祁宏英 徐洪國 顧靈杰

摘 要 以毛酸漿的根尖為實(shí)驗(yàn)材料，對幾種預(yù)處理方法、解離方法、染色體制片方法進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明：毛酸漿根尖用0.1%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羥基喹啉1 ∶ 1混合液4 ℃條件下處理3 h，固定后先用1 mol/L HCl在60 ℃條件下解離3 min，再用混合酶液進(jìn)行酶解，染色制片后得到的染色體圖像效果比較清晰。供試的2個(gè)品種染色體數(shù)目均為2n=24，屬于小型染色體，但它們的核型具有明顯差異，‘鐵把小菇娘：染色體總長為30.72 μm，絕對長度范圍1.61～3.42 μm，核型公式2n=2sm+22m，屬于1B核型，核型不對稱系數(shù)為56.35%；‘粒粒甜菇娘：染色體總長28.42 μm，絕對長度范圍1.52～3.32 μm，核型公式2n=2sm+2M+20m，屬于2B核型，核型不對稱系數(shù)為54.93%。

關(guān)鍵詞 毛酸漿；染色體；核型分析

中圖分類號 S641.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Karyotype Analysis of Two Cultivars Physali pubescens L.

QI Hongying， XU Hongguo， GU Lingjie

College of Life Science and Agriculture Forestry， Qiqihaer University， Qiqihaer， Heilongjiang 161006， China

Abstract In this paper， the experimental materials were the root tips of two cultivars from Physalis pubescens L. The methods of pretreatment， dissociation and chromosome sectioning technique were studied for the karyotype analysis. The root tips of P. pubescens L. were pretreated with 0.1% colchicines and 0.002 mol/L 8-hydroxyquinoline（1 ∶ 1）for 3 h at 4 ℃. The root tips were dissociated in 1 N HCl at 60 ℃ for 3 min， and then the root tips were enzymatic hydrolyzed with mixed enzymes. The results showed the images of the chromosome were clear. The chromosome number of the two cultivars were both 2n=24， and which were both small chromosome. However， the karyotypes were different. P. pubescens‘Tieba：The chromosome length was 30.72 μm， and the variation range of the chromosome length was 1.61～3.42 μm. The karyotype formula was 2n=2sm+22m， which belongs to“1B”type， as the karyotype asymmetry index was 56.35%. P. pubescens‘Lilitian：The chromosome length was 28.42 μm， and the variation range of the chromosome length was 1.52～3.32 μm. The karyotype formula was 2n=2sm+2M+20m， which belongs to“2B”type， as the karyotype asymmetry index was 54.93%.

Key words Physali pubescens L.； chromosome preparation； karyotype analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.002

毛酸漿（Physalis pubescens L.）屬茄科酸漿屬，又名黃菇娘、洋菇娘等，營養(yǎng)價(jià)值高[1]，味道甜美，清香可口，果實(shí)內(nèi)含有多種維生素、多種礦物質(zhì)和氨基酸[2]，是老少皆宜的水果，具有多種藥用成分[3]，適合大眾消費(fèi)[4]。目前，對于毛酸漿的研究主要集中在組織培養(yǎng)[2]、化學(xué)成分研究[3，5]、栽培技術(shù)[4，6]等方面，酸漿屬部分植物核型分析方面也有報(bào)道，許亮等[7]以掛金燈（P. alkekengi var. franchetii）為植物材料，采用常規(guī)的制片方法進(jìn)行核型分析，核型屬于“1A”型。許亮等[8]以毛酸漿（P. pubescens L.）為植物材料進(jìn)行染色體的核型分析，結(jié)果是染色體數(shù)目與酸漿屬其他植物相同，核型公式為K（2n）=2m+20sm+2st，屬于“3A”型。沙成卓等[9]以掛金燈（P. alkekengi var. franchetii）、通肯酸漿（P. ixocarpa）及毛酸漿（P. pubescens L.）3種酸漿屬的植物為材料，得到3種酸漿屬植物的體細(xì)胞染色體數(shù)目相同2n=24，但染色體核型卻有明顯不同的表型，掛金燈和通肯酸漿的核型較為相似，屬于“2A”型，但是毛酸漿的核型與兩者差異較大，屬于“3A”型。

