì)分析以及揮發(fā)性物質(zhì)的聚類分析、主成分分析以及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性物質(zhì)拮抗效果分析

不同種屬木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率不同。其中，菌株ACCC33104、ACCC33100、ACCC33007、ACCC33124、ACCC33205這5株菌的抑菌率分別為35.29%、34.02%、33.19%、30.22%、30.17%；菌株ACCC32866、ACCC32818的抑菌率分別為28.77%、28.23%；菌株ACCC33189、ACCC32870、ACCC32804、ACCC33114的抑菌率則分別為23.61%、22.69%、21.88%、20.83%（見(jiàn)圖1）。根據(jù)差異顯著性分析，菌株ACCC33104、ACCC33100、ACCC33007，菌株ACCC33124、ACCC33205、ACCC32866、ACCC32818，菌株ACCC33189、ACCC32870、ACCC32804、ACCC33114這三組之間差異并不顯著，其余均存在顯著差異。

2.2 揮發(fā)性物質(zhì)成分分析

通過(guò)對(duì)GC-MS譜圖的NIST 13譜庫(kù)搜索和人工解析，從11株木霉中共鑒定出257種揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表1。其中，烷類68種，酯類47種，烯類36種，醇類29種，酮類23種，苯類9種，醚類7種，其他44種，分別占檢出揮發(fā)性物質(zhì)的26.46%、18.29%、14.01%、11.28%、8.95%、3.50%、2.72%和17.12%，就種類的多樣性而言，木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)主要是烷類、酯類，其次是烯類、醇類和酮類；就含量的多樣性而言，木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)主要是醇類。其中，在11株木霉中均能檢測(cè)到六甲基環(huán)三硅氧烷、八甲基環(huán)四硅氧烷兩種化合物，其相對(duì)含量范圍分別為0.540 9%～6.111 5%、0.345 2%～4.430 8%。

2.3 揮發(fā)性物質(zhì)聚類分析

從表1可見(jiàn)，不同種屬木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量存在較大差異，甚至同一種屬木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量也不同。由圖2可見(jiàn)，相關(guān)系數(shù)距離為19時(shí)，可以把11株木霉分成三大類，第一類包括ACCC33124、ACCC33205、ACCC33114、ACCC32870、ACCC33189、ACCC32866、ACCC32818；第二類包括ACCC32804；第三類包括ACCC33007、ACCC33104、ACCC33100；聚類結(jié)果表明：每一類別中木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)較為接近。進(jìn)一步分析表明：木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)種類與木霉種屬之間無(wú)相關(guān)性。

2.4 11株木霉揮發(fā)性物質(zhì)的主成分分析

選取30種物質(zhì)對(duì)11株木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，從主成分特征值和貢獻(xiàn)率（表2）可見(jiàn)，前3個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為43.396%、15.892%、13.615%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到72.903%。因此，提取3個(gè)主成分，即m=3。從旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣表（表3）可知，3個(gè)主成分包含的揮發(fā)性物質(zhì)反映了11株木霉揮發(fā)性物質(zhì)的主要信息。

從表3可知，第1主成分主要反映乙醇、2-甲基-1-丙醇、六甲基-環(huán)三硅氧烷、八甲基-環(huán)四硅氧烷、十甲基-環(huán)戊硅氧烷、十二烷、十三烷、十二甲基-環(huán)己硅氧烷、十四烷、2，2，3，5，6，6，7-七甲基[1，4，2，3，5，6，7]二氧雜戊烷、3-羥基丁酮、6-戊基-2H-吡喃-2-酮、1，3-二甲基-苯、丁基化羥基甲苯、苯乙烯、反式 - 香檸檬烯、2-戊基-呋喃、二氧化碳、阿莫地喹等成分的信息；第2主成分主要反映亞硫酸，2-乙基己基十六烷基酯、乙苯、[S-（E，Z，E，E）]-3，7，11-三甲基-14-（1-甲基乙基）-1，3，6，10-環(huán)十四碳四烯、（E）-3-十二碳烯、2，2，4，6，6-五甲基-3-庚烯等成分的信息；第3主成分主要反映二甲基-硅烷二醇、3-甲基-1-丁醇、三甲基-十二烷、2，6，10，14-四甲基-十六烷、（R*，R*）-（.+/-.）-1，1-[1，2-雙（1，1-二甲基乙基）-1，2-乙二基]雙-環(huán)己烷、β-水芹烯等成分的信息。

