趙溪竹 林興軍 白亭玉 王麗萍 賴劍雄 趙青云

摘 要 可可是世界最重要的多年生經(jīng)濟(jì)作物之一，為了揭示不同園齡可可園土壤演變規(guī)律，為其可持續(xù)生產(chǎn)提供依據(jù)。以休耕地為對(duì)照（CK），研究低齡（4 a）、中齡（12 a）和老齡（32 a）3種不同園齡土壤培育可可苗期生長(zhǎng)及其與根際土壤有機(jī)碳（SOC）含量、土壤酶活性和微生物區(qū)系等關(guān)系。結(jié)果表明，32 a園齡土壤培育可可苗生物量顯著高于4 a、12 a和CK，分別增加了89.15%、29.24%和28.03%；32 a和12 a園齡處理根際SOC含量顯著高于4 a園齡，老齡園有利于SOC的積累；隨著園齡增加，脲酶活性增加，且與SOC含量極顯著正相關(guān)，12 a和32 a園齡土壤脲酶活性分別比CK顯著增加了44.36%和43.11%；12 a園齡處理根際土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量減少，真菌數(shù)量則顯著增加，12 a土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量分別是4 a、32 a和CK的3.04、1.46和3.23倍，園齡可能導(dǎo)致土壤微生物區(qū)系變化。綜上所述，隨著土壤園齡增加，可可苗生物量、根際SOC含量和脲酶活性均增加，根際土壤微生物區(qū)系發(fā)生變化，根際土壤真菌數(shù)量與SOC含量、脲酶活性極顯著正相關(guān)，可可根際SOC含量是光合作用、植株生長(zhǎng)、土壤酶活性和土壤微生物共同作用的結(jié)果。

關(guān)鍵詞 園齡；根際；土壤微生物；土壤酶活性；可可

中圖分類號(hào) S571.3；S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Effect of Planting Age on Theobroma cacao Seedling Biomass

and Rhizosphere Soil Environment

ZHAO Xizhu， LIN Xingjun， BAI Tingyu， WANG Liping， LAI Jianxiong， ZHAO Qingyun*

Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Genetic

Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract Cocoa is one of the most important perennial cash crops worldwide. Our aim was to analyze the development laws of soil quality， provide the basis for promoting sustainable production. Comparing seedling biomass， soil organic carbon（SOC）content， enzyme activities， rhizosphere microorganism population quantifies and their relationships of 4 years， 12 years and 32 years soil of cocoa plantations. Short fallow was used as treeless references（CK）. The main results obtained were as follows： The seedling biomass were significantly increased by 89.15%， 29.24% and 28.03% in soil of 32 years compared with that of 4 years， 12 years and CK， respectively. The SOC content was significantly increased in soil of 32 years and 12 years compared with that of 4 years， and aging was conductive to the accumulation of SOC. As the planting age increased， soil urease activities increased， which was extremely significantly positive correlation with the SOC content. Soil urease activities of 12 and 32 years obviously increased by 44.36% and 43.11%， respectively compared with that of CK. The culturable bacteria in rhizosphere soil decreased， and the culturable fungi significant increased. The culturable fungi number in 12 years soil were 3.04， 1.46 and 3.23 times higher compared with that in 4 years， 32 years and CK， respectively. Planting age may lead to changes of soil microflora. In conclusion， with the increase of planting age， the seedling biomass， rhizosphere SOC content and soil urease activities were increased， and the soil microflora changed. The culturable fungi in rhizosphere soil was significantly positively related to SOC content and urease activities. The SOC content in rhizosphere soil was the result of photosynthesis， seedlings growth， enzyme activities and microorganism.

Key words planting age； rhizosphere； soil microbes； soil enzyme activity； Theobroma cacao