茄科植物的染色體較小[10-11]，進(jìn)行染色體制片時(shí)，染色體容易出現(xiàn)重疊，影響染色體的計(jì)數(shù)和核型分析，要想獲得分散良好且清晰的中期分裂相，對制片技術(shù)要求較高，且不同的栽培品種間在遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)組成上有很大的差異[12]。本實(shí)驗(yàn)對毛酸漿2個(gè)栽培品種染色體制片優(yōu)化及核型分析，擬從細(xì)胞水平上為毛酸漿品種的遺傳變異和新品種的選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為栽培品種‘鐵把小菇娘（P. pubescens‘Tieba）和‘粒粒甜菇娘（P. pubescens‘Lilitian），由哈爾濱金龍農(nóng)業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 預(yù)處理

將毛酸漿種子置于上下各墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，放入溫箱30～35 ℃發(fā)芽，注意保持培養(yǎng)皿內(nèi)濕潤，待根尖長至1 cm左右時(shí)，在上午10 ： 00左右剪取根尖后進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理試劑是0.1%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羥基喹啉，方法見表1。

1.3 固定

將預(yù)處理后的根尖用蒸餾水沖洗數(shù)次，用卡諾固定液25～30 ℃固定8 h后，沖洗干凈，70%乙醇中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 解離

單用酸解：60 ℃恒溫條件用1 mol/L HCl解離3 min。

單用酶解：將固定后的根尖放入0.075 mol/L KCl中低滲30 min后，放入2.5%纖維素酶和2%果膠酶的混合酶解液中，25～30 ℃下解離1.5 h，用蒸餾水沖洗數(shù)次后，放入0.075 mol/L KCl中后低滲8 min左右。

先酸解后酶解：先在60 ℃恒溫條件用1 mol/L HCl解離3 min，沖洗數(shù)次后，放入纖維素酶和果膠酶的混合酶液中室溫解離1.5 h，沖洗數(shù)次后放入0.075 mol/L KCl中進(jìn)行后低滲[13]。

1.5 染色壓片及圖像采集

取根尖前端1 mm分生區(qū)，放在干凈的載玻片上，使用卡寶品紅染液染色10～15 min。輕輕蓋上蓋玻片，用手指輕輕按壓后，再用橡皮筆頭輕敲細(xì)胞區(qū)域，使細(xì)胞充分分散，用濾紙吸除多余的染液[14]。用NIKON ECLIPSE 50顯微鏡觀察制片，在10×的物鏡下找到分散良好且清晰的中期分裂相，之后在100×油鏡下用Motic Images Advanced 3.2圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。染色體數(shù)目確定及核型分析方法按李懋學(xué)等[15]提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 對毛酸漿根尖不同預(yù)處理的結(jié)果

從毛酸漿根尖材料預(yù)處理（圖1）結(jié)果，可以看出A1、A2和B1、B2 0.1%秋水仙素處理的根尖處理3 h和4 h，染色體都不夠分散，有重疊的片段，空白對照如A5、B5顯示所有染色體聚縮成團(tuán)。但是從A3、B3來，0.1%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羥基喹啉混合液4 ℃處理3 h的整體效果較好，染色體分散且清晰，縊痕較容易分辨，整體效果優(yōu)于15 ℃處理A4、B4。同一處理方法處理的毛酸漿，雖然品種不同，但是處理效果基本一致。

2.2 毛酸漿根尖不同解離液的解離結(jié)果

毛酸漿不同解離方法的解離結(jié)果如圖2，單用酸解（圖2-a）和單用酶解（圖2-b）的效果相似，細(xì)胞不易分散，重疊，不易觀察；而先用1 mol/L HCl 60 ℃恒溫6 min，再用混合酶液酶解1 h左右，解離效果（圖2-c）優(yōu)于單用酸解和單用酶解的，細(xì)胞分散性良好，易于觀察染色體的形態(tài)和計(jì)數(shù)。

