施 楊,郭法利,劉海泉

1.上海市食品研究所,上海 200235

2.上海海洋大學 食品學院,上海 201306

3.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306

4.農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海 201306

5.上海海洋大學 食品熱加工工程技術研究中心,上海 201306

紫花地丁提取物對三文魚中副溶血性弧菌的抑制作用

施 楊1,郭法利1,劉海泉2,3,4,5*

1.上海市食品研究所,上海 200235

2.上海海洋大學 食品學院,上海 201306

3.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306

4.農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海 201306

5.上海海洋大學 食品熱加工工程技術研究中心,上海 201306

為了獲得具有抑菌活性的天然活性物質并應用于食品中，本文以紫花地丁為原料，通過設定乙醇濃度、提取溫度、提取時間等不同條件開展L16(43)正交實驗，分析比較了在這三個不同條件下處理的16種提取物對純培養(yǎng)副溶血性弧菌和接種到三文魚時的抑菌效果。結果表明：在40℃下采用75%的乙醇溶液作為提取劑、超聲波超聲處理20 min為最優(yōu)提取條件，由此得到的提取物對三文魚中副溶血性弧菌的最小殺菌濃度(Minimum Bactericidal Concentration，MBC)和最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)分別為0.50 mg/g和6.25*10-2mg/g。因此，紫花地丁提取物具有在食品中應用的前景。

紫花地丁;提取條件;副溶血性弧菌;三文魚;抑菌

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是嗜鹽性革蘭氏陰性短桿菌，為弧菌科弧菌屬，廣泛分布于近海區(qū)域、鹽湖及水產品中[1]。1992～2001年副溶血性弧菌引起的食源性疾病居我國微生物食源性疾的首位，占到31.1%[2]，它可引起頭疼、腹瀉、發(fā)燒、腸胃炎，嚴重的甚至還會引起敗血癥危及生命。我國生食水產品的歷史悠久，素有“生吃螃蟹活吃蝦”說法，而導致了我國副溶血性弧菌占腹瀉發(fā)病人數(shù)遠高于美國等發(fā)達國家報道的比例[3]。因此，如何在保持生食水產品特有的風味和鮮度的同時更加保證生食水產品的安全是我們面臨的重要課題。

目前越來越多的研究者通過從傳統(tǒng)的香辛料或中草藥的獲得的天然活性物質來控制食品中的微生物[4-7]。紫花地丁(Viola yedoensis)又叫犁頭草、地丁草和紫地丁等，為堇菜科堇菜屬的生草本植物。它作為我國傳統(tǒng)中藥之一，具有抗菌消炎，清熱解毒，涼血消腫等作用，臨床應用價值較高。目前對紫花地丁的研究大多集中于抗腫瘤、抗炎癥及抗病毒的應用上[8-10]，而在食品上作為保鮮劑研究卻鮮有報道。本研究通過分析紫花地丁天然抑菌活性物質的提取工藝，進行了紫花地丁提取物對副溶血性弧菌的抑菌效果和模擬生食三文魚中抑菌效果的研究，為紫花地丁提取物作為天然活性物質在食品安全中的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料和主要試劑 紫花地丁從市場購買，在25℃下黑暗中保存。稱取100 g，用自來水沖洗兩次，然后在50℃通風烘箱里干燥24 h。用粉碎機粉碎為細粉，過60目篩子后得到最佳顆粒大小，置干燥袋中4℃保存。測試菌株有副溶血性弧菌ATCC33846和ATCC33847均購自于美國ATCC菌種保藏中心，副溶血性弧菌野生菌株P201分離于患病病人。胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）、胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）、TCBS購于北京陸橋技術有限責任公司，北京，水乙醇購于國藥集團化學試劑有限公司，上海。

