賀超 洪廣 吳靜嫻 馮正陽 王文基 陳華譜 朱春華 李廣麗
摘要[目的]克隆性別調(diào)控基因Sox9的cDNA序列,為后續(xù)開展Sox9分子進(jìn)化及性別調(diào)控功能的研究提供參考。[方法]從泰國斗魚中克隆鑒定出Sox9基因的cDNA序列全長,并展開序列分析及在雌雄個體中的組織分布研究。[結(jié)果]利用Smart-RACE的分子克隆方法,從泰國斗魚精巢中克隆得到Sox9基因的cDNA序列,全長為2 201 bp,其中開放讀碼框1 449 bp;氨基酸比對分析顯示Sox9氨基酸序列中的HMG序列的保守性相當(dāng)高;通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)泰國斗魚Sox9與半滑舌鰨的親緣關(guān)系最近;利用RT-PCR的方法檢驗了泰國斗魚Sox9基因在雌雄個體中的組織分布,結(jié)果發(fā)現(xiàn)泰國斗魚Sox9基因在雌性的肌肉中表達(dá)量最高,其次在腦和腸中,而在卵巢未檢測到表達(dá)信號;在雄性中,Sox9基因在腦和精巢中的表達(dá)量最高。[結(jié)論]泰國斗魚Sox9具有保守的結(jié)構(gòu)特征,并且在組織分布中顯示出表達(dá)特異性及性別差異性。
關(guān)鍵詞泰國斗魚;Sox9;序列分析;組織分布
中圖分類號S917.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼
A文章編號0517-6611(2017)08-0151-05
Study on Cloning and Tissue Expression of Sox9 in Betta splendens
HE Chao,HONG Guang,WU Jingxian,CHEN Huapu* et al(Key Laboratory of Marine Ecology and Aquaculture Environment of Zhanjiang,Guangdong Ocean University,Zhanjiang,Guangdong 524088)
Abstract[Objective] To clone the fulllength cDNA sequence of sexual regulation gene Sox9 ,to provide a basis for the molecular evolution and functional studies of Sox9 in Betta splendens.[Method]The Sox9 cDNA sequence in B.splendens was cloned.Sequence analysis and research of organizations distribution in the male and female individual was carried out.[Result]The Sox9 cDNA sequence in the testis of B.Splendens was cloned by using the rapidamplification of cDNA ends (RACE),it contained 2 201 bp nucleotides with the open reading frame (ORF) of 1 449 bp;the amino acid sequence alignment showed that the HMG (the high mobility group box) domain of Sox9 was rather conserved; based on the phylogenetic analysis,the B.splendens Sox9 protein was closer to Cynoglossus semilaevis;tissue distribution analyzed by RTPCR showed that the expressions of Sox9 were highly expressed in muscle,moderate in brain and gun,and undetectable in ovary in female; high expression level of Sox9 was found in testis and brain in male.[Conclusion]The Sox9 in B.Splendens shows conservative structural characteristics,tissue express specificity and gender differences.
