劉奇奇　溫久福　區(qū)又君　李加兒　周慧

摘要：[目的]探究運(yùn)輸脅迫對(duì)四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）幼魚(yú)肝臟、鰓、脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響，提高種苗運(yùn)輸存活率，為其規(guī)?；B(yǎng)殖提供技術(shù)支持。[方法]以四指馬鲅幼魚(yú)為研究對(duì)象，分別設(shè)對(duì)照組（未運(yùn)輸）、混合組（運(yùn)輸，同時(shí)添加抗應(yīng)激混合物）和空白組（運(yùn)輸，不添加任何抗應(yīng)激劑），抗應(yīng)激劑為維生素c：谷氨酰胺=1：1。混合組和空白組幼魚(yú)經(jīng)6 h運(yùn)輸后分別取樣（肝臟、鰓和脾臟），經(jīng)石蠟切片和HE染色，顯微鏡下觀察測(cè)定肝臟、鰓和脾臟的細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、生活及生理狀態(tài)。[結(jié)果]對(duì)照組幼魚(yú)表現(xiàn)正常，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，混合組幼魚(yú)的累計(jì)死亡率為12.5%，空白組的累計(jì)死亡達(dá)27.5%。對(duì)照組幼魚(yú)的各組織均呈正常形態(tài)；混合組幼魚(yú)的肝臟部分區(qū)域細(xì)胞排列疏松，肝小板結(jié)構(gòu)不清晰；空白組幼魚(yú)的肝臟組織整體失去固有形態(tài)，肝小板結(jié)構(gòu)消失不見(jiàn)，大部分細(xì)胞核變性呈橢圓形或紡錘形?；旌辖M幼魚(yú)的鰓絲排列混亂，少數(shù)鰓小片末端或整體腫脹，血竇內(nèi)紅細(xì)胞出現(xiàn)部分堆積現(xiàn)象，線粒體豐富細(xì)胞體積變大；空白組的鰓小片整體腫脹，血竇加粗，部分鰓小片因紅細(xì)胞過(guò)多而脹破，線粒體豐富細(xì)胞體積變大且數(shù)量增多。混合組幼魚(yú)的脾臟白髓區(qū)域相對(duì)增大，黑色素-巨噬細(xì)胞中心數(shù)量及大小均有所增加；空白組幼魚(yú)的脾臟組織紅髓區(qū)域占據(jù)大部分，白髓區(qū)域相對(duì)較少，呈零散分布，巨噬細(xì)胞中心減小。[結(jié)論]運(yùn)輸脅迫導(dǎo)致四指馬鲅幼魚(yú)肝臟、鰓及脾臟組織損傷，抗應(yīng)激劑混合物雖然在一定程度上起到緩解作用，但并不能完全消除。