1.1.2 主要儀器 8010 s粉碎機(Waring Commerial，美國)，PL2002電子天平(Mettler Toledo，瑞士)，SK5200HP超聲波清洗機(上海科導超聲波儀器有限公司)，SENCO GG17旋轉蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)，QB9006微孔板快速振蕩器(金壇市醫(yī)療儀器廠)，379996孔板（Corning Incorporated）。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取 取5 g粉碎的紫花地丁加入含有125 mL不同濃度乙醇（W/V）的250 mL錐形瓶中，使用聚丙烯蓋密封，并在一定溫度下180 rpm搖床上浸泡一定時間；然后用超聲波清洗機提取。將提取物在3500 g下離心10 min，上清通過0.45 μm的真空過濾紙（Whatman no.1）過濾。最后過濾液在室溫下使用真空旋轉蒸發(fā)器在30 mmHg下蒸發(fā)得到乙醇粗提取物。最后加入無菌Milli-Q水，最終提取物濃度為100 mg/mL。樣品存放在一個密閉的無菌小瓶中，并儲存在4℃。

1.2.2 超聲波法提取紫花地丁有效成分正交試驗 針對乙醇濃度、提取溫度、提取時間進行三因素四水平正交試驗，按正交表L16(43)研究，每個因子4個水平，每個處理3次重復，具體見表1，根據(jù)提取物抑菌能力的大小，最終確定最優(yōu)提取工藝。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Design of orthogonal experiment

1.2.3 副溶血性弧菌培養(yǎng)及菌懸液制備 取保存在-80℃甘油管中的菌種，接種于8 mL 3%NaCl的TSB培養(yǎng)基在37℃、180 rpm搖床中培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)后的菌液0.1 mL轉移到8 mL 3%NaCl的TSB中37℃、180 rpm搖床中培養(yǎng)，再次活化。最后接種到TCBS瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種到8 mL3%NaCl的TSB,37℃、180 rpm搖床中培養(yǎng)8 h，到OD600=0.8，然后3個菌株各取3 mL等量混合得9 mL混合菌懸液，將混合菌懸液在4℃下以8000 g離心3 min，棄上清液，將沉淀懸浮在9 mL生理鹽水，混勻，獲得1 mL菌液含菌量約為108CFU/mL的等量混合菌懸液備用。

1.2.4 提取物對副溶血性弧菌抑制實驗 16種方法獲得的提取物根據(jù)Rattanachaikunsopon等的方法并進行了一些修改[11]。先把0.1 mL 108CFU/mL的細菌涂布于直徑9 cm的3%TSA平板，放置15 min。直徑為6 mm的3個Whatman’s No.1無菌濾紙放到接種后的瓊脂平板表面，以測定抗菌活性。每個無菌紙片在放置到平板前，先在50 mL（粗提取物濃度為100 mg/mL）的粗提物內浸漬。使用無菌Milli-Q水作為對照。在37℃下培養(yǎng)24 h，然后檢查抑菌圈的大小。抑菌圈測量，除去6 mm紙片后的抑菌直徑。重復3次。

1.2.5 提取物在三文魚中的MBC和MIC分析 從超市中購買大塊三文魚，在超凈工作臺中無菌切除掉約1.5 cm表面魚肉，然后每塊分割為25 g，按照Yang等方法[12]處理魚肉為無菌魚肉。菌懸液稀釋為約5*104CFU/mL。取10 mL最優(yōu)條件下提取原始濃度為100 mg/mL的提取物，使用無菌ddH2O進行2倍稀釋，得到濃度為50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195、0.097、0.048、0.024 mg/mL的提取物，分別取3 mL的提取物和3 mL 5*104CFU/mL的測試菌株，混勻后立即取1 mL的混合液涂布到24 g無菌三文魚魚塊上。最終提取物的濃度分別為原來的2%，菌體的初始濃度為103CFU/g。處理后的魚塊放在37℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，使用TCBS培養(yǎng)基測定抑菌效果。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)均采用三次平行實驗的平均值，數(shù)據(jù)用Excel軟件處理，數(shù)據(jù)間的差異通過統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行單因變量多因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同提取條件下紫花地丁提取物抑菌正交試驗結果

