費(fèi)倩倩，丁家怡，施蔚紅，金華，譚小方，陳小波(南通市婦幼保健院.生殖醫(yī)學(xué)中心，.產(chǎn)前診斷中心，江蘇南通 226000)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者血清IL-33水平與TH1、TH2、TH17及Treg細(xì)胞間的關(guān)系*

費(fèi)倩倩a，丁家怡a，施蔚紅a，金華a，譚小方a，陳小波b
(南通市婦幼保健院a.生殖醫(yī)學(xué)中心，b.產(chǎn)前診斷中心，江蘇南通 226000)

目的 探討IL-33和TH1、TH2、TH17及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)在原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)患者中的水平及其相關(guān)性。方法 收集46例URSA患者及40例健康人對(duì)照者，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血TH1、TH2、TH17及Treg細(xì)胞比例；ELISA檢測(cè)血清IL-33濃度。結(jié)果 與健康人對(duì)照組相比，URSA患者血清IL-33濃度顯著下降，此外，外周血TH1和TH17細(xì)胞比例更高，而TH2和Treg細(xì)胞則低于健康人對(duì)照組(P<0.05)。IL-33濃度與TH1和TH17細(xì)胞比例均顯著負(fù)相關(guān)，而與TH2細(xì)胞比例呈正相關(guān)性，但與Treg細(xì)胞間無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 URSA患者外周血IL-33濃度顯著下調(diào)，并與TH1、TH2和TH17等免疫細(xì)胞比例相關(guān)，提示在URSA患者中IL-33可能與TH1、TH2和TH17存在關(guān)聯(lián)。

原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；白介素33；輔助T細(xì)胞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion, RSA)是指連續(xù)兩次以上在孕20周以前發(fā)生的自然流產(chǎn)，其發(fā)病率約為1%～3%[1]。其中原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)約占RSA患者的50%左右。目前研究表明URSA多與母胎免疫因素相關(guān)，免疫調(diào)控與抑制間失衡被認(rèn)為是URSA的主要原因[2]。既往大量研究支持TH1/TH2失衡可能是URSA患者中主要的免疫系統(tǒng)變化，而新型T細(xì)胞亞群如TH17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)的出現(xiàn)改變了這一假說(shuō)。Lee等[3]已經(jīng)報(bào)道了TH17和Treg細(xì)胞間紊亂參與URSA致病的機(jī)理。IL-33為IL-1家族新成員，參與多種炎癥性和自身免疫性疾病，且可通過(guò)調(diào)控TH1/TH2和TH17/Treg細(xì)胞平衡發(fā)揮生理作用[4]。據(jù)此，推測(cè)IL-33可能在URSA過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)URSA患者血清IL-33水平，分析其與TH1、TH2、TH17和Treg細(xì)胞間的關(guān)聯(lián)，探討IL-33與URSA發(fā)病的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年2月至2016年5月于南通市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的URSA患者46例，符合URSA診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，即2次以上自然流產(chǎn)，病因經(jīng)普通檢查無(wú)法確定，且男方精液指數(shù)正常。排除染色體異常、激素水平紊亂、代謝性疾病、感染性疾病以及諸如抗磷脂抗體、狼瘡抗凝物、抗核抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體及抗絨毛膜促性腺激素(HCG)抗體陽(yáng)性的患者。URSA組年齡(32.61±3.59)歲，就診時(shí)B超示胚胎停止發(fā)育，流產(chǎn)時(shí)孕周(8.1±0.9)周。選取同期在門(mén)診要求人工流產(chǎn)的早孕女性40例作為對(duì)照組，B超示胚胎正常發(fā)育。對(duì)照組無(wú)自然流產(chǎn)史及自身免疫病和遺傳病史，年齡(31.79±3.98)歲，行人工流產(chǎn)手術(shù)時(shí)孕周(7.9±1.3)周。兩組間年齡、孕周差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 試劑及儀器 Human IL-33 Quantikine ELISA Kit(R&D公司)；藻紅蛋白-德克薩斯紅(ECD)標(biāo)記抗人CD3抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗人CD4抗體、藻紅蛋白-花青素5(PC5)標(biāo)記抗人CD25抗體、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記抗人IL-17抗體、藻紅蛋白-花青素7(PC7)標(biāo)記抗人CD45抗體、PE標(biāo)記抗人IL-4抗體、PE標(biāo)記抗人IFN-γ抗體(BD公司)；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(北京索寶公司)；Beckman FC500流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司)。