第1主成分主要是以烷類為主，第2主成分主要是以烯類為主，第3主成分主要以烷類和醇類為主，這與總成分分析得出的種類多樣性結(jié)果基本相符，因此這些主成分具有較強(qiáng)的代表性，可以作為評(píng)價(jià)木霉產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)種類的重要指標(biāo)。

根據(jù)各主成分的貢獻(xiàn)率可以得到主成分綜合評(píng)價(jià)指數(shù)，在本研究中，主成分綜合評(píng)價(jià)指數(shù)F=0.60F1+0.22F2+0.19F3。

11株木霉的揮發(fā)性物質(zhì)的3個(gè)主成分得分見(jiàn)表4，可見(jiàn)綜合排名ACCC33104為第一，其次為ACCC33100和ACCC33007。

2.5 相關(guān)性分析

將11株木霉揮發(fā)性物質(zhì)的主成分得分與拮抗尖孢鐮刀菌的抑菌率進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明（表5），揮發(fā)性物質(zhì)的主成分得分與抑菌率之間的相關(guān)性系數(shù)為0.869，對(duì)應(yīng)的顯著性為0.001，表明二者之間的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平。這就說(shuō)明ACCC33104菌株在拮抗尖孢鐮刀菌和產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)上都具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

3 討論

本文以香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種FOC4為靶標(biāo)，對(duì)木霉菌株所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌效果以及成分進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明，T. atroviride 5-1P1等11株木霉揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)尖孢鐮刀菌均有明顯的抑制作用。從11株木霉中共鑒定出257種揮發(fā)性物質(zhì)，其中烷類68種，酯類47種，烯類36種，醇類29種，酮類23種，苯類9種，醚類7種，其他44種，多于現(xiàn)有的研究報(bào)道[4，13-14]。木霉揮發(fā)性物質(zhì)與拮抗尖孢鐮刀菌的抑菌率顯著相關(guān)。不同種屬的木霉在揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量上存在一定差異，這種差異與木霉本身的性質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)條件以及萃取方法的不同都有一定的關(guān)系[13，15]。Wheatley[16]等測(cè)定了擬康寧木霉和綠色木霉在兩種不同培養(yǎng)基上的揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)不同的木霉種屬和培養(yǎng)基類型能夠產(chǎn)生不同種類和含量的揮發(fā)性物質(zhì)，這與本研究得到的結(jié)果相符。截至目前，盡管大量的木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)已被鑒定，但僅少數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)的功能被證實(shí)。6-戊基-2H-吡喃-2-酮，具有特征的甜椰子狀香味的聚酮化合物，其主要生物學(xué)功能包括減少霉菌毒素的產(chǎn)生[17-18]、抗真菌活性[19]以及促進(jìn)生長(zhǎng)等[20]，本研究中能夠產(chǎn)生該物質(zhì)的木霉有6株，含量從0.79%～19.6%，該物質(zhì)在康寧和哈茨木霉中均有報(bào)道，但本研究中有4株深綠木霉中首次被檢出。通過(guò)深入研究，有望揭示木霉揮發(fā)性物質(zhì)拮抗尖孢鐮刀菌的作用機(jī)制，為研發(fā)由尖孢鐮刀菌引起的作物土傳病害生物防治技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 黎永堅(jiān)， 于 莉. 香蕉枯萎病發(fā)病機(jī)制及其防治技術(shù)研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2006， 22（8）： 515-519.

[2] Daniela Minerdi， Simone Bossi， Maria Lodovica Gullino， et al. Volatile organic compounds： a potential direct long-distance mechanism for antagonistic action of Fusarium oxysporum strain MSA 35[J]. Environmental Microbiology， 2009， 11（4）： 844-854.

[3] Richard Hung， Samantha Lee， Joan W Bennett. Arabidopsis thaliana as a model system for testing the effect of Trichoderma volatile organic compounds[J]. Fungal Ecology， 2013， 6： 19-26.

