丁奇 徐燃?┯嗨?文 楊玉秀 徐建鋼

摘要[目的]探討青枯菌不同接種體誘導(dǎo)后，廣藿香表型的變化，并考察誘導(dǎo)后寄主植物體內(nèi) POD 酶活性的變化。[方法]以青枯菌不同接種體（菌體、粗毒素、菌液）進(jìn)行侵染試驗(yàn)，觀察侵染 1～7 d 后植株表型的變化。利用紫外分光光度法進(jìn)行 POD 酶活性的測定。[結(jié)果]在含菌體的培養(yǎng)基上，大部分廣藿香植株沒有明顯的發(fā)病癥狀；而菌液與粗毒素處理組，植株莖葉逐漸萎蔫。POD 酶活性測定結(jié)果表明，未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照植株酶活性較低，7 d 內(nèi)變化不大；經(jīng)誘導(dǎo)處理的植株體內(nèi) POD 酶活性均升高，菌液組升幅最大，粗毒素組次之，菌體組升幅最小。[結(jié)論]青枯菌胞外分泌物是青枯菌致病的重要因素，誘導(dǎo)的廣藿香體內(nèi) POD 酶活性呈動(dòng)態(tài)變化，上升的幅度與接種體的致病性呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞青枯菌；致病因子；廣藿香；病情指數(shù)；POD

中圖分類號(hào)S435.67文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）08-0138-04

Analysis of Pathogenic Factors of Ralstonia solanacearum to Pogostemon cablin and Related Enzyme Activity of Host Plant

DING Qi1， XU Ran2*，YU Shuangwen2 et al（1.College of Traditional Chinese Medicine， China Pharmaceutical University，Nanjing， Jiangsu 211198；2. School of Biology and Pharmaceutical Engineering， Wuhan Polytechnic University，Wuhan， Hubei 430023）

Abstract[Objective] The research aimed to investigate the phenotype changes of Pogostemon cablin after induction of different inoculums of R. solanacearum， and investigate the changes of POD enzyme activity in host plants after induction.[Method]The changes of plant phenotype were observed after 1-7 days of infection with different inoculum （bacteria， crude toxin， bacteria liquid） of R. solanacearum. The enzyme activity of POD was determinated by UV-Spectrometer.[Result]In the culture medium containing the bacteria， most of the plant of P. cablin had no obvious symptoms； and bacteria liquid and crude toxin treatment group， plant stems and leaves gradually wilted.The results of POD enzyme activity showed that the enzyme activity of the control plants without induction was lower， and there was little change within 7 d.The activity of POD was increased in the inoculated plants， the increase of the bacteria liquid was the highest，the crude toxin group was the second， and the bacteria group had the smallest increase.[Conclusion]The extracellular secretion of R. solanacearum is an important pathogenic factor of R.solanacearum，and the activity of POD enzyme in the wide range of patchouli is dynamic，and the magnitude of the increase is positively correlated with the pathogenicity of the inoculum.

Key wordsRalstonia solanacearum；Pathogenic factors；Pogostemon cablin（Blanco.）Benth.； Disease index；POD

廣藿香[Pogostemon cablin（Blanco）Benth.]為唇形科刺蕊草屬植物，以干燥地上部分入藥，具有芳香化濁、開胃止嘔、發(fā)表解暑的功效[1]。廣藿香原產(chǎn)于菲律賓、馬來西亞、印度等國，后引入我國，在廣東省的肇慶、湛江和海南、廣西等地均有栽培。廣藿香生產(chǎn)中面臨嚴(yán)重的青枯病危害。青枯病是一種細(xì)菌性病害，病原為青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum），簡稱青枯菌，可通過土壤、水傳播，主要從根部進(jìn)入植物的維管束，造成植物輸導(dǎo)系統(tǒng)堵塞，影響水分及營養(yǎng)的吸收，導(dǎo)致植株因水分和營養(yǎng)匱缺而枯萎死亡[2-4]。青枯病的致病機(jī)理及植物對(duì)病原入侵的反應(yīng)，是探討有效控制病害發(fā)生和蔓延的基礎(chǔ)。過氧化物酶（POD）能氧化酚類化合物，促進(jìn)類似木質(zhì)素物質(zhì)的聚合作用，這種聚合物在細(xì)胞中沉積，可抑制病原菌生長與擴(kuò)展[5]；還能將植物體內(nèi)某些有害的代謝副產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害物質(zhì)，或通過調(diào)節(jié)一些次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，以增強(qiáng)植物的抗性[6]。筆者以廣藿香為材料，考察青枯菌不同接種體（菌體、粗毒素、菌液）誘導(dǎo)后植株表型的變化，同時(shí)，研究不同接種體誘導(dǎo)的植物體內(nèi)POD酶活性的變化，探討隨著病程發(fā)展誘導(dǎo)的植株體內(nèi)POD酶活性的動(dòng)態(tài)變化，尋找青枯菌主要的致病因子，揭示青枯菌的致病機(jī)理及寄主植物的抗性生理特點(diǎn)，為廣藿香青枯病的防治提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料。廣藿香植株采自廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥圃，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室潘超美教授鑒定為唇形科廣藿香[Pogostemon cablin （Blanco） Benth.]。采取廣藿香葉片培育試管苗，選擇株高10 cm左右（帶6個(gè)莖節(jié)）的試管苗作為感染材料。