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.009

可可（Theobroma cacao L.）是世界三大飲料作物之一，梧桐科多年生常綠小喬木，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是制作巧克力的主要原料，也是飲料、糖果的重要配料[1]。可可是典型的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，廣泛種植于世界70多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，據(jù)國(guó)際可可組織（ICCO）統(tǒng)計(jì)，2014/2015年度世界可可總產(chǎn)量約420萬(wàn)t[2-3]，預(yù)計(jì)到2020～2025年，可可產(chǎn)量再增加100萬(wàn)t才能滿足消費(fèi)者的需求[4]?？煽稍谖覈?guó)海南、云南、臺(tái)灣等地有規(guī)?；N植[5]。隨著人們生活水平的提高，對(duì)可可原料的需求量也不斷增長(zhǎng)[6]。由于對(duì)施肥等養(yǎng)分管理缺乏認(rèn)知或?yàn)榱藴p少投入，許多非洲可可主產(chǎn)國(guó)的農(nóng)戶對(duì)可可園管理粗放，甚至不施肥[7]，導(dǎo)致種植20～30年甚至更短的時(shí)間，可可園出現(xiàn)土壤礦質(zhì)養(yǎng)分失衡，土壤退化，樹體衰老，易受病蟲危害[8]。也有的研究表明，隨著種植年限的增加，農(nóng)林復(fù)合的可可園土壤有機(jī)碳（SOC）、P、Ca、Mg等養(yǎng)分含量顯著提高，30齡可可園SOC儲(chǔ)量可達(dá)到森林碳儲(chǔ)量的85%[9]。目前，關(guān)于可可種植方面的研究偏重于拉丁美洲、非洲和亞洲的印度尼西亞等國(guó)家和地區(qū)[10]，由于氣候、土壤和種植技術(shù)等因素限制，所得結(jié)論并不能簡(jiǎn)單地應(yīng)用到我國(guó)可可園。另一方面，可可在我國(guó)仍是新興熱帶經(jīng)濟(jì)作物，因地制宜地研究不同園齡可可根際土壤演變規(guī)律，不僅是關(guān)于我國(guó)可可生態(tài)系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)工作，而且對(duì)其它多年生熱帶經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。

近年來(lái)，在多年生熱帶經(jīng)濟(jì)作物土壤質(zhì)量方面的研究已有很多報(bào)道。趙青云等[11]對(duì)不同年限香草蘭生理狀況及根際土壤微生物區(qū)系研究表明，種植10 a以上的香草蘭植株生長(zhǎng)代謝緩慢，土壤微生物由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)變，微生物區(qū)系失衡。Li等[12]研究表明，長(zhǎng)期連續(xù)單作使胡椒根際土壤微生物區(qū)系組成發(fā)生變化，從而抑制胡椒生長(zhǎng)。Liu等[13]研究了不同林齡人工橘林土壤微生物活性特征，認(rèn)為土壤pH值的降低影響土壤微生物區(qū)系、微生物活性、微生物生物量碳、氮和養(yǎng)分含量，進(jìn)而影響土壤功能的正常發(fā)揮。目前，關(guān)于不同園齡可可根際土壤質(zhì)量變化的研究還不足，缺乏優(yōu)化田間管理技術(shù)的可靠依據(jù)。SOC含量是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[14]，熱帶地區(qū)農(nóng)業(yè)SOC的水平較低[15]，因此，熱帶農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的SOC管理對(duì)生產(chǎn)可持續(xù)性具有重要意義。土壤酶是生態(tài)系統(tǒng)的生物催化劑，在土壤物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著重要作用[16]，反映了土壤中各種生物化學(xué)過(guò)程的強(qiáng)度和方向，可以作為評(píng)價(jià)土壤肥力狀況的指標(biāo)，也是反映土壤質(zhì)量的生物活性指標(biāo)[17]。微生物是影響陸地土壤碳積累和損失的主要影響因素，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外酶的作用使SOC分解[18]。土壤酶和土壤微生物共同推動(dòng)土壤的代謝過(guò)程[19]，土壤微生物也受土壤有機(jī)質(zhì)的影響[20]。確定土壤微生物群落的變化，有利于全面了解土壤微生物與SOC間的關(guān)系[21]。

本研究采用時(shí)空替代法比較研究園齡對(duì)可可苗生長(zhǎng)及其根際土壤環(huán)境的影響，揭示不同園齡可可園土壤演變規(guī)律，以期為進(jìn)一步對(duì)可可園SOC開展相關(guān)研究，探討促進(jìn)可可生長(zhǎng)的有效途徑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為促進(jìn)可可生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2015年8月～2016年7月，在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所溫室進(jìn)行（北緯18°45′，東經(jīng)110°13′），該地位于海南省萬(wàn)寧市興隆華僑農(nóng)場(chǎng)。供試土壤取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所的不同園齡可可試驗(yàn)基地（0～20 cm），沙壤土，過(guò)10 mm篩，裝入直徑20 cm、高25 cm的育苗袋中，每袋裝土4 kg，備用。