關(guān)鍵詞：四指馬鲅；運(yùn)輸脅迫；肝臟；鰓；脾臟；組織損傷；抗應(yīng)激劑

0引言

[研究意義]四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）俗稱午魚(yú)、馬友等，隸屬于鯔形目（Mugiliformes）馬鲅科（Polynemidae）四指馬鲅屬（Eleutheronema）（孫典榮和陳錚，2013），因具有肉質(zhì)鮮美、抗病力強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)而深受廣大養(yǎng)殖戶青睞，現(xiàn)已發(fā)展成為新興水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。隨著四指馬鲅人工繁育技術(shù)的攻克，目前在我國(guó)臺(tái)灣、廣東、海南、浙江等地已有人工養(yǎng)殖（謝木嬌等，2016a），且養(yǎng)殖規(guī)模和市場(chǎng)占有率逐年擴(kuò)大，但四指馬鲅抗應(yīng)激能力較弱，尤其種苗極易受運(yùn)輸?shù)热藶榛顒?dòng)的影響，是制約四指馬鲅規(guī)?；B(yǎng)殖的重要因素。因此，加強(qiáng)四指馬鲅種苗抗應(yīng)激能力研究，解決長(zhǎng)途運(yùn)輸種苗存活率的問(wèn)題，對(duì)促進(jìn)其養(yǎng)殖業(yè)的健康快速發(fā)展具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]至今，有關(guān)四指馬鲅的研究已有較多報(bào)道，包括不同發(fā)育階段消化道組織學(xué)比較（謝木嬌等，2016b）、受精卵和仔魚(yú)對(duì)不同鹽度的耐受性（謝木嬌等，2016c）及消化道黏液細(xì)胞的發(fā)育規(guī)律（謝木嬌等，2015；謝木嬌等，2016a）等。此外，Zischke等（2009）、Moore等（2011）以寄生蟲(chóng)的種群結(jié)構(gòu)推測(cè)寄主遺傳結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)分析了澳大利亞?wèn)|部及北部四指馬鲅的遺傳結(jié)構(gòu)；Newman等（2011）、Ballagh等（2012）分別以同位素標(biāo)記及生活史特征研究澳大利亞北部四指馬鲅的種群結(jié)構(gòu)；林少珍等（2012）利用COI基因序列對(duì)我國(guó)東南沿海四指馬鲅種群的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；羅海忠等（2015）采用鹽度漸變法研究5種鹽度對(duì)四指馬鲅幼魚(yú)生長(zhǎng)及其鰓絲Na+/K+-ATP酶的影響。上述研究結(jié)果為四指馬鲅的養(yǎng)殖生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。[本研究切入點(diǎn)]應(yīng)激是機(jī)體對(duì)外界或內(nèi)部各種異常刺激所產(chǎn)生的非特異性全身反應(yīng)，是生物體在長(zhǎng)期進(jìn)化中形成的一種適應(yīng)性和防御性功能。魚(yú)類極易受水環(huán)境及其他外界環(huán)境的影響從而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)其健康造成不利影響，尤其是長(zhǎng)期應(yīng)激脅迫會(huì)降低機(jī)體的抵抗力和生長(zhǎng)速率等（孫鵬等，2014），但目前有關(guān)環(huán)境脅迫影響四指馬鲅的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]通過(guò)對(duì)比運(yùn)輸脅迫前后四指馬鲅幼魚(yú)肝臟、鰓及脾臟的顯微結(jié)構(gòu)變化，探究四指馬鲅應(yīng)對(duì)運(yùn)輸脅迫的應(yīng)答規(guī)律，旨在提高種苗運(yùn)輸存活率，為其規(guī)?；B(yǎng)殖提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試四指馬鲅幼魚(yú)于2016年6-9月在南海水產(chǎn)研究所珠海試驗(yàn)基地培育獲得，體長(zhǎng)11.0±0.5 cm，體質(zhì)量24.0±1.5 g。試驗(yàn)開(kāi)始前進(jìn)行馴養(yǎng)，使其適應(yīng)環(huán)境，期間每天換水1次，每次換水量1/2左右，連續(xù)充氣增氧。馴養(yǎng)1周后隨機(jī)挑選90尾體色正常、健康的幼魚(yú)用于試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)方法

在水溫25℃、pH 8.0±0.2、溶解氧6.0±0.5 mg/L的條件下，將四指馬鲅幼魚(yú)隨機(jī)平均分為3組，即對(duì)照組（未運(yùn)輸）、混合組（運(yùn)輸，同時(shí)添加抗應(yīng)激混合物）和空白組（運(yùn)輸，不添加任何抗應(yīng)激劑）。對(duì)照組幼魚(yú)（30尾）用MS-222麻醉2-3 min，取其肝臟、鰓和脾臟樣品固定于4%多聚甲醛溶液中。同時(shí)取6個(gè)相同規(guī)格的暫養(yǎng)桶（直徑1.3 m、高1.5 m，加水量約占總體積的80%），其中3個(gè)暫養(yǎng)桶（混合組）參考周傳朋等（2014）的方法在養(yǎng)殖水中添加維生素C：谷氨酰胺=1：1的抗應(yīng)激劑混合物，使其濃度為20 mg/m3；另外3個(gè)暫養(yǎng)桶（空白組）的養(yǎng)殖水不添加抗應(yīng)激劑。每個(gè)桶暫養(yǎng)10尾四指馬鲅幼魚(yú)，以中型卡車在公路上正常行駛6 h。運(yùn)輸結(jié)束時(shí)，以同樣方法取肝臟、鰓和脾臟樣品，固定于4%多聚甲醛溶液中。

1.3測(cè)定項(xiàng)目及方法

參照陳世喜等（2017）的方法，取出4%多聚甲醛固定的四指馬鲅幼魚(yú)肝臟、鰓和脾臟樣品，經(jīng)流水沖洗、70%-100%乙醇脫水和二甲苯透明，以石蠟包埋處理后用Leica切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度5-6pm，采用HE染色和中性樹(shù)脂封片，于Zeiss顯微鏡下觀察拍照。觀察測(cè)定項(xiàng)目包括幼魚(yú)肝臟、鰓和脾臟的細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)及其生活生理狀態(tài)。

