韓融冰 趙玉卉 路等學(xué) 王 龍 秦 鵬

（甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅蘭州730000）

羊肚菌（Morchella sp.）是一種野生食用菌，又名美味羊肚菌，俗稱羊雀菌、包谷菌等，是子囊菌亞門（Ascomycotina）中著名的食用菌，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，風(fēng)味鮮美，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛(ài)[1，2]。羊肚菌在我國(guó)主要分布于甘肅、四川、陜西、云南等地[3]。《中華本草》記載：羊肚菌消食和胃，化痰理氣，主治消化不良，痰多咳嗽，還有防癌抗癌、預(yù)防感冒、增加人體免疫力的效果[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，羊肚菌生物活性有效組分多糖的含量很高，其子實(shí)體多糖和液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的菌絲體多糖入藥有消積殺蟲(chóng)的作用，增強(qiáng)人體免疫功能，還具有抗病毒、抗腫瘤作用，且能降低膽固醇含量，防止動(dòng)脈硬化等功效[5]。由于羊肚菌栽培條件復(fù)雜，商品化栽培生產(chǎn)還難以實(shí)現(xiàn)，目前液體發(fā)酵成為利用該菌的重要途徑[1]。研究表明，由于中草藥中的成分（生物堿、皂苷、黃酮等）可促進(jìn)或抑制藥用真菌菌絲體的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[6]。筆者通過(guò)比較4種甘肅特色中藥甘草、當(dāng)歸、黨參、板藍(lán)根提取液對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的影響，篩選出有明顯促進(jìn)作用的中藥種類和添加濃度，可為大規(guī)模培養(yǎng)羊肚菌菌絲體、并提取羊肚菌多糖提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料①菌種：羊肚菌4#，購(gòu)自四川綿陽(yáng)食用菌研究所。②中藥：甘草、當(dāng)歸、黨參、板藍(lán)根（藥材級(jí)），購(gòu)自甘肅德生堂大藥房。③培養(yǎng)基PDA：馬鈴薯（去皮）20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，用于添加量篩選試驗(yàn)。液體培養(yǎng)基：玉米粉（煮汁）1%，黃豆粉（煮汁）0.5%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.1%。用于液體培養(yǎng)驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中藥提取液的制備[7]稱取100 g中藥，在500 mL水中浸泡1 h后用燒杯文火煎煮30 min，用四層紗布濾出藥汁，再在藥渣中加300 mL水煎煮，濾出藥汁，將兩次濾出的藥汁混合并定容至500 mL，備用。

1.2.2 中藥液添加濃度篩選試驗(yàn) 將4種中藥提取液加入PDA培養(yǎng)基中，配置成6個(gè)質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基，提取液為25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/mL、125 mg/mL、150 mg/mL，空白對(duì)照組為不加中藥提取液的基本PDA培養(yǎng)基，制平板，每個(gè)處理5個(gè)平行。將活化培養(yǎng)（PDA平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)3～4 d）的羊肚菌菌絲體塊（直徑6 mm）接于各處理組和對(duì)照組平板中，25℃、避光培養(yǎng)，定期觀察菌絲生長(zhǎng)勢(shì)。如未篩選出理想的中藥濃度，則根據(jù)試驗(yàn)的具體情況重新設(shè)定中藥提取液的濃度范圍。

每個(gè)中藥提取液選取促進(jìn)羊肚菌生長(zhǎng)的兩個(gè)最佳添加濃度進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.2.3 液體搖瓶培養(yǎng)驗(yàn)證 將菌種接入液體培養(yǎng)基中（接種塊的大小、厚薄以菌種塊浮在液面不沉下去為宜），25oC恒溫靜置培養(yǎng)2～3 d，待菌絲萌發(fā)后，25℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，制得羊肚菌液體菌種，備用。

根據(jù)平板上篩選出的最佳中藥提取液濃度范圍，在無(wú)菌條件下抽取30 mL制備好的羊肚菌液體菌種，接種到裝有添加中藥提取液的液體培養(yǎng)基（300 mL）的500 mL的三角瓶中，空白對(duì)照組不加中藥提取液。每組3個(gè)平行，25℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)，以培養(yǎng)液清澈結(jié)束培養(yǎng)，測(cè)定生物量[8]，以確定不同中藥提取液添加的最佳濃度。

1.2.4 菌絲體特征觀察 將轉(zhuǎn)接了菌絲體塊的各組平板置于25℃、避光條件下恒溫培養(yǎng)，定期觀察菌絲生長(zhǎng)勢(shì)，以菌絲即將長(zhǎng)滿而未長(zhǎng)滿平皿時(shí)作為測(cè)量終點(diǎn)，記錄培養(yǎng)天數(shù)，以接種塊為中心用刻度尺測(cè)量菌落直徑（mm），隨機(jī)測(cè)量3次，取平均值。計(jì)算菌絲日均長(zhǎng)速[7]：

1.2.5 菌落干重測(cè)定[7]菌絲體培養(yǎng)到第7天時(shí)，將平板中的菌絲體連同培養(yǎng)基一并取出，放入盛有蒸餾水的搪瓷量杯中，每個(gè)平板對(duì)應(yīng)一個(gè)量杯，然后將量杯放在電磁爐上加熱，直至培養(yǎng)基完全液化，用玻璃棒挑出菌絲，并在加熱的蒸餾水中漂洗幾遍，取出后用濾紙吸去多余水分，置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中105oC烘至恒重后稱重。