采集同一品種可可母樹（熱引4號(hào)）成熟果實(shí)的種子，經(jīng)10% NaOH溶液表面消毒10 min，無(wú)菌水沖洗后播種在沙床，培育15 d后，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的未完全張開子葉幼苗，移栽至育苗袋中。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以不同園齡的可可園土壤為處理：低齡（4 a），中齡（12 a），老齡（32 a），以4 a可可園周邊休耕地土壤為對(duì)照（CK），每處理20盆，共80盆。試驗(yàn)前測(cè)定各處理土壤養(yǎng)分含量（表1），試驗(yàn)期內(nèi)不施肥，保持土壤濕度在60%左右。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)及方法 （1）植株生理指標(biāo)測(cè)定：收獲前，在晴天08 ： 00～10 ： 00時(shí)進(jìn)行，選取可可苗第4片完全展開葉，用Li-6400XT便攜式光合作用測(cè)量系統(tǒng)（Li-COR，美國(guó)），設(shè)定系列光通量密度（photosynthetic photo flux density，PPFD）梯度：0、50、100、200、400、600、800 μmol CO2/（m2·s），用6400-02B LED紅藍(lán)光源葉室測(cè)定其凈光合速率[Pn，μmol CO2/（m2·s）]，每個(gè)PPFD記錄3個(gè)以上數(shù)據(jù)，每個(gè)處理4次重復(fù)，采用劉宇鋒等[22]的方法擬合出最大光合速率（Amax）[μmol CO2/（m2·s）]。

（2）土壤酶活性測(cè)定：在生物量處理前采用抖土法收集新鮮根際土壤，采用四分法取適量土壤樣品，分成2份，1份用于土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量測(cè)定，將樣品裝入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?份風(fēng)干后剔除根系等雜物，過(guò)0.425 mm篩，采用試劑盒法測(cè)定土壤多酚氧化酶（以每天1 g土壤中產(chǎn)生1 mg紫色沒(méi)食子素表示，U/g）、脲酶（以每天1 g土壤中產(chǎn)生1 μg NH3-N表示，U/g）、酸性磷酸酶（以37 ℃中1 g土壤每天釋放1 μmol酚表示，U/g）、蔗糖酶活性（以每天1 g土壤中產(chǎn)生1 mg還原糖表示，U/g），試劑盒購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，4次重復(fù)。

（3）土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量測(cè)定采用常規(guī)方法[23]。SOC含量采用TOC分析儀（Multi N/C 3100，Analytikjena，德國(guó)）HT1300 模塊測(cè)定[24]。植株生物量測(cè)定用水充分浸濕根系附著土壤后，用自來(lái)水清洗，70 ℃烘至恒重，稱量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0（SPSS Inc.， 美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Microsoft Excel 2010繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 園齡對(duì)可可苗生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，隨著園齡增加，可可苗干重呈增加趨勢(shì)。32 a園齡土壤培育可可苗干重顯著高于其它處理，分別比4 a、12 a和CK增加了89.15%、29.24%和28.03%。12 a和4 a園齡土壤培育可可苗干重差異高于CK，分別增加了47.73%和46.36%。不同園齡可可土壤培育的可可Amax表明（圖2），12 a的Amax[3.37 μmol CO2/（m2·s）]最高，4 a[3.25 μmol CO2/（m2·s）]>32 a[3.10 μmol CO2/（m2·s）]>CK[2.47 μmol CO2/（m2·s）]，各處理間差異不顯著，相關(guān)性分析表明，生物量與Amax間的相關(guān)系數(shù)為0.45。

2.2 園齡對(duì)SOC含量的影響

由試驗(yàn)前SOC含量可見（表1），隨著園齡增加，各處理SOC含量呈增加趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)不同園齡土壤培育1 a后，各處理SOC 含量的變化趨勢(shì)與Amax相似，可可根際SOC含量均顯著高于CK（7.66 g/kg），以12 a（16.25 g/kg）園齡最高，分別比4 a（12.94 g/kg）和CK增加了25.60%和112.17%，32 a（15.46 g/kg）分別比4 a和CK增加了19.46%和101.80%（圖3）。與試驗(yàn)前相比，除CK降低外，不同園齡處理SOC含量提高了8.49%～40.65%，且隨著園齡增加，提高的比率呈降低趨勢(shì)。相關(guān)性分析表明，SOC含量與Amax間的相關(guān)系數(shù)為0.83，可見，SOC含量與光合作用間具有較強(qiáng)的相關(guān)性。

