尹麗穎，李鳳金，仲麗麗，敖鵬，張妍妍，邊曉燕，唐丹麗

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遼東楤木葉總皂苷對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡的影響

尹麗穎1，李鳳金1，仲麗麗1，敖鵬1，張妍妍1，邊曉燕1，唐丹麗2

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700

目的 探討遼東楤木葉總皂苷（ETS）誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡及其對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法 MTT法檢測(cè)不同濃度（6.25、12.5、25、50、100、200 mg/kg）ETS培養(yǎng)的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖率，Hoechst33258染色和激光共聚焦成像檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，免疫組化檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果 ETS可誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞發(fā)生凋亡，且凋亡作用在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性；ETS可使HT-29細(xì)胞Bcl-2表達(dá)降低、Bax表達(dá)升高（＜0.05，＜0.01），且呈明顯的量效關(guān)系。結(jié)論 ETS可誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡，其凋亡機(jī)制可能與降低Bcl-2、升高Bax的表達(dá)相關(guān)。

遼東楤木葉總皂苷；HT-29細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；Bcl-2；Bax

隨著我國(guó)人民生活水平的提高，全民的膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生了重大改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率也隨之升高[1]。目前除傳統(tǒng)手術(shù)、放化療等手段外，中醫(yī)藥治療結(jié)腸癌越來越受到青睞。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，遼東楤木葉總皂苷（total saponine of Aralia Elata Seem leaves，ETS）具有良好的抗腫瘤作用，且對(duì)人結(jié)腸癌作用效果明顯，但其作用機(jī)制尚不十分明確[2]。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖率，通過Hoechst33258染色、激光共聚焦成像等方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，觀察ETS對(duì)凋亡細(xì)胞形態(tài)的影響，并用免疫組化檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)，探討ETS對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其可能的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物和細(xì)胞株

ETS由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室提供；人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.2 主要試劑與儀器

MTT（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)0793）；hyclone PRMI-1640培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司，批號(hào)AAJ206662）；胎牛血清（TBD，批號(hào)OW20150122-0256）；Hoechst33258熒光染液（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)20131105）；抗Bcl-2抗體（Sant Cruz，批號(hào)14H80415）；抗Bax抗體（Sant Cruz，批號(hào)14V70207）；S-P Kit試劑盒（福州邁新試劑公司，批號(hào)SA1052）。激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)ZEISS公司），CO2培養(yǎng)箱（HF90/HF240力新儀器上海有限公司），熒光顯微鏡（德國(guó)Leica），電熱恒溫水浴鍋（DK-S24，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），低速離心機(jī)（LDZ4-1.2，北京醫(yī)用離心機(jī)廠），MILLI-Q超純凈水純化系統(tǒng)（北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)HT-29細(xì)胞至80%～90%融合時(shí)，PBS沖洗后加入含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶1 mL消化，低速離心。棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，分裝后于5%CO2、37 ℃下培養(yǎng)備用。

2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞，調(diào)整濃度至1×105/mL，接種于96孔板上，每孔100 μL懸液，每組6個(gè)復(fù)孔，5%CO2、37 ℃孵育24 h，隨后依次加入不同濃度的ETS加藥培養(yǎng)基（6.25、12.5、25、50、100、200 mg/kg），對(duì)照組加入等體積空白培養(yǎng)基。48 h后棄培養(yǎng)基，加入MTT溶液，5%CO2、37 ℃孵育4 h，加入DMSO溶液，37 ℃溶解10 min，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度（OD），計(jì)算細(xì)胞抑制率[（1－受試藥組平均OD值÷對(duì)照組平均OD值）×100%]。

2.3 細(xì)胞核染色

按“2.1”項(xiàng)方法培養(yǎng)細(xì)胞。于6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，培養(yǎng)24 h后給藥組加入含不同濃度（10、20、40 mg/kg）ETS的1640培養(yǎng)基2 mL，對(duì)照組加入等體積1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，4%多聚甲醛0.5 mL固定10 min，PBS沖洗2次，加入Hoechst33258染色液，5 min后PBS沖洗2次，自然晾干，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

按“2.3”項(xiàng)下方法培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，PBS沖洗2次×2 min，加入200 μL Binding Buffer，再加入10 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI，室溫避光染色15 min，最后加入300 μL Binding Buffer，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)。

2.5 Bcl-2、Bax表達(dá)檢測(cè)

按“2.3”項(xiàng)下方法培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，PBS沖洗2次×2 min，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗3次×3 min，加入PBS配制新鮮的3%H2O2，室溫孵育10 min滅活內(nèi)源酶后，PBS沖洗3次×3 min，隨后加入正常山羊血清封閉液，室溫20 min。沖洗后加入抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體及抗GAPDH抗體（1∶200稀釋），4 ℃過夜，PBS沖洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢。高清晰圖文分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行分析，以核膜或胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性區(qū)域，隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野計(jì)算陽性細(xì)胞率。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±表示，組間比較采用單因素方差分析。＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 遼東楤木葉總皂苷對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的影響

不同濃度ETS對(duì)HT-29細(xì)胞有不同程度的增殖抑制作用，并呈劑量依賴性。50、100、200 mg/kg ETS組較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。見表1。

表1 各組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖抑制率比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*＜0.05，**＜0.01（下同）