1.3 標(biāo)本采集 URSA組和對(duì)照組分別在流產(chǎn)術(shù)前抽取清晨空腹靜脈血10 mL，分裝4管。其中3管EDTA抗凝，與等體積PBS混勻后用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，保存于含10%二甲基亞砜(DMSO)的胎牛血清中。另一管分裝至干燥管，分離血清，-80 ℃保存。

1.4 血清IL-33濃度檢測(cè) 血清IL-33濃度檢測(cè)采用ELISA法，具體步驟和方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 TH1、TH2及TH17細(xì)胞比例檢測(cè) 用RPMI 1640調(diào)整PBMC濃度至2.0×106/mL，接種于6孔板中加入25 ng/mL佛波酯、500 ng/mL離子霉素及1.7 μg/mL莫能霉素，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。加入熒光標(biāo)記抗CD3和CD4抗體各10 μL，室溫避光溫育20 min，用PBS洗2次離心棄上清，固定劑固定15 min，PBS洗1次離心棄上清，加入破膜劑室溫溫育5 min離心棄上清。分別加抗IL-4、IFN-γ和IL-17抗體，室溫避光溫育20 min，離心棄上清，加入500 μL PBS懸浮后上機(jī)檢測(cè)。圈定CD3+細(xì)胞群，分析TH1、TH2及TH17細(xì)胞群，表型分別為CD3+CD4+IFN-γ+、CD3+CD4+IL-4+和CD3+CD4+IL-17+。

1.6 Treg細(xì)胞比例檢測(cè) 取EDTA抗凝血30 μL加入流式檢測(cè)管，加入CD45、CD4和CD25抗體各3 μL，室溫避光溫育15 min，加300 μL紅細(xì)胞裂解液混勻，室溫避光10 min，離心棄上清；用PBS洗2次棄上清，加300 μL PBS重懸上機(jī)，根據(jù)CD45和SSC圈定淋巴細(xì)胞群，再對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門(mén)，圈定CD4+CD25highTreg細(xì)胞群。

2 結(jié)果

2.1 URSA患者血清IL-33濃度 URSA患者和對(duì)照組血清IL-33水平分別為(113.95±29.77) pg/mL和(146.35±21.08) pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.972，P<0.05)。

2.2 URSA患者外周血TH1、TH2、TH17、Treg細(xì)胞比例 流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，URSA患者外周血TH1比例高于對(duì)照組，TH2細(xì)胞比例低于對(duì)照組，TH17細(xì)胞比例高于對(duì)照組，而Treg細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)表1。流式圖詳見(jiàn)圖1。

2.3 URSA患者血清IL-33水平與TH1、TH2、 TH17、Treg細(xì)胞比例間的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，IL-33與TH1和TH17細(xì)胞比例呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(rTH1=-0.367，P=0.021；rTH17=-0.406，P=0.016)，而與TH2細(xì)胞比例存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.467，P=0.006)。但其與Treg細(xì)胞比例間相關(guān)關(guān)系并不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.009，P=0.628)。

表1 URSA患者外周血TH1、TH2、TH17、Treg細(xì)胞比例(%)

圖1 URSA患者與對(duì)照組外周血TH1、TH2、TH17、Treg細(xì)胞流式檢測(cè)