2.3 園齡對(duì)土壤酶活性的影響

由表2可見，不同園齡土壤培育可可根際土壤多酚氧化酶和酸性磷酸酶活性均無(wú)顯著差異。各處理多酚氧化酶活性均低于CK，4 a、12 a和32 a園齡分別比CK降低了18.34%、69.24%和51.99%。4 a和12 a 園齡土壤酸性磷酸酶活性分別比CK增加了23.65%和29.08%，32 a園齡最低（10.70 U/g）。12 a和32 a園齡土壤脲酶活性顯著高于CK，分別比CK增加了44.36%和43.11%，4 a比CK增加了9.94%，但差異不顯著（p>0.05），12 a和32 a園齡間土壤脲酶活性也不顯著（p>0.05）。12 a園齡土壤蔗糖酶活性顯著低于CK、4 a和32 a園齡，分別降低了74.15%、73.45%和68.47%，4 a蔗糖酶活性高于32 a，但差異不顯著（p>0.05）。由此可見，隨著園齡增加，可可根際土壤脲酶活性提高，多酚氧化酶和蔗糖酶活性先降低后升高。

2.4 園齡對(duì)根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響

如圖4-A所示，不同園齡土壤培育可可根際土壤細(xì)菌數(shù)量均低于CK，4 a高于12 a和32 a園齡，但各園齡根際土壤細(xì)菌數(shù)量差異不顯著（p>0.05）。不同園齡土壤培育可可根際土壤放線菌數(shù)量均高于12 a（圖4-B），但僅32 a與12 a間差異顯著，增加了21.66%，32 a和4 a分別比CK 增加了18.44%和5.07%，32 a比4 a增加了2.72%，但差異均不顯著（p>0.05）。12 a園齡土壤培育可可根際土壤真菌數(shù)量較高（圖4-C），分別是4 a、32 a和CK的3.04、1.46和3.23倍，12 a和32 a間差異不顯著（p>0.05），但顯著高于4 a和CK。

2.5 不同園齡土壤相關(guān)性分析

表3數(shù)據(jù)分析表明，植株干重與根際土壤放線菌數(shù)量、脲酶活性、SOC含量顯著正相關(guān)。真菌數(shù)量與細(xì)菌數(shù)量顯著負(fù)相關(guān)，與多酚氧化酶活性、蔗糖酶活性極顯著負(fù)相關(guān)，而與脲酶活性、SOC含量極顯著正相關(guān)。脲酶活性與細(xì)菌數(shù)量極顯著負(fù)相關(guān)，與多酚氧化酶活性顯著負(fù)相關(guān)。蔗糖酶活性與真菌數(shù)量極顯著負(fù)相關(guān)，與酸性磷酸酶活性顯著負(fù)相關(guān)，與多酚氧化酶活性極顯著正相關(guān)。SOC含量與細(xì)菌數(shù)量、多酚氧化酶活性極顯著負(fù)相關(guān)，與真菌數(shù)量、脲酶活性顯著正相關(guān)，與蔗糖酶活性顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論

SOC是陸地生態(tài)系統(tǒng)碳庫(kù)的最大組成部分，在全球CO2變化中發(fā)揮著重要的平衡作用[25]。本研究中，32 a和12 a園齡處理根際SOC含量顯著高于4 a園齡，說(shuō)明老齡園有利于SOC的積累。王義祥等[26]對(duì)不同種植年限柑橘果園SOC含量（0～20 cm土層）進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，隨著種植年限增加，果園SOC含量提高了27.2%；Tang等[27]發(fā)現(xiàn)，中國(guó)亞熱帶幼齡森林有機(jī)碳積累主要體現(xiàn)在植物生物量的增加，而成熟森林有機(jī)碳主要積累于土壤中，這些研究結(jié)果均和本研究結(jié)果一致。本研究相關(guān)分析表明，不同園齡可可苗生物量與根際SOC含量極顯著正相關(guān)，而SOC含量與Amax間具有較強(qiáng)的相關(guān)性，可能是由于土壤微生物將部分光合碳轉(zhuǎn)化為SOC[28-29]。本研究中培育1 a后，CK處理根際SOC含量比試驗(yàn)前降低，可能由于光合速率較低，土壤微生物獲得可轉(zhuǎn)化的碳少，此外幼苗生長(zhǎng)也會(huì)消耗養(yǎng)分，因此，筆者認(rèn)為，可可根際SOC含量是光合作用、植株生長(zhǎng)和土壤微生物共同作用的結(jié)果。與本研究結(jié)果相似的，王春燕等[30]對(duì)不同種植年限橡膠園SOC含量研究的結(jié)果表明，12 a比4 a和19 a膠園SOC含量高即是凋落物分解、樹木生長(zhǎng)消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和施肥等綜合作用的結(jié)果。