2結(jié)果與分析

2.1運(yùn)輸脅迫前后四指馬鲅幼魚(yú)的生活狀態(tài)及死亡率

對(duì)照組幼魚(yú)表現(xiàn)正常，沿暫養(yǎng)池壁集體朝同一方向不停游動(dòng)，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；混合組幼魚(yú)在運(yùn)輸期間向不同方向快速、混亂游動(dòng)，并撞擊桶壁，有少數(shù)幼魚(yú)死亡，累計(jì)死亡率為12.5%；空白組幼魚(yú)在運(yùn)輸初期與混合組無(wú)明顯區(qū)別，但隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)，幼魚(yú)游動(dòng)速度明顯減慢，且動(dòng)作不協(xié)調(diào)，有的甚至呈側(cè)游或翻身游動(dòng)，運(yùn)輸結(jié)束后的累計(jì)死亡率達(dá)27.5%。

2.2運(yùn)輸脅迫對(duì)四指馬鲅幼魚(yú)肝臟組織的影響

對(duì)照組幼魚(yú)的肝細(xì)胞呈多面體緊密排列，細(xì)胞核大而圓，多為單核，居細(xì)胞中央，且著色較深，部分細(xì)胞出現(xiàn)因糖原溶解形成的空泡；肝小板和肝血竇沿中央靜脈呈放射狀相間排列，結(jié)構(gòu)清晰；中央靜脈位于肝小葉中部，周圍有許多肝血竇開(kāi)口，其橫切面呈圓形，均表現(xiàn)為正常形態(tài)（圖1-1、圖1-2和圖1-3）。混合組幼魚(yú)的肝臟受到較輕微損傷，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞空泡消失，形狀不規(guī)則，部分區(qū)域細(xì)胞排列散亂，部分細(xì)胞核著色較深；肝小葉及肝小板結(jié)構(gòu)不清晰，肝血竇間隙增大；中央靜脈橫切面呈不規(guī)則形狀（圖1-4、圖1-5和圖1-6）?？瞻捉M幼魚(yú)的肝組織受到嚴(yán)重?fù)p傷，主要表現(xiàn)為整體肝細(xì)胞核失去固有形態(tài)，細(xì)胞排列松散且不規(guī)則，大部分細(xì)胞核變性呈橢圓形或紡錘形，著色較淺，空泡消失；肝小板及肝小葉結(jié)構(gòu)消失不見(jiàn)；中央靜脈周圍肝血竇開(kāi)口較大，其橫切面呈不規(guī)則形狀且內(nèi)部充滿血細(xì)胞（圖1-7、圖1-8和圖1-9）。

2.3運(yùn)輸脅迫對(duì)四指馬鲅幼魚(yú)鰓組織的影響

對(duì)照組幼魚(yú)鰓組織中線粒體豐富細(xì)胞呈橢圓形，分布在鰓小片基部，上皮細(xì)胞呈扁平狀規(guī)則排列；血竇內(nèi)均勻分布有紅細(xì)胞，兩側(cè)的鰓小片對(duì)稱且完整，鰓絲密集且排列整齊，其結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為正常的生理形態(tài)（圖2-1、圖2-2和圖2-3）。與對(duì)照組相比，混合組幼魚(yú)鰓組織中線粒體豐富細(xì)胞體積變大；血竇收縮，其紅細(xì)胞分布不均勻，出現(xiàn)部分堆積現(xiàn)象；鰓小片呈S形扭曲且排列不規(guī)則，大部分鰓小片彎曲，少數(shù)鰓小片末端或整體腫脹；鰓絲排列不整齊，部分鰓絲中間開(kāi)裂，且著色力減弱（圖2-4、圖2-5和圖2-6），表明運(yùn)輸脅迫對(duì)鰓組織已造成一定損傷，但并不嚴(yán)重。空白組幼魚(yú)鰓組織中線粒體豐富細(xì)胞體積變大且數(shù)量增多，大部分上皮細(xì)胞水腫變性，部分表皮出現(xiàn)脫落現(xiàn)象；鰓小片整體腫脹，血竇增寬，紅細(xì)胞分布不均勻，部分鰓小片因紅細(xì)胞過(guò)多而脹破；鰓絲整體水腫，部分鰓絲中間開(kāi)裂，其整體偏離正常形態(tài)（圖2-7、圖2-8和圖2-9），表明運(yùn)輸脅迫對(duì)鰓組織造成嚴(yán)重?fù)p傷。