4.2 Hoechst33258染色細(xì)胞核結(jié)果

與對(duì)照組細(xì)胞核均勻淡藍(lán)色比較，經(jīng)ETS處理后，HT-29細(xì)胞核呈亮藍(lán)色濃染，說明細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生了固縮，致使細(xì)胞核與Hoechst33258的結(jié)合能力增強(qiáng)，且隨濃度的增加，亮藍(lán)染色的比例增加。結(jié)果見圖1。

對(duì)照組10 mg/kg ETS組 20 mg/kg ETS組40 mg/kg ETS組

4.3 AnnexinV-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡結(jié)果

對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，呈不規(guī)則三角形，無染色或僅有微弱的綠色熒光。經(jīng)ETS干預(yù)24 h后，各組均可見大量凋亡細(xì)胞，且隨濃度的增加，凋亡細(xì)胞比例升高。早期凋亡的細(xì)胞僅在細(xì)胞膜處呈綠色熒光，細(xì)胞核不著色；中、晚期凋亡的細(xì)胞則細(xì)胞膜處呈現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞核處呈現(xiàn)紅色熒光。結(jié)果見圖2。

對(duì)照組10 mg/kg ETS組 20 mg/kg ETS組40 mg/kg ETS組

4.4 遼東楤木葉總皂苷對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，各濃度ETS組可見Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低、Bax蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05，＜0.01），見表2。Bcl-2形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為胞膜及胞漿中棕黃色顆粒減少，見圖3；Bax形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為胞膜及胞漿中棕黃色顆粒增多，見圖4。

表2 各組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

對(duì)照組10 mg/kg ETS組 20 mg/kg ETS組40 mg/kg ETS組

圖3 各組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×400）

對(duì)照組10 mg/kg ETS組 20 mg/kg ETS組40 mg/kg ETS組

圖4 各組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×400）

5 討論

中藥遼東楤木具有補(bǔ)氣安神、強(qiáng)精滋腎、祛風(fēng)活血、除濕止痛的功效，可用于治療神經(jīng)衰弱、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝炎、糖尿病等腎氣不足之證[3]。現(xiàn)代藥理研究顯示，ETS具有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[4]，對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞作用尤為顯著[5]。但其是否與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)尚不明確，本研究通過檢測(cè)凋亡相關(guān)指標(biāo)進(jìn)一步探討其對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的作用機(jī)制。

細(xì)胞凋亡異常與許多疾病尤其是癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。近年來，運(yùn)用細(xì)胞凋亡手段研究中藥抗癌機(jī)制成為熱點(diǎn)[6-7]。Hoechst33258染色是通過對(duì)細(xì)胞核染色質(zhì)進(jìn)行染色對(duì)細(xì)胞核的形態(tài)進(jìn)行觀察。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)ETS干預(yù)的細(xì)胞出現(xiàn)不同程度致密濃染顆粒且在一定范圍內(nèi)與濃度呈正相關(guān)，表明ETS具有誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡的作用。

AnnexinV-FITC/PI雙染法是區(qū)分凋亡早期及中晚期細(xì)胞的有效方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度ETS對(duì)HT-29細(xì)胞均可產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡的作用，且隨濃度的增加中晚期凋亡細(xì)胞增加。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞的過度增殖、正常凋亡受到抑制兩個(gè)因素相關(guān)。因此，研究凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)成為研究抗腫瘤藥物作用機(jī)制的重要途徑之一[8]。Bcl-2是目前發(fā)現(xiàn)最重要的抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的基因，而Bax作為Bcl-2家族的一員，具有Bcl促細(xì)胞凋亡功能，Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度ETS能影響HT-29細(xì)胞Bcl-2和Bax的表達(dá)，其中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降，而Bax蛋白表達(dá)顯著上升。

綜上，本研究結(jié)果表明，ETS具有誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的作用，其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)相關(guān)。

[1] 伍雯,秦環(huán)龍.膳食結(jié)構(gòu)改變與結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性的研究進(jìn)展[J].腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng),2014,21(1)：55-59.

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Effects of ETS on Apoptosis of Human Colorectal Cancer HT-29 Cells

YIN Li-ying1, LI Feng-jin1, ZHONG Li-li1, AO Peng1, ZHANG Yan-yan1, BIAN Xiao-yan1, TANG Dan-li2

Objective To study the apoptosis of human colorectal cancer HT-29 cells induced by Aralia elata Seem leaf total saponin (ETS) and its effects on the expression of relevant proteins. Methods MTT assay was used to detect the proliferation of human colorectal cancer HT-29 cells cultivated with different concentrations (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 mg/kg) of ETS. Hoechst33258 staining and laser confocal imaging were used to detect the apoptotic cells. Morphological changes were observed. The expressions of Bcl-2 and Bax were detected by immuno- histochemistry. Results ETS could induce apoptosis of HT-29 cells and apoptosis was in a dose-dependent manner in a certain range. ETS could decrease the expression of Bcl-2 and increase the expression of Bax in HT-29 cells (<0.05,<0.01), showing a significant dose-effect relationship. Conclusion ETS can induce the apoptosis of HT-29 cells, and the mechanism may be related to reducing the expression of Bcl-2 and increasing the expression of Bax.

Aralia elata Seem leaf total saponin; HT-29 cells; cell apoptosis; Bcl-2; Bax

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.012

R285.5

A

1005-5304(2017)06-0049-04

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（051226）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金項(xiàng)目（201218）；哈爾濱市科技局項(xiàng)目（404S223）

唐丹麗，E-mail：tangdanli@hotmail.com

（2016-06-21）

（修回日期：2016-07-29；編輯：華強(qiáng)）