2.1.1 16種紫花地丁提取物抑菌效果 根據(jù)乙醇濃度、提取溫度、提取時間等三因素進行的四水平上的試驗，按正交表L16(43)研究，進行了16種不同條件的提取方法，獲得的提取物對副溶血性弧菌的抑菌效果如表2所示。在紫花地丁提取物濃度為100 mg/mL時，A4B3C2處理組合方法獲得的提取物對副溶血性弧菌抑菌能力最強，并與其它組合提取方法獲得的提取物對副溶血性弧菌抑菌能力具有顯著差異；而A2B2C3處理組合和A4B4C3處理組合獲得的提取物對副溶血性弧菌抑菌能力相對最弱，這兩處理組合間沒有顯著差異。理論上綜合因素K值結果，最優(yōu)條件提取條件為A4B3C1，結合R值分析影響紫花地丁提取物抑菌效果提取的影響因素排序為：B＞C＞A，即提取超聲波處理時間＞提取溫度＞提取時乙醇質量分數(shù)。

表2 16種提取方法獲得的紫花地丁提取物抑菌能力Table 2 The antibacterial ability of Viola yedoensis extracted with 16 methods

2.1.2 紫花地丁提取物抑菌效果受不同因素影響的比較 以提取物抑菌能力作為因變量，采用SPSS 19.0對紫花地丁提取物濃度為100 mg/mL的副溶血性弧菌抑菌能力結果進行單因變量多因素方差分析，同時使用F檢驗對比結果三次重復，分析表明重復間差異不顯著。從表3可以看出，A因素（乙醇質量分數(shù)）、B因素（超聲波超聲時間）和C因素（提取溫度）間，其顯著性分析表明p值分別為0.903、0.121和0.158，這表明不同的乙醇質量分數(shù)、超聲波超聲時間和提取溫度間單獨對紫花地丁提取物抑菌效果影響不大，但組合后的提取效果卻有顯著差異，這些因素間具有柵欄效應。

表3 提取物抑菌能力的方差分析Table 3 Variance analysis on the bacteriostatic ability

2.1.3 最優(yōu)提取條件的獲得 本研究以對純培養(yǎng)條件下副溶血性弧菌的抑菌效果為評價指標，均值越高則表明抑菌效果越好。結合提取物抑菌能力和方差分析表明，各因素內的因子間的抑菌能力沒有顯著性差異，但由于因素間的因子存在柵欄效應，因此最優(yōu)提取條件組合為A4B3C2，即采用質量分數(shù)75%的乙醇溶液作為提取劑、在超聲波超聲處理20 min、通過提取溫度為40℃所得到的紫花地丁提取物對副溶血性弧菌抑菌效果最佳。

2.2 接種到三文魚中的抑菌效果

經(jīng)無菌處理后的三文魚接種上濃度為103CFU/g的副溶血性弧菌后，使用最優(yōu)提取條件A4B3C2組合獲得紫花地丁提取物處理后，紫花地丁提取物在模擬三文魚上的MBC和MIC濃度分別為0.50 mg/g和6.25*10-2mg/g。將濃度為0.50 mg/g和6.25*10-2mg/g的紫花地丁提取物處理含103CFU/g副溶血性弧菌的三文魚，放置在10℃下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，每12 h涂布以觀察紫花地丁提取物在MBC和MIC濃度下對副溶血性弧菌抑菌穩(wěn)定性。通過表4可以發(fā)現(xiàn)，紫花地丁提取物表現(xiàn)出較好的抑菌能力和效果，副溶血性弧菌濃度為103CFU/g時，紫花地丁提取物在MIC濃度下，放置在10℃下能夠在48 h內抑制細菌生長；紫花地丁提取物在MBC濃度下，放置在10℃下能夠在108 h內維持殺滅抑菌能力；結合三文魚銷售時狀態(tài)，選擇紫花地丁提取物MIC濃度（6.25*10-2mg/g）使用。因此，紫花地丁提取物在水產品上具有較好的抑菌效果和保鮮能力。

表4 紫花地丁提取物在MBC和MIC濃度下抑菌能力穩(wěn)定性分析Table 4 Stability analysis on the antibacterial ability of extracts from Viola yedoensis at the concentrations of MBC and MIC

3 討論

隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的發(fā)展，具有良好抑菌和保鮮效果的食品添加劑越來越多，但大部分添加劑為化學合成。雖然我國已經(jīng)制定了很嚴格的食品添加劑使用衛(wèi)生標準，但是由于食品從業(yè)者以及加工企業(yè)的食品安全水平相差很大，同時消費者也愈發(fā)擔心化學合成添加劑的安全問題，因此，從天然物質中尋找具有良好抑菌能力和保鮮效果的防腐劑是替代目前化學合成添加劑的一種有效方法。