1.1.2青枯菌菌株。青枯菌HX6，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室采用組織分離法從感染了青枯病的廣藿香植株中分離獲得。

1.2方法

1.2.1青枯菌培養(yǎng)。將保存于-80 ℃的供試菌株接種于Nutrient Agar（NA）固體平板培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h，將活化的菌株轉(zhuǎn)到加有150 mL液體 NA 培養(yǎng)基的 250 mL錐形瓶中，在 30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng) 12 h。

1.2.2含不同青枯菌接種體的Murashge and Tucker（MT）培養(yǎng)基的制備。取已培養(yǎng)的含青枯菌的NA液體培養(yǎng)基，于30 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h后，測量細(xì)菌培養(yǎng)液的吸光度A，并將其于4 000 r/min離心30 min，取上清液，過0.22 μm的微孔濾膜，即得粗毒素原液[7]，沉淀即為菌體。將青枯菌菌液、菌體、粗毒素加入MT培養(yǎng)基中，分別使其終濃度為2.0×108 cfu/mL。

1.2.3青枯菌不同接種體對(duì)廣藿香的致病性試驗(yàn)。將廣藿香試管苗傷根處理后接入添加了菌體、菌液、粗毒素的MT培養(yǎng)基中，進(jìn)行致病性試驗(yàn)，以未添加的MT培養(yǎng)基中培養(yǎng)的廣藿香試管苗為空白對(duì)照，于誘導(dǎo)后7 d內(nèi)進(jìn)行發(fā)病調(diào)查。

植株病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)為健康；1級(jí)為1～2葉片萎蔫的植株；2級(jí)為3～5葉片萎蔫的植株；3級(jí)為大部分葉片萎蔫的植株；4級(jí)為整株萎蔫或即將枯死的植株。病情指數(shù)計(jì)算按公式：病情指數(shù)=100×∑各級(jí)發(fā)病植株數(shù)×相應(yīng)級(jí)數(shù)/（調(diào)查總植株數(shù)×最高級(jí)數(shù)）進(jìn)行計(jì)算[8]。

1.2.4酶液提取。分別稱取經(jīng)青枯菌誘導(dǎo)1～7 d 的廣藿香植株及未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照植株葉片0.5 g，加入1.0 mL的0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液 （pH 7.4），冰浴研磨。在4 ℃下，10 000 r/min 離心10 min，取上清液即為酶液，置于-80 ℃冰箱中保存[9]。

1.2.5POD酶活性測定。取酶液100 μL，用愈創(chuàng)木酚和 H2O2 比色法測定，加入3 mL的0.1 mol/L 磷酸緩沖液 （pH 6.5），其中每50 mL緩沖液含有愈創(chuàng)木酚 28 μL、30%過氧化氫19 μL，測吸光密度值△OD470（U/g）[9]。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)“1.2.3”、“1.2.5”試驗(yàn)中，每處理設(shè)3次重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均差±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多處理的多重比較采用LSD方法測驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1青枯菌不同接種體對(duì)廣藿香的致病效應(yīng)取濃度為2.0×108 cfu/mL的青枯菌 HX6 菌液進(jìn)行離心、過濾，獲得菌體和粗毒素，分別將菌體、粗毒素、菌液添加到 MT 培養(yǎng)基中，分別接種廣藿香試管苗進(jìn)行侵染試驗(yàn)，觀察植株表型的變化，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，對(duì)照植株葉片舒展、色澤鮮綠，莖稈直立。菌體誘導(dǎo)的處理，大部分植株始終生長良好，在誘導(dǎo)后期僅少量植株表現(xiàn)輕微的發(fā)病癥狀。粗毒素誘導(dǎo)的處理，第1天時(shí)，植株長勢(shì)良好；第 3天時(shí)，植株下部葉片出現(xiàn)稍微卷縮、泛黃現(xiàn)象；第 5天時(shí)，植株下部葉片失水嚴(yán)重，葉片萎垂，葉色發(fā)黃，莖稈有所彎曲；第 7天時(shí)，植株下部葉子枯黃，葉子下垂脫離嚴(yán)重，莖稈出現(xiàn)褐化，部分植株死亡。菌液誘導(dǎo)的處理，植株的表現(xiàn)與粗毒素處理相似。