1.2.6 搖瓶培養(yǎng)菌絲體生物量的測(cè)定[8]將發(fā)酵液移入離心管中在高速離心機(jī)4000 r/min離心30 min，把離心管底部的沉淀物用小勺移入180目的濾布中，用蒸餾水反復(fù)沖洗后將菌絲體移入培養(yǎng)皿中，再置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中105oC烘至恒重后稱重[8]。

2 結(jié)果與分析

表1 不同質(zhì)量濃度甘草提取液對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)的影響

2.1 不同質(zhì)量濃度甘草提取液對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)的影響由表1可知，與對(duì)照相比，不同質(zhì)量濃度的甘草提取液對(duì)羊肚菌菌絲體生物量的積累有促進(jìn)作用，在25～125 mg/mL，隨提取液添加質(zhì)量濃度的上升，雖然菌絲體生長(zhǎng)速度逐漸變慢，但菌絲體生長(zhǎng)密度逐漸增大，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，菌絲體生物量積累明顯增加，其中添加甘草提取物質(zhì)量濃度為125 mg/mL和150 mg/mL時(shí)效果最明顯，菌落干重分別達(dá)到191 mg和183 mg。

2.2 不同質(zhì)量濃度當(dāng)歸提取液對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)的影響由表2可知，與對(duì)照相比，不同質(zhì)量濃度的當(dāng)歸提取液對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，在25～125 mg/mL，隨質(zhì)量濃度的增加，菌絲體生長(zhǎng)速度逐漸變緩的同時(shí)菌絲體生長(zhǎng)密度逐漸增大，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，得到的菌落干重也相應(yīng)增加，其中甘草提取物添加質(zhì)量濃度為125 mg/mL和150 mg/mL時(shí)效果最明顯，菌落干重分別達(dá)到248 mg和231 mg。

表2 不同質(zhì)量濃度當(dāng)歸提取液對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)的影響

2.3 不同質(zhì)量濃度黨參提取液對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)的影響由表3可知，與對(duì)照相比，不同質(zhì)量濃度的黨參提取液對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，在25～125 mg/mL，隨著濃度的增加，菌絲體生長(zhǎng)速度逐漸變慢的同時(shí)菌絲體生長(zhǎng)密度逐漸增大，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，得到的菌落干重也相應(yīng)增加。其中黨參提取物質(zhì)量濃度為100 mg/mL和125 mg/mL時(shí)效果最明顯，菌落干重分別達(dá)到177 mg和193 mg。

表3 不同質(zhì)量濃度黨參提取液對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)的影響

2.4 不同質(zhì)量濃度板藍(lán)根提取液對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)的影響與對(duì)照組相比，試驗(yàn)設(shè)計(jì)6個(gè)處理對(duì)羊肚菌菌絲體的生長(zhǎng)速度及生物量累積均有不同程度抑制作用，且隨著濃度不斷增加，抑制效果越明顯，所以重新選取5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL的板藍(lán)根提取液進(jìn)行適宜質(zhì)量濃度篩選試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，選較低質(zhì)量濃度的板藍(lán)根提取液對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，與對(duì)照相比，各處理組的菌絲體生長(zhǎng)速度相對(duì)要慢，而菌絲體生長(zhǎng)密度，在提取液濃度低于15 mg/mL時(shí)有所增加。板藍(lán)根提取物添加質(zhì)量濃度為5 mg/mL和10 mg/mL時(shí)效果相對(duì)較好，菌落干重分別達(dá)到121 mg和135 mg。

表4 不同濃度板藍(lán)根提取液對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)的影響

表5 不同中藥提取液對(duì)羊肚菌液體培養(yǎng)菌絲體生長(zhǎng)的影響

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分別選取上述篩選出的各中藥提取液最佳添加量進(jìn)行液體培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，與對(duì)照相比，添加4種甘肅特色中藥提取液后，羊肚菌液體培養(yǎng)所需天數(shù)（培養(yǎng)液清澈計(jì)天數(shù)）有所增加，但生物量積累大幅度提高，其中當(dāng)歸的效果最佳，當(dāng)添加質(zhì)量濃度為125 mg/mL時(shí)，羊肚菌菌絲生物量相比對(duì)照組增加110%，達(dá)到1.03 g/mL；其次是黨參和甘草，當(dāng)添加質(zhì)量濃度分別為125 mg/mL時(shí)，生物量分別增加69.4%和57.1%，達(dá)到0.83 g/mL和0.77 g/mL；板藍(lán)根效果相對(duì)較差，當(dāng)添加質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，生物量增加32.7%，達(dá)到0.65 g/mL。

3 小結(jié)與討論

4種供試中藥提取液對(duì)羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)速度有不同程度抑制作用，但對(duì)羊肚菌菌絲體生物量的積累有明顯的促進(jìn)作用，其中當(dāng)歸效果最明顯，添加質(zhì)量濃度為125 mg/mL時(shí)，羊肚菌液體培養(yǎng)生物量積累最佳。

以深層培養(yǎng)的發(fā)酵液和菌絲為主要原料提取羊肚菌胞外、胞內(nèi)多糖是羊肚菌多糖的重要來(lái)源之一[9]，羊肚菌發(fā)酵液中菌絲體生物量與胞外多糖產(chǎn)量呈正相關(guān)[10]。試驗(yàn)為甘肅特色中藥在羊肚菌多糖生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。