紫花地丁是我國傳統(tǒng)中藥之一，具有悠久的民間用藥歷史，臨床應用價值很高，早在1977年就被《中國藥典》收錄并廣泛使用至今[9]。體內外實驗研究表明，紫花地丁的粗提物具有廣泛的藥理作用，尤其是在抗炎、抑菌、抗病毒和抗腫瘤方面效果顯著。目前關于紫花地丁提取物抑菌作用的研究報道較多，主要集中在臨床上對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌和沙門氏菌等細菌的研究上[13-15]。本研究首次將紫花地丁提取物應用于食品保鮮研究中，以期通過合理的提取工藝獲得具有較強抑菌活性的天然活性物質，用于食品尤其水產品的保鮮和病原菌的防控。

紫花地丁的活性成分中含黃酮類、香豆素類、有機酸、酚類、生物堿、多糖、氨基酸、多肽、植物甾醇等多種有效成分，其中黃酮和香豆素類化合物是紫花地丁藥材中重要的活性成分，同時富含銅(Cu)、鐵(Fe)、鋅(Zn)、錳(Mn)、鎂(Mg)和鈣(Ga)等微量元素[9]，表現(xiàn)出較好的抑菌的能力[16,17]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，不同提取條件下獲得的粗提物對副溶血性弧菌的抑菌能力有顯著差異，這可能與通過不同提取方法獲得的粗提物中活性物質的成分有較大差異有關[18-20]。副溶血性弧菌作為一種食源性致病菌，尤其它通過水產品引發(fā)的食品安全事件越來越嚴重[2,3]。本研究通過接種濃度為103CFU/g的副溶血性弧菌來模擬生食三文魚中副溶血性弧菌的污染，經(jīng)紫花地丁提取物處理后，得到最優(yōu)的MBC和M IC濃度分別為0.50 mg/g和6.25*10-2mg/g。研究表明能夠從紫花地丁中獲得應用于食品工業(yè)中具有較強抑菌能力活性物質。本研究為進一步研究紫花地丁提取物在食品中的應用以及對副溶血性弧菌的抑菌機理研究提供了依據(jù)。

4 結論

首次將紫花地丁提取物應用于水產品的保鮮和病原菌的防控的研究。通過探討乙醇濃度、提取溫度、提取時間等不同條件下處理的16種提取物對純培養(yǎng)副溶血性弧菌和接種到三文魚的抑菌效果，確定了在40℃下采用75%的乙醇溶液作為提取劑、超聲波超聲處理20 m in為最優(yōu)提取條件，由此得到的提取物對三文魚中副溶血性弧菌的最小殺菌濃度（MBC)和最小抑菌濃度(M IC)分別為0.50 mg/g和6.25*10-2mg/g，建議選擇6.25*10-2mg/g濃度（M IC濃度）紫花地丁提取物來控制三文魚中的副溶血性弧菌。

[1]NelapatiS,NelapatiK,Chinnam BK.Vibrio parahaemolyticus-anemerging food borne pathogen[J].Vet World,2012,5(1):48-63

[2]劉秀梅,陳 艷,王曉英,等.1992-2001年食源性疾病暴發(fā)資料分析-國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)[J].衛(wèi)生研究,2004,23(6):725-727

[3]劉海泉,劉冰宣,李澤嫻,等.上海市生食三文魚中副溶血性弧菌污染的風險分析[J].食品科學,2015,36(24):195-199

[4]盧惠妮,潘迎捷,趙 勇,等.十八種辛香料對五種食源性致病菌的抑菌研究[J].天然產物研究與開發(fā),2010,22(5):883-889

[5]盧惠妮,潘迎捷,孫曉紅,等.棘托竹蓀子實體抑菌活性的研究[J].食品科學,2009,30(15):120-123

[6]張懷珠,徐曉霞,馮曉群,等.中草藥防腐劑在冷卻牛肉中的保鮮應用研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32(9):152-155