Key wordsBetta splendens;Sox9;Sequence analysis;Tissue distribution
Sox(SRYrelated high mobility group box)家族目前已經(jīng)被克隆鑒定出30多個成員。Sox家族成員均含有79個高度保守HMG盒(high mobility group box)的結(jié)構(gòu)域,主要是與下游調(diào)控基因的DNA結(jié)合,成為Sox家族成員的最顯著性結(jié)構(gòu)特征[1]。其中Sox9被認(rèn)為是Sox家族中與性別分化較相關(guān)的成員之一[2],受到了廣泛的關(guān)注與研究。在哺乳類、鳥類和爬行類的性分化時期,Sox9基因在雄性生殖嵴的表達(dá)量急劇上調(diào)[3-5]。在小鼠中,雌性性腺中Sox9的異常表達(dá)導(dǎo)致了睪丸的形成[6]。Sox9基因的缺失會造成雄性逆轉(zhuǎn)成為雌性,從而表明Sox9基因在精巢發(fā)育中起了至關(guān)重要的作用,并被認(rèn)為是雄性性別決定因子[7]。但在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn),在成年小鼠卵巢中,Sox9在卵泡發(fā)育過程中同樣扮演著重要的調(diào)控角色,顯示出Sox9在雌雄發(fā)育調(diào)控中的雙重生理功能[8]。
魚類的性腺發(fā)育具有多種形式,如雌雄異體、雌雄同體、先雌后雄和先雄后雌等。魚類多樣化的發(fā)育模式為研究性別分化機(jī)制提供了更加理想的模型。Sox9作為公認(rèn)的性別分化調(diào)控因子之一,在魚類研究中同樣受到了廣泛的關(guān)注。目前已經(jīng)在斑馬魚(Danio rerio) [9]、 鱔魚(Monopterus albus)[10]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss) [11]、青鳉(Oryzias latipes)[12]、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides) [13]、大西洋鱈魚(Gadus morhua) [14]、金錢魚(Scatophagus argus) [15]和胡子鯰 (Clarias batrachus) [16]等魚類中展開研究,證實Sox9在魚類性別分化中發(fā)揮著重要的作用。但由于魚類屬于低等的脊椎動物,易受外界因子的影響,導(dǎo)致性別的可塑性較高,因此需要在更多的魚類中進(jìn)行拓展研究,才能更好地從差異中獲得共性結(jié)果,從而更好地闡述Sox9基因在魚類中的性別調(diào)控功能。
泰國斗魚(Betta splendens)原產(chǎn)于泰國,又被稱為彩雀魚,是一種重要的熱帶小型淡水物種,同時是一種被廣泛養(yǎng)殖的觀賞魚。泰國斗魚雌雄個體差異十分明顯,雄性天生好斗,色彩豐富多樣,環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng),價格便宜,易于飼養(yǎng),是一種研究魚類生理功能的理想模型。目前對泰國斗魚的分子生物學(xué)研究較少,筆者以泰國斗魚為研究對象,利用現(xiàn)代分子克隆的技術(shù)方法,從泰國斗魚的精巢中克隆鑒定出Sox9基因的cDNA序列全長,并開展了Sox9基因相關(guān)序列的結(jié)構(gòu)分析及組織表達(dá)分布研究,為深入闡明Sox9基因在泰國斗魚中的生理功能奠定了基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1試驗魚試驗用魚(泰國斗魚)購于廣東省湛江市霞山區(qū)花鳥市場。試驗中,將泰國斗魚置于冰上麻醉,等其失去知覺后,將其肌肉、性腺、腦、垂體、心臟、肝、腎、脾、腸等組織或器官取出,液氮速凍,然后保存于-80 ℃ 超低溫冰箱中備用。
1.2試劑
總RNA提取試劑Trizol Reagent購于Life公司; DNase Ⅰ和the ReverTraAce-a first-strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購于TOYOBO公司;Smart-RACE試劑盒購于TaKaRa Clontech公司;Taq酶和載體pTZ7R/T購于MBI Fermentas公司; 質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒購于廣州東盛公司;化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。