2.4運(yùn)輸脅迫對(duì)四指馬鲅幼魚(yú)脾臟組織的影響

對(duì)照組幼魚(yú)脾臟組織網(wǎng)狀支架上分布極密集的淋巴細(xì)胞，最外層可觀察到被膜，局部可見(jiàn)由被膜結(jié)締組織形成的小梁結(jié)構(gòu)；被膜以下由紅髓和白髓交替分布形成密集網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的脾臟實(shí)質(zhì)，分布有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；在紅髓周圍稀散分布的為白髓結(jié)構(gòu)，區(qū)域面積相對(duì)紅髓區(qū)域要小很多，內(nèi)部分布有密集的淋巴細(xì)胞（圖3-1、圖3-2和圖3-3）。與對(duì)照組相比，混合組幼魚(yú)的脾臟組織受到一定損傷，但并不嚴(yán)重，表現(xiàn)為白髓區(qū)域增大，黑色素一巨噬細(xì)胞中心數(shù)量及大小均有所增加；邊緣區(qū)面積增加（圖3-4、圖3-5和圖3-6）?？瞻捉M幼魚(yú)脾臟嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為組織中充滿紅細(xì)胞，紅髓與白髓相對(duì)較少，呈零散分布，巨噬細(xì)胞中心數(shù)量和邊緣區(qū)域面積均減小（圖3-7、圖3-8和圖3-9）。

3討論

與自然條件下相比，魚(yú)類在集約化養(yǎng)殖過(guò)程中需經(jīng)受更多人為因素的干擾，但在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中魚(yú)類已形成了相應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。劉小玲（2007）研究表明，輕度刺激可促進(jìn)魚(yú)類生長(zhǎng)，改善魚(yú)類體質(zhì)，但劇烈或長(zhǎng)期刺激會(huì)干擾魚(yú)類的正常生理功能，導(dǎo)致機(jī)體功能紊亂，甚至死亡。肝臟是魚(yú)類最大的消化腺，可分泌膽汁促進(jìn)脂肪的分解與吸收，又參與多種物質(zhì)的合成、儲(chǔ)存、代謝和轉(zhuǎn)化。肝細(xì)胞內(nèi)含有多種內(nèi)含物，主要有糖原、脂滴及色素等，且其含量與機(jī)體的生理狀態(tài)密切相關(guān)。彭士明等（2011）研究表明，運(yùn)輸脅迫下銀鯧（Pampus argenteus）的機(jī)體能量供給主要來(lái)自肝臟糖元分解。本研究中，由于分組過(guò)程中幼魚(yú)受到驚嚇，導(dǎo)致其肝糖元的代謝與合成平衡被打亂，可能是對(duì)照組四指馬鲅幼魚(yú)肝臟組織出現(xiàn)空泡的原因。Johnston等（1989）對(duì)虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的研究表明，維生素C可通過(guò)神經(jīng)調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)腦部激素水平，調(diào)控魚(yú)類行為以增強(qiáng)其抗應(yīng)激能力。黃玉萍等（2010）研究表明，抗應(yīng)激復(fù)合物可有效提高團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）的抗應(yīng)激能力，降低應(yīng)激對(duì)肝臟等組織的損傷。此外，徐洋等（2011）研究證實(shí)谷氨酰胺可促進(jìn)腸道黏膜修復(fù)、淋巴細(xì)胞增殖、巨噬細(xì)胞分裂和分化，在免疫調(diào)節(jié)方面具有重要意義。本研究中，混合組幼魚(yú)肝細(xì)胞空泡消失可能是抗應(yīng)激劑對(duì)魚(yú)類能量代謝起調(diào)解作用。運(yùn)輸過(guò)程中幼魚(yú)因受到驚嚇而劇烈掙扎游動(dòng)，其能量代謝及耗氧量隨之增加，為滿足機(jī)體對(duì)氧的需求，故肝血竇間隙增大、血流加快；部分肝細(xì)胞排列散亂及不規(guī)則的中央靜脈橫切面，其原因可能是運(yùn)輸過(guò)程中幼魚(yú)不斷撞擊桶壁導(dǎo)致肝臟組織發(fā)生機(jī)械性損傷。四指馬鲅幼魚(yú)的肝臟組織在運(yùn)輸脅迫后失去固有形態(tài)，其生理狀態(tài)趨于崩潰，累計(jì)死亡率高達(dá)27.5%，與Zhang等（2004）的研究結(jié)果相似?？傊?，運(yùn)輸脅迫會(huì)對(duì)四指馬鲅幼魚(yú)的肝臟造成損傷，添加抗應(yīng)激劑混合物可起到一定的緩解作用，但無(wú)法從根本上消除。