[7]孫樹杰,王士奎,李文香,等.中草藥提取液對鮮切西蘭花保鮮效果的影響[J].食品科學,2012,33(6):283-287

[8]張智偉,蔡 琨,于紅紅,等.紫花地丁含藥血清對巨噬細胞炎癥因子分泌的影響[J].免疫學雜志,2014,30(1):53-56

[9]李永生,何希瑞,楊 燕,等.紫花地丁化學成分與藥理活性研究新進展[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2013,6(4):313-318

[10]李艷麗,胡彥武.紫花地丁抗炎作用及機制研究[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(24):244-247

[11]Rattanachaikunsopon P,Phumkhachorn P.Antimicrobial activity of basil(Ocimum basilicum)oil against Salmonella enteritidis in vitro and in food[J].Bioscience,biotechnology,and biochem istry,2010,74(6):1200-1204

[12]Yang ZQ,Jiao XA,Li P,et al.Predictive model of Vibrio parahaemolyticus growth and survival on salmon meat as a function of temperature[J].Food microbiology,2009,26(6):606-614

[13]康懷興.紫花地丁的抗菌活性分析[J].中國民族民間醫(yī)藥,2012,21(14):51-52

[14]孫藝方,杜利利,周 樂,等.紫花地丁抗菌活性成分研究[J].中國中藥雜志,2011,36(19):2666-2671

[15]李定剛,張武崗,宋毓民,等.紫花地丁抗菌活性成分研究[J].西北農林科技大學學報:自然科學版,2006,34(4):87-90

[16]彭練慈,殷中瓊,賈仁勇,等.20味中藥提取物對無乳鏈球菌的體外抑菌活性研究[J].華南農業(yè)大學學報,2014,35(4):22-25

[17]代如意,李 莉,殷中瓊,等.5味中藥對雞白痢沙門氏菌的體外聯(lián)合抑菌研究[J].西北農林科技大學學報:自然科學版,2015,43(2):34-37,43

[18]范曉良,顏繼忠,張 純,等.響應面法優(yōu)化CO2超臨界萃取紫花地丁總黃酮的工藝研究[J].中國現(xiàn)代應用藥學,2014,31(2):172-178

[19]陳蔚燕.紫花地丁不同方式提取物抑菌效果研究[J].現(xiàn)代農藥,2014,13(5):38-40

[20]王俊杰,劉 弘,張玲昂,等.紫花地丁不同產地及不同部位中秦皮乙素含量比較[J].中國藥師,2015,18(8):1400-1402

The Bacteriostasis of Extracts from Viola yedoensis against Vibrio parahaemolyticus in Salmon

SHI Yang1,GUO Fa-li1,LIU Hai-quan2,3,4,5*
1.Shanghai Food Research Institute,Shanghai 201306,China
2.College of Food Science and Technology/Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China
3.Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation,Shanghai 201306,China
4.Laboratory of Quality&Safety Risk Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation(Shanghai),Ministry of Agriculture,Shanghai 201306,China
5.Engineering Research Center of Food Thermal-processing Technology,Shanghai Ocean University/Shanghai 201306,China

In order to obtain the natural active substances with antibacterial activity that can be used in food,the bacteriostasis against Vibrio parahaemolyticus and extracts from salmon were studied.The extracts of Viola yedoensis were examined by L16(43)orthogonal design with the use of combinations of ethanol concentration,ultrasound time and ultrasound temperature levels.The optimal extraction conditions were 75%(w/w)ethanol and ultrasound 20 min at 40℃.With this extraction condition,the MBC(Minimum Bactericidal Concentration)and MIC(Minimum Inhibitory Concentration)of the extract for V.parahaemolyticus inoculated with salmon were 0.50 mg/g and 6.25*10-2mg/g,respectively.The extracts could be provided a prospect for a application in in food.

Viola yedoensis;extraction condition;Vibrio parahaemolyticus;salmon;bacteriostasis

TS202.1

:A

:1000-2324(2017)02-0161-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2017.02.001

2016-04-05

:2016-06-16

國家自然科學基金面上項目(31671779);上海市自然科學基金項目(15ZR1420600);上海海洋大學博士科研啟動資金(A2-0203-17-100316)

施 楊(1988-),男,大學本科,助理工程師,研究方向:食品微生物檢測.E-mail:602483415@qq.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:hqliu@shou.edu.cn