3 討論

URSA病因復(fù)雜，免疫功能異常變化與之相關(guān)。正常妊娠中母胎界面免疫耐受發(fā)揮至關(guān)重要作用。研究發(fā)現(xiàn)TH1/TH2偏移現(xiàn)象與成功妊娠密切相關(guān)，正常妊娠TH2細(xì)胞占主導(dǎo)地位，而URSA等妊娠失敗患者體內(nèi)TH1則占優(yōu)勢(shì)。本研究通過(guò)流式細(xì)胞分析檢測(cè)外周血TH1和TH2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)URSA患者存在TH1/TH2偏移現(xiàn)象，以TH1增多為主，這與先前報(bào)道相一致[6]。新型T細(xì)胞亞群TH17及Treg細(xì)胞同樣在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。既往研究證實(shí)Treg細(xì)胞在URSA婦女體內(nèi)顯著下降，表明其可能參與母胎免疫耐受，有助于維持正常妊娠[7]。本研究也發(fā)現(xiàn)URSA患者Treg細(xì)胞比例顯著下降。TH17細(xì)胞與Treg發(fā)揮相反生理效應(yīng)，過(guò)多的TH17具有抑制妊娠的作用。Wu等[7]報(bào)道了TH17與Treg失衡與URSA發(fā)病過(guò)程相關(guān)，Yang等[8]也發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞免疫療法可顯著增加URSA患者Treg細(xì)胞比例，且有助于改善妊娠結(jié)局。本研究中TH17細(xì)胞比例增加與Treg細(xì)胞比例下調(diào)和以上結(jié)果相符，進(jìn)一步證實(shí)了URSA患者中不僅存在TH1/TH2偏移，亦會(huì)出現(xiàn)TH17/Treg失衡，這些免疫功能異常變化可能在URSA病因?qū)W中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但TH1/TH2及TH17/Treg偏移的潛在機(jī)制尚不清楚。IL-33是IL-1家族新成員，可通過(guò)激活包括TH2細(xì)胞在內(nèi)的多種固有免疫細(xì)胞誘導(dǎo)Ⅱ型免疫反應(yīng)，在多種炎癥性疾病中扮演重要角色。羅金等[9]在RSA小鼠胎盤(pán)組織中發(fā)現(xiàn)IL-33表達(dá)水平下降，而本研究發(fā)現(xiàn)IL-33在URSA患者中亦存在顯著下調(diào)現(xiàn)象，也進(jìn)一步證實(shí)IL-33與URSA間的關(guān)聯(lián)。此外，有研究表明IL-33可誘導(dǎo)TH2型細(xì)胞因子分泌，參與TH2型細(xì)胞反應(yīng)[10]。Zhu等[11]近期證實(shí)IL-33在結(jié)腸炎小鼠模型中可抑制TH1和TH17型細(xì)胞反應(yīng)。以上結(jié)果提示IL-33與TH1、TH2和TH17細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)。在URSA患者中發(fā)現(xiàn)IL-33與TH1、TH2和TH17細(xì)胞比例確實(shí)存在相關(guān)關(guān)系。而目前關(guān)于IL-33與Treg細(xì)胞間的作用研究甚少，兩者關(guān)系不明，而本研究中發(fā)現(xiàn)URSA患者中兩者無(wú)顯著相關(guān)性。

本研究尚存在不足之處，比如納入研究的樣本量較少，若要明確IL-33對(duì)于URSA是否具有臨床預(yù)測(cè)價(jià)值，需要加大樣本量并進(jìn)行多中心聯(lián)合研究。同時(shí)，未來(lái)將在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證IL-33是否可以改善URSA小鼠的妊娠結(jié)局，以及其對(duì)TH1、TH2、TH17和Treg細(xì)胞的影響，明確IL-33參與URSA的免疫學(xué)機(jī)制?？傊狙芯砍醪阶C實(shí)URSA患者中存在IL-33下調(diào)現(xiàn)象，且IL-33與TH1、TH2、TH17均存在相關(guān)性，而與Treg間無(wú)顯著相關(guān)性。提示IL-33參與URSA發(fā)病過(guò)程，并可能與TH1、TH2、TH17和Treg等免疫細(xì)胞存在關(guān)聯(lián)。

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(本文編輯：劉群)

Serum IL-33 level and its correlation with TH1, TH2, TH17 and Treg cells in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion

FEIQian-qiana,DINGJia-yia,SHIWei-honga,JINHuaa,TANXiao-fanga,CHENXiao-bob
(a.CenterforReproductiveMedicine,b.PrenatalDiagnosticCenter,NantongMaternalandChildrenHealthCareHospital,Nantong226000,Jiangsu,China)

Objective To investigate the serum IL-33 level and its association with TH1, TH2, TH17 and Treg cells in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion(URSA). Methods Forty-six URSA patients and 40 healthy controls were enrolled. The proportions of TH1, TH2, TH17 and Treg cells in peripheral blood samples were determined by flow cytometry, and serum IL-33 levels by ELISA. Results The levels of serum IL-33 in URSA patients were significantly lower than that in healthy controls. The proportions of TH2 and Treg cells in URSA patients were significantly lower than that in healthy controls(P<0.05), while the proportions of TH1 and TH17 cells in URSA patients were significantly higher than that in healthy controls. Serum IL-33 levels were negatively correlated with the proportions of TH1 and TH17 cells, and positively with that of TH2 cells, while no correlation with Treg cells. Conclusion Serum IL-33 levels decrease significantly in URSA patients, and are correlated with the proportions of TH1, TH2 and TH17 cells, indicating that IL-33 may be associated with TH1, TH2 and TH17 cells in URSA patients.

unexplained recurrent spontaneous abortion; IL-33; helper T cell; regulatory T cell

南通市科技計(jì)劃項(xiàng)目(HS2014012)。

費(fèi)倩倩，1983年生，女，主管技師，主要從事生殖遺傳和輔助生殖技術(shù)研究。

陳小波，主管技師，E-mail：95235205@qq.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.11

R446.6

A

2017-01-03)