1.3序列比對與引物設(shè)計
通過NCBI 基因庫的序列搜索比對,找出與泰國斗魚Sox9序列同源性最高的魚類Sox9序列。通過比對分析,根據(jù)序列的保守結(jié)構(gòu),設(shè)計出用于泰國斗魚Sox9基因克隆與組織表達(dá)分析等的引物(表1)。
1.4總RNA提取
根據(jù)Trizol reagent試劑盒說明書的要
求操作,獲得泰國斗魚各組織的總RNA。總RNA的濃度和完整性分布利用核酸測定儀和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。
1.5分子克隆
以泰國斗魚精巢的總RNA作為模板,利用the ReverTraAce-a first-strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成克隆Sox9中間片段的cDNA模板,并通過中間片段克隆引物的擴(kuò)展,克隆獲得泰國斗魚Sox9基因的cDNA中間片段序列。然后根據(jù)中間片段,設(shè)計5′和3′Race的特異克隆引物。根據(jù)Smart-RACE試劑盒的說明書進(jìn)行克隆,分別獲得泰國斗魚Sox9基因5′和3′端的序列,然后通過拼接,獲得cDNA序列全長。最后通過全長特異引物驗證,獲得確切的Sox9 cDNA序列全長。
1.6序列分析
利用DNAtool6.0軟件分析泰國斗魚Sox9基因的cDNA序列,確定其開放讀碼框(Open Reading Frame,ORF)并推導(dǎo)氨基酸序列,用 ProtParam 軟件預(yù)測蛋白分子量及理論等電點(diǎn)等參數(shù)。使用Clustalx1.8進(jìn)行氨基酸序列比對分析,并用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
1.7組織分布從各個組織的總RNA中吸取1 μg,用DNase Ⅰ將基因組DNA去除,然后根據(jù)第一鏈cDNA合成的說明書合成cDNA模板。利用泰國斗魚Sox9基因的特異引物與β-actin基因作為內(nèi)參,進(jìn)行組織分布的半定量檢測。試驗所用的反應(yīng)體系為25 μL,循環(huán)條件為 94 ℃預(yù)變性4 min;接著94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min,40個循環(huán),72 ℃延伸1 min,吸取8 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,用天能Tanon2500R凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照與半定量分析。
2結(jié)果與分析
2.1泰國斗魚Sox9基因的cDNA序列全長
利用DNAStar軟件去除載體序列并將其進(jìn)行拼接,得到泰國斗魚Sox9完整的cDNA序列。泰國斗魚Sox9 cDNA全長為2 201 bp,包括 5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)109 bp,3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)554 bp,開放閱讀框(ORF)為1 449 bp(圖1)。其中在第104~172 aa之間為Sox9 HMG-box,在該盒內(nèi)存在1個特征性基序AQAARRKL,2個核定位信號 NLS(NLS1:KRPMNAFMVWAQAARRK;NLS2:RRRK)。用 ProtParam 軟件預(yù)測泰國斗魚Sox9 蛋白分子量為 52.972 kD,理論等電點(diǎn)為 6.23。
2.2泰國斗魚Sox9的氨基酸序列比對及同源性分析 將泰國斗魚Sox9與已知魚類的Sox9序列進(jìn)行同源性分析(圖2),結(jié)果顯示泰國斗魚Sox9蛋白前體和其他魚類的Sox9蛋白類似,均具有Sox家族的特征性結(jié)構(gòu)。 泰國斗魚Sox9蛋白前體中的HMG結(jié)構(gòu)域和其他魚類HMG結(jié)構(gòu)域同源性較高,顯示出高度的保守性,只有1個氨基酸殘基的差異。另外,在HMG結(jié)構(gòu)域內(nèi)同樣存在1個特征性基序AQAARRKL,以及2個核定位信號NLS1和NLS2。
2.3泰國斗魚Sox9系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