從青枯菌侵染的植株 1～7 d 內(nèi)的發(fā)病病情（表1和圖1）可以看出，不同接種體對(duì)廣藿香的致病性有所不同。其中，菌液和粗毒素致病性較強(qiáng)，侵染 4 d 時(shí)，植株病情指數(shù)即達(dá) 60 左右，到第7天病情指數(shù)勻達(dá)到 100，而菌體接種的植株，到侵染第7天，病情指數(shù)低于30。

綜上所述，菌體處理，廣藿香植株發(fā)病情況不明顯；而粗毒素及菌液的處理，植株表現(xiàn)漸進(jìn)的發(fā)病過程，發(fā)病較為嚴(yán)重，且2種接種體的致病效應(yīng)較為一致。說明青枯菌胞外分泌的粗毒素是造成植株發(fā)病死亡的重要原因。

2.2不同青枯菌接種體誘導(dǎo)的廣藿香POD活性變化分別配制含不同接種體（菌液、粗毒素、菌體）的培養(yǎng)基，對(duì)廣藿香進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)，以未經(jīng)誘導(dǎo)的植株為對(duì)照。在侵染的 1～7 d 時(shí)間內(nèi)每天取誘導(dǎo)植株及對(duì)照植株提取酶液，測定POD酶活性，結(jié)果如圖 2。由圖 2 可見，對(duì)照組植株P(guān)OD 酶活性較低，且在7 d內(nèi)變化不大，酶活性值均值為3.26 U/g。青枯菌誘導(dǎo)處理后比對(duì)照的 POD 酶活性升高明顯，其中以菌液誘導(dǎo)組升高變化最為顯著，菌液誘導(dǎo)的第1天POD酶活性就開始明顯的上升，第3天達(dá)到峰值（10.08 U/g），隨后轉(zhuǎn)為下降趨勢(shì)，第 6天與對(duì)照酶活性水平持平，第 7天低于對(duì)照組。粗毒素誘導(dǎo)的廣藿香組 1～2 d 與對(duì)照組比較未見明顯差別，在第 3天有所上升，第 4天酶活性達(dá)到峰值（7.25 U/g），第 5天開始下降，第 6天有小幅回升之后，第 7天下降至與對(duì)照組接近。菌體誘導(dǎo)的廣藿香酶活性變化較前 2 組相比更為平緩，總體呈現(xiàn)先緩慢上升，第 4天達(dá)到極值（4.68 U/g），再小幅下降，并一直平穩(wěn)維持稍高于對(duì)照組到第 7天。比較 3 組誘導(dǎo)組的酶活曲線發(fā)現(xiàn)，菌液組的酶活性變化幅度最大，呈現(xiàn)先顯著上升，后逐步下降至明顯低于對(duì)照組；粗毒素組的酶活性增長較為緩慢，在第 4天時(shí)到達(dá)峰值，然后急劇下降；菌體組的酶活性上限值低于前2個(gè)處理，在第 4天達(dá)到峰值后呈穩(wěn)定的遞減趨勢(shì)。其中，粗毒素和菌液誘導(dǎo)處理的植株酶活性均在第 6天或第 7天時(shí)低于對(duì)照組。

3討論與小結(jié)

有關(guān)青枯菌致病的機(jī)理，有研究報(bào)道，采用胞外多糖（EPS）缺陷型突變菌系與正常產(chǎn)生EPS的野生型菌系對(duì)野油菜黃單胞菌致病性比較發(fā)現(xiàn)，即使將大量細(xì)菌注射入植物莖干，前者極少引起植物的萎蔫和死亡[10]。王軍等[11]研究桉樹青枯菌菌株致病性分化與其菌量增殖及胞外多糖產(chǎn)量的聯(lián)系發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)致病性菌株EPS的總產(chǎn)量及單個(gè)細(xì)胞EPS產(chǎn)量均高于弱致病性菌株，表明青枯菌的致病力與胞外多糖有關(guān)系。該研究結(jié)果表明，廣藿香被青枯菌不同接種體誘導(dǎo)后，在表型變化上，菌體對(duì)廣藿香的致病力很弱，而含有胞外分泌物的粗毒素和菌液感染廣藿香后，植株發(fā)病嚴(yán)重，第7天后，大多數(shù)植株萎蔫或死亡，表明青枯菌胞外分泌物是重要的致病因子。