鰓是魚(yú)類的主要呼吸器官，同時(shí)具有排泄氨氮等代謝廢物及調(diào)解滲透壓的功能。本研究中，混合組幼魚(yú)鰓線粒體豐富細(xì)胞體積變大的現(xiàn)象與高鹽度下卵形鯧夠（Trachinotus ovatus）線粒體豐富細(xì)胞（區(qū)又君等，2013）的變化相同，表明運(yùn)輸應(yīng)激破壞了四指馬鲅幼魚(yú)的滲透壓平衡，少數(shù)鰓小片末端或整體出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象。與肝組織相同，在抗應(yīng)激劑混合物作用下四指馬鲅幼魚(yú)的鰓基礎(chǔ)代謝增加、血流加快，但由于運(yùn)輸脅迫致使血竇收縮，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞分布不均勻，出現(xiàn)部分堆積現(xiàn)象，與陳彩芳等（2012）對(duì)泥蚶（Tegillarca granosa）的研究結(jié)果相似。本研究中，混合組幼魚(yú)鰓小片呈S形扭曲且排列不規(guī)則，可能是運(yùn)輸過(guò)程中幼魚(yú)劇烈掙扎，加上滲透壓遭到破壞，鰓小片局部吸水所造成?？瞻捉M幼魚(yú)線粒體豐富細(xì)胞體積變大且數(shù)量增多，與鹽度脅迫遮目魚(yú)（Chanos chanos）幼魚(yú)的試驗(yàn)結(jié)果（區(qū)又君等，2014）相似，表明四指馬鲅幼魚(yú)為克服運(yùn)輸脅迫，調(diào)動(dòng)相關(guān)生理反應(yīng)而消耗大量能量。四指馬鲅幼魚(yú)鰓組織上皮細(xì)胞水腫變性，部分表皮脫落，表明運(yùn)輸脅迫導(dǎo)致鰓Na+/K+-ATP酶活性下降，即在無(wú)抗應(yīng)激劑的條件下幼魚(yú)鰓功能遭到破壞。可見(jiàn)，運(yùn)輸脅迫致使四指馬鲅幼魚(yú)鰓組織出現(xiàn)不同程度的損傷，添加抗應(yīng)激劑能起到明顯的緩解作用。

脾臟主要由淋巴組成，在魚(yú)類的造血、免疫及儲(chǔ)血方面發(fā)揮著重要作用。低鹽脅迫下，許氏平觸（Sebastes schlegeli）脾臟組織中淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，且呈聚集現(xiàn)象（王曉杰等，2006）。本研究中，混合組幼魚(yú)脾臟組織的變化與低鹽脅迫下許氏平觸脾臟組織的變化相似，表明抗應(yīng)激劑在一定程度上能提高受運(yùn)輸脅迫幼魚(yú)的免疫反應(yīng)能力，促使免疫細(xì)胞的數(shù)量合成增加。王文博等（2004）對(duì)草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）的研究表明，擁擠脅迫會(huì)對(duì)魚(yú)類脾臟器官造成極大損傷。運(yùn)輸脅迫下四指馬鲅幼魚(yú)脾臟組織的白髓及巨噬細(xì)胞中心數(shù)量均相對(duì)減少，說(shuō)明其免疫系統(tǒng)已無(wú)法抵御運(yùn)輸脅迫的干擾，免疫細(xì)胞合成受阻，與王曉杰等（2006）的研究結(jié)果相似，表明長(zhǎng)期處于應(yīng)激脅迫下魚(yú)類免疫力易受到明顯影響，因此在養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)避免長(zhǎng)期的逆境脅迫。

實(shí)際生產(chǎn)中，采取以下措施能有效提高魚(yú)類的抗應(yīng)激能力（王慶萍等，2013）：（1）運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)避免多重應(yīng)激；（2）盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間；（3）避免在高溫季節(jié)運(yùn)輸；（4）長(zhǎng)途運(yùn)輸前宜禁食2-3 d，以減少應(yīng)激時(shí)的耗氧量；（5）可在餌料中適當(dāng)添加維生素C、谷氨酰胺等抗應(yīng)激劑。此外，Verbeek等（2008）研究證實(shí)，魚(yú)類的早期應(yīng)激經(jīng)歷可增強(qiáng)其后期抗應(yīng)激的適應(yīng)能力，即通過(guò)適當(dāng)馴化可有效提高魚(yú)類的抗應(yīng)激能力；鄺哲師等（2011）、Bacarin等（2015）研究表明，餌料中添加乳酸菌、不飽和脂肪酸或魚(yú)油等也可改善魚(yú)類體質(zhì)，提高其抗應(yīng)激能力。因此，在餌料中適量添加益生菌或不飽和脂肪酸等，可能是提高四指馬鲅運(yùn)輸存活率的有效途徑之一。

4結(jié)論

運(yùn)輸脅迫導(dǎo)致四指馬鲅幼魚(yú)肝臟、鰓及脾臟組織損傷，抗應(yīng)激劑混合物雖然在一定程度上起到緩解作用，但并不能完全消除。