[4] Morath S U， Hung R， Bennett J W. Fungal volatile organic compounds： a review with emphasis on their biotechnological potential[J]. Fungal Biology Reviews， 2012， 26： 73-83.

[5] Druzhinina I S， Seidl-Seiboth V， Herrera-Estrella A， et al. Trichoderma： the genomics of opportunistic success[J]. Nature Reviews Microbiology， 2011， 9： 749-759.

[6] Wilkins K， Larsen K， Simkus M. Volatile metabolites from mold growth on building materials and synthetic media[J]. Chemosphere， 2000， 41： 437-446.

[7] Bruce A， Verrall S， Hackett C A， et al. Identification of volatile organic compounds （VOCs） from bacteria and yeast causing growth inhibition of sapstain fungi[J]. Holzforschung， 2004， 58： 193-198.

[8] Fiedler K， Schütz E， Geh S. Detection of microbial volatile organic compounds（MVOCs） produced by moulds on various materials[J]. International Journal of Hygiene and Environmental Health， 2001， 204： 111-121.

[9] Tarus P K， Langat-Thoruwa C C， Wanyonyi A W， et al. Bioactive metabolites from Trichoderma harzianum and Trichoderma longibrachiatum[J]. Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia， 2003， 17： 185-190.

[10] Lee S， Hung R， Yap M， et al. Age matters： the effects of volatile organic compounds emitted by Trichoderma atroviride on plant growth[J]. Archives of Microbiology， 2015， 197： 723-727.

[11] Muthukumar A， Eswaran A， Sanjeevkumas K. Exploitation of Trichoderma species on the growth of Pythium Aphanidermatum in chilli[J]. Brazilian Journal of Microbiology， 2011， 42： 1 598 -1 607.

[12] Hexon Angel Contreras-Cornejo， Lourdes Macías-Rodríguez， Alfredo Herrera-Estrella， et al. The 4-phosphopantetheinyl transferase of Trichoderma virens plays a role in plant protection against Botrytis cinerea through volatile organic compound emission[J]. Plant and Soil， 2014， 379： 261-274.

[13] Norbert Stoppacher， Bernhard Kluger， Susanne Zeilinger， et al. Identification and profiling of volatile metabolites of the biocontrol fungus Trichoderma atroviride by HS-SPME-GC-MS[J]. Journal of Microbiological Methods， 2010， 81： 187-193.

[14] Henryk Jele， Lidia Bl/ aszczyk， Jerzy Chel/ kowski， et al. Formation of 6-n-pentyl-2H-pyran-2-one （6-PAP） and other volatiles by different Trichoderma species[J]. Mycological Progress， 2014， 13： 589-600.

[15] Nemcvovicv M， Jakubíková L， Víden I， et al. Induction of conidiation by endogenousvolatile compounds in Trichoderma spp.[J]. FEMS Microbiology Letters， 2008， 284： 231-236.

[16] Wheatley R， Hackett C， Bruce A， et al. Effect of substrate composition on the production of volatile organic compounds from Trichoderma spp. inhibitory to wood decay fungi[J]. International Biodeterioration and Biodegradation， 1997， 39（2-3）： 199-205.

[17] Horace G Cutler， Richard H Cox， Farrist G Crumley， et al. 6-Pentyl-α-pyrone from Trichoderma harzianum： Its plant growth inhibitory and antimicrobial properties[J]. Agricultural and Biological Chemistry， 1986， 50： 2 943-2 945.

[18] Cooney J M， Lauren D R， Di Menna M E. Impact of competitive fungi on trichothecene production by Fusarium graminearum[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2001， 49： 522-526.

[19] Scarselletti R， Faull J L. In vitro activity of 6-pentyl-α-pyrone， a metabolite of Trichoderma harzianum， in the inhibition of Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici[J]. Mycological Research， 1994， 98： 1 207-1 209.

[20] Vinale F， Sivasithamparam K， Ghisalberti E L， et al. A novel role for Trichoderma secondary metabolites in the interactions with plants[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2008， 72： 80-86.