利用鄰位相連算法構(gòu)建泰國斗魚以及其他脊椎動物Sox9蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 3),結(jié)果顯示泰國斗魚的Sox9蛋白與其他魚類聚為一簇,其中與半滑舌鰨的親緣關(guān)系最近,其次是尖吻鱸、斜帶石斑魚、金錢魚和黃鱔等,與雞、小鼠和人類等高等脊椎動物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
2.4泰國斗魚Sox9基因的組織分布
利用RT-PCR半定量的方法分析Sox9基因在泰國斗魚雌雄個體不同組織中的表達(dá)情況。在雌性中,Sox9在肌肉中的表達(dá)量最高,其次為腦和腸組織,在腎臟和胃檢測到較低的表達(dá)量,在垂體中檢測到微弱的表達(dá)信號,在肝臟、卵巢和心臟中均檢測不到表達(dá)信號。在雄性中,Sox9在腦和精巢中的表達(dá)量較高,其次是腎臟和肌肉,在垂體、肝臟、腎臟、心臟和腸中均未檢測到表達(dá)信號。
3結(jié)論與討論
通過現(xiàn)代分子克隆技術(shù)方法,克隆獲得泰國斗魚Sox9基因的cDNA序列全長。通過序列分析,發(fā)現(xiàn)泰國斗魚的Sox9與其他魚類的Sox9蛋白一樣,具有Sox家族成員典型的HMG結(jié)構(gòu),并且顯示出高度的保守性[1]。泰國斗魚Sox9蛋白與其他魚類的Sox9蛋白序列長度和大小相似,并均具有Sox9因子其他的重要結(jié)構(gòu)特征,如2段核定位信號序列NLS1和NLS2,及HMG區(qū)域中的特征基序(AQAARRKL)[1-2]。這些基序的高度保守,表明了Sox9蛋白在結(jié)構(gòu)進(jìn)化過程中的保守性,同時也預(yù)示著生理功能在進(jìn)化過程中的保守。
利用鄰位相連算法進(jìn)一步分析泰國斗魚及其他脊椎動物Sox9蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,結(jié)果表明,泰國斗魚與半滑舌鰨的親緣關(guān)系最近,其次是尖吻鱸、斜帶石斑魚、金錢魚和黃鱔等魚類,而與同為鱸形目的羅非魚和海鱸的親緣關(guān)系比其他目的魚類還要遠(yuǎn),從而顯示出Sox9蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化與物種的進(jìn)化地位不相一致。這可能與魚類的基因組結(jié)構(gòu)相關(guān)。魚類基因組在進(jìn)化過程中,經(jīng)歷了3次基因組復(fù)制,導(dǎo)致很多基因發(fā)生了多亞型化,一般會同時存在2種或幾種亞型。已經(jīng)在多種魚類中發(fā)現(xiàn)了Sox9基因存在2種亞型[9-10,12],分別是Sox9a和Sox9b。由于多亞型的存在,可能會導(dǎo)致Sox9蛋白在系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建中聚類發(fā)生改變。后續(xù)需要在更多物種中拓展研究,將Sox9的各個亞型進(jìn)行克隆鑒定,才能進(jìn)一步完善Sox9蛋白分子的系統(tǒng)進(jìn)化樹。
通過RT-PCR的方法檢測了泰國斗魚在雌雄個體中的組織分布情況,結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)泰國斗魚Sox9基因具有顯著的組織表達(dá)特異性和雌雄差異性,預(yù)示了Sox9具有多種生理調(diào)節(jié)功能及雌雄功能的差異。泰國斗魚的組織分布和其他魚類一樣,均具有組織表達(dá)特異性及雌雄差異性[9-10,12]。在雌性泰國斗魚中,Sox9 mRNA在腦中的表達(dá)量均較高,與金錢魚[15]、虹鱒[11]、斜帶石斑[13]和鯰魚的研究相一致,表明Sox9在上游神經(jīng)系統(tǒng)中的重要生理功能。另外,該研究還發(fā)現(xiàn)Sox9基因在精巢中具有高表達(dá),而在卵巢中檢測不到表達(dá)信號,這與胡子鯰[16]和斑馬魚[17]Sox9a基因的表達(dá)情況相一致,從而表明泰國斗魚Sox9在雄性發(fā)育中具有十分重要的作用,并可能和其他物種一樣,起到性別決定的作用。后續(xù)需要開展更多的研究,進(jìn)一步闡明泰國斗魚Sox9基因在性別調(diào)控中的確切功能。
該研究從泰國斗魚中克隆鑒定出Sox9基因的cDNA序列全長,并展開了序列分析及在雌雄個體中的組織分布檢測。序列分析結(jié)果表明,泰國斗魚Sox9具有保守的結(jié)構(gòu)特征,并且在組織分布中顯示出表達(dá)特異性及性別差異性。這為深入探討Sox9基因的分子進(jìn)化及生理功能奠定了研究基礎(chǔ)。
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