2.3 ‘鐵把小菇娘的核型分析

通過對染色體制片進(jìn)行觀察，選取30～50個(gè)染色體分散良好且形態(tài)清晰的細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中植物材料的染色體基數(shù)均為x=12，‘鐵把小菇娘和‘粒粒甜菇娘均為二倍體，即染色體數(shù)目為2n=24。

選取染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰的中期分裂相進(jìn)行核型分析，得表2的核型參數(shù)和圖3的核型圖與模式圖?！F把小菇娘的染色體總長為30.72 μm，絕對長度范圍1.61～3.42 μm，屬于小型染色體；1號染色體為近中部著絲粒染色體，其余為中部著絲粒染色體，核型公式為K（2n）=24=2sm+22m；染色體相對長度的范圍為5.21%～11.08%，染色體長度比為2.13，臂比的范圍為1.13～1.83，臂比值大于2 ∶ 1的染色體比率為0，屬于1B核型，核型不對稱系數(shù)（AS.K.%）為56.35%。

‘粒粒甜菇娘染色體總長28.42 μm，絕對長度范圍1.52～3.32 μm，也屬于小型染色體；1號染色體為近中部著絲粒染色體，10號染色體為正中部著絲粒染色體，其余為中部著絲粒染色體，核型公式為K（2n）=24=2sm+2M+20m。染色體相對長度范圍為5.26%～11.61%，染色體長度比為2.20，臂比的范圍為1.00～1.75，臂比值大于2 ∶ 1的染色體比率為8.33%，屬于2B核型，核型不對稱系數(shù)（AS.K.%）為54.93%。

3 討論

秋水仙素和8-羥基喹啉均是廣泛應(yīng)用的預(yù)處理試劑，處理細(xì)胞的機(jī)制是破壞紡錘絲的形成，使細(xì)胞周期停留在有絲分裂中期，得到良好的染色體制片，以便于進(jìn)行染色體的計(jì)數(shù)和形態(tài)觀察[16]。用冰水混合物的處理作用效果同化學(xué)試劑相同，得到有絲分裂中期的染色體制片[17]?，F(xiàn)在也有越來越多的學(xué)者將預(yù)處理試劑混合使用[18-19]，本實(shí)驗(yàn)中，用0.1%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羥基喹啉1 ∶ 1混合液4 ℃處理毛酸漿2個(gè)品種根尖，作用效果明顯好于其他預(yù)處理，染色體較為為清晰。

植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，不利于后期的染色和制片。解離的作用機(jī)制是軟化細(xì)胞壁去除果膠。對于不同的植物材料，解離液的選擇和解離時(shí)間均不相同。本實(shí)驗(yàn)中選用的解離液是1 mol/L HCl和纖維素酶與果膠酶混合酶液。采用的是先用酸解再用酶解，作用效果明顯優(yōu)于單用酸解的效果，解離后的細(xì)胞背景清晰。由于材料不同，解離時(shí)間也會有所不同。本實(shí)驗(yàn)中，毛酸漿則采用的是60 ℃酸解3 min后，用混合酶液酶解1 h進(jìn)行后低滲，得到的染色體圖像效果較佳。本實(shí)驗(yàn)對毛酸漿2個(gè)栽培品種的核型進(jìn)行了報(bào)道。結(jié)果表明，2個(gè)毛酸漿品種鐵把和粒粒甜染色體數(shù)目均為2n=24，均為二倍體植物，且都屬小型染色體，與許亮等[8]和沙成卓等[9]報(bào)道的毛酸漿的結(jié)果一致，而且還與酸漿屬的掛金燈的染色體數(shù)目保持一致[7]，均是以近中部著絲粒染色體和中部著絲粒染色體為主，這與其進(jìn)化過程相一致。‘粒粒甜菇娘的核型為2B型，‘鐵把小菇娘的核型為1B型。比較核型不對稱系數(shù)，‘粒粒甜菇娘的54.93%小于‘鐵把小菇娘的56.35%，2個(gè)的栽培品種在核型上有很大的差異，這種差異的產(chǎn)生原因這還有待于更深入的研究。

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