土壤酶活性是評(píng)價(jià)土壤肥力的重要指標(biāo)之一[31]。本研究中隨著園齡增加，脲酶活性增加，且與SOC含量極顯著正相關(guān)。李勇[32]研究表明，脲酶活性與SOC呈極顯著相關(guān)（p<0.01）或顯著相關(guān)（p<0.05），這與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，12 a園齡土壤蔗糖酶活性顯著低于32 a園齡，且與SOC含量顯著負(fù)相關(guān)。有研究表明，土壤蔗糖酶與SOC含量間的關(guān)系因施肥種類及種植方式不同而異[33]，土壤有機(jī)質(zhì)含量增加，蔗糖酶活性提高[34]，這與本研究結(jié)果相反，可能是由于蔗糖酶與SOC的轉(zhuǎn)化相關(guān)，其活性大小可間接表征SOC的轉(zhuǎn)化情況[34-35]，12 a園齡處理土壤轉(zhuǎn)化的SOC含量少，也導(dǎo)致了植株生物量顯著低于32 a處理。

土壤微生物是植物養(yǎng)分供給的驅(qū)動(dòng)力[36]，其群落結(jié)構(gòu)和組成受到土壤有機(jī)質(zhì)等因素影響[20]。土壤微生物群落功能和多樣性的改變也可影響土壤質(zhì)量和生態(tài)系統(tǒng)過(guò)程[37]。Snoeck等[7]調(diào)查了位于喀麥隆的60個(gè)可可種植園土壤中叢枝菌根真菌的孢子密度，發(fā)現(xiàn)低齡土壤的孢子密度顯著低于老齡可可園。本研究結(jié)果顯示，12 a園齡土壤培育可可根際土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量減少，真菌數(shù)量則顯著增加，分別是4 a和CK的3.04和3.23倍，說(shuō)明隨著園齡增加，可能導(dǎo)致土壤微生物區(qū)系變化，這與趙青云等[11]的研究結(jié)果一致。本研究中，不同園齡土壤培育可可根際土壤中可培養(yǎng)真菌數(shù)量與脲酶活性、SOC含量極顯著正相關(guān)，可能的原因是隨著園齡增加，SOC含量的提高為真菌生長(zhǎng)提供更多易利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)了某些土壤微生物數(shù)量的增加[34]。土壤微生物細(xì)胞的增殖和裂解釋放出脲酶，增加了土壤中脲酶活性[38]。

本試驗(yàn)探討了不同園齡對(duì)可可根際土壤環(huán)境的影響，結(jié)果表明，32 a和12 a園齡處理根際SOC含量顯著高于4 a園齡，老齡園有利于SOC的積累。不同園齡可可苗生物量與根際SOC含量極顯著正相關(guān)。隨著園齡增加，脲酶活性增加，且與SOC含量極顯著正相關(guān)，土壤蔗糖酶活性與SOC含量顯著負(fù)相關(guān)。12 a園齡土壤培育可可根際土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量減少，真菌數(shù)量則顯著增加，隨著園齡增加，可能導(dǎo)致土壤微生物區(qū)系變化?？煽筛HSOC含量是光合作用、植株生長(zhǎng)、土壤酶活性和土壤微生物共同作用的結(jié)果?？煽蓤@SOC是其土壤肥力和土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，了解可可園SOC的變化規(guī)律，以期為土壤管理和經(jīng)營(yíng)措施的制定提供科學(xué)依據(jù)，也為可可生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)提供理論依據(jù)。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展為研究生態(tài)系統(tǒng)微生物區(qū)系及多樣性提供了更有效的方法[39-40]。我國(guó)熱區(qū)土壤微生物資源豐富，但土壤微生物群落特征如豐富度和多樣性等仍有待深入研究，筆者擬采用 454高通量測(cè)序技術(shù)探索土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，以期進(jìn)一步揭示可可園土壤演變規(guī)律，為促進(jìn)可可生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

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