植物在生物逆境中不斷受到病原微生物侵襲，在長期的相互作用、相互選擇、相互適應(yīng)乃至協(xié)同進(jìn)化的過程中，逐漸獲得了一系列復(fù)雜的防御機(jī)制來保護(hù)自己，使得植物的抗病性與病原物致病性之間達(dá)到動(dòng)態(tài)的平衡，以此來減輕病害的危害程度。近些年來，植病學(xué)者已經(jīng)開始注意到植物抗病的本質(zhì)問題，認(rèn)識(shí)到植物的保護(hù)反應(yīng)是復(fù)雜的新陳代謝過程，對(duì)病原物侵入及擴(kuò)展的生理反應(yīng)是以酶的催化活動(dòng)而實(shí)現(xiàn)的。植物經(jīng)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)處理后體內(nèi)的防御酶系活性會(huì)提高[12]，它們是植物抵抗病原菌侵染的最有效機(jī)制之一[13-14]。利用植物的誘導(dǎo)抗病性，以提高抵抗病害的能力，是植物病害防治的一種新思路。已有大量研究表明，POD是植物次生代謝過程的關(guān)鍵酶之一，與植物的抗性緊密相關(guān)；POD不但具有抑制病原物水解酶的作用，而且還能抑制病原物的生長和繁殖，是植物的重要保護(hù)酶之一[15]。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年

該研究探討了不同青枯菌接種體（菌液、粗毒素、菌體）誘導(dǎo)的廣藿香POD酶活性的變化，結(jié)果表明，未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照植株的POD防御酶活性處于較低的水平且比較平穩(wěn)；不同青枯菌接種體誘導(dǎo)處理的植株7 d 內(nèi)POD酶活性明顯高于對(duì)照，菌液、粗毒素誘導(dǎo)組POD酶活性峰值均顯著高于菌體誘導(dǎo)組。在不同致病體致病性試驗(yàn)中，通過對(duì)植物病程表型的觀察，證明菌液、粗毒素的致病性高于菌體，說明青枯菌的致病性越強(qiáng)、廣藿香植株相關(guān)酶活性越高，表現(xiàn)為菌液、粗毒素誘導(dǎo)組廣藿香植株的POD酶活性增加的速度快，而且達(dá)到峰值也更高。如何利用廣藿香本身的防衛(wèi)體系，借助于誘導(dǎo)因子激發(fā)植物整體抗性水平，以提高抵抗病害的能力，是需要進(jìn)一步研究的問題。

參考文獻(xiàn)

[1]

國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：30.

[2] 喬俊卿，陳志誼，劉郵洲，等.茄科作物青枯病研究進(jìn)展[J].植物病理學(xué)報(bào)，2013，43（1）：1-10.

[3] 黎妍妍，劉海龍，鄭露，等.我國植物青枯菌遺傳多樣性研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（14）：107-110.

[4] 尹維，廖曉蘭.植物源活性物防治作物細(xì)菌性青枯病研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2013，33（4）：84-87.

[5] 蔣選利，李振岐，康振生.過氧化物酶與植物抗病性研究進(jìn)展[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，29（6）：124-129.

[6] 高旭輝.論茶樹抗病性的生化基礎(chǔ)[J].茶葉通訊，1998（1）：27-29.

[7]方樹民，陳劍芳，顧鋼，等.煙草品種抗青枯病鑒定中相關(guān)因素分析[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2001，28（2）：123-128.

[8] 田麗波，張燕，商桑，等.基于生理生化性狀和病情指數(shù)評(píng)價(jià)苦瓜種質(zhì)資源的白粉病抗性[J].分子植物育種，2015，13（12）：2824-2832.

[9] MOERSCHBACHER B M，NOLL U M，F(xiàn)LOTT B E，et al.Lignin biosynthetic enzymes in stem rust infected，resistant and susceptible near-isogenic wheat lines[J].Physiol Mol Plant Pathol，1988，33（1）：33-46.

[10] KAO C C，BARLOW E，SEQUEIRA L.Extracellular polysaccharide is required for wildtype virulence of Pseudomonas solanacearum[J].Journal of bacteriology，1992，174（3）：1068-1071.

[11] 王軍，趙曉輝，孫思.桉樹青枯菌菌株致病性分化與其菌量增殖及胞外多糖產(chǎn)量的聯(lián)系[J].中國森林病蟲， 2008，27（3）：4-6.

[12] 朱圣杰，趙亞蘭，王學(xué)東.青枯菌胞外酶活性與致病性之間的關(guān)系初探[J].河套大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，5（4）：13-15.

[13] FARKAS G L，STAHMANN M A.On the nature of change in peroxidase isoenzymes in bean leaves infected by southern bean mosaic virus [J].Phytopathology，1996，56（6）：669-677.

[14] 王彩霞，陳曉林，李保華.腐爛病菌侵染對(duì)蘋果愈傷組織防御酶活性及丙二醛含量的影響[J].植物生理學(xué)報(bào)，2014，50（7）：909-916.

[15] 王金生.分子植物病理學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999.