閘雯俊++李三和++周雷++劉+凱++徐華山++陳志軍++楊國(guó)才++劉凱++李培德++游艾青

摘要 RNAi能夠抑制基因特異序列的表達(dá)，為昆蟲(chóng)學(xué)研究提供了新方法，尤其是可以分析基因的功能，控制害蟲(chóng)種群以及減少疾病病原體的感染。不同種群、RNAi攝入方式、靶標(biāo)基因都會(huì)影響RNAi的效率，是轉(zhuǎn)錄本抑制程度存在差異的原因所在。對(duì)于不能穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因的物種，如昆蟲(chóng)，利用dsRNA介導(dǎo)的 RNAi技術(shù)便成為快速分析基因功能的重要手段。介紹了RNAi技術(shù)的作用機(jī)制，并從控制害蟲(chóng)和保護(hù)益蟲(chóng)方面總結(jié)了RNAi技術(shù)的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞 RNAi；害蟲(chóng)控制；dsRNA；機(jī)制；應(yīng)用

中圖分類(lèi)號(hào) S433；Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）07-0144-02

RNA干擾已經(jīng)徹底改變了昆蟲(chóng)學(xué)的研究范圍，使研究者能夠通過(guò)抑制目的基因的表達(dá)，將改變的表型和基因功能聯(lián)系起來(lái)。對(duì)于基礎(chǔ)研究而言，RNAi（又稱(chēng)基因沉默）為所有的昆蟲(chóng)基因組學(xué)研究提供了一條路徑，同時(shí)對(duì)應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)也有巨大的潛在作用。例如，RNAi能夠通過(guò)抑制關(guān)鍵基因提高死亡率控制害蟲(chóng)。此外，利用無(wú)害的病毒序列啟動(dòng)抗病毒RNAi反應(yīng)，能夠有效防止益蟲(chóng)（如蜜蜂和家蠶） 感染高致病性病毒。

1 RNAi的機(jī)制

RNAi是利用非編碼小RNA分子切割靶標(biāo)mRNA抑制基因表達(dá)。主要分為以下3個(gè)階段。

1.1 起始階段

核糖核酸酶Ⅲ型家族的核酸酶Dicer，以 ATP 依賴(lài)的方式逐步切割加工導(dǎo)入生物體的外源或內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄生成的dsRNA，生成21～23nt的siRNA（small interfering RNA），其與靶標(biāo)mRNA具有高度特異性，為成功降解提供保證。

1.2 效應(yīng)階段

siRNA 雙鏈結(jié)合其他蛋白復(fù)合物形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex RISC），雙鏈siRNA解鏈，RISC介導(dǎo)單鏈反義siRNA通過(guò)堿基配對(duì)原則從siRNA引導(dǎo)鏈中心所對(duì)應(yīng)的靶基因位置切割靶mRNA，進(jìn)一步降解mRNA，同時(shí)還可以引發(fā)宿主細(xì)胞的一系列反應(yīng)。

1.3 放大效應(yīng)階段

siRNA在引導(dǎo)RISC切割靶RNA的同時(shí)，也在RNA聚合酶（RdRP）的作用下以mRNA為模板合成新的dsRNA。緊接著進(jìn)入第一步循環(huán)過(guò)程，生成大量次級(jí)siRNA，經(jīng)過(guò)逐級(jí)放大效應(yīng)，使mRNA徹底降解。

2 RNAi技術(shù)的應(yīng)用

利用RNAi技術(shù)控制害蟲(chóng)和保護(hù)馴化益蟲(chóng)（例如蜜蜂）已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。一般情況下，RNAi序列適用于任何形式，從單個(gè)基因型到家系，甚至昆蟲(chóng)所屬的目；因?yàn)槟繕?biāo)序列可以隨意操控。

2.1 利用RNAi控制害蟲(chóng)

利用RNAi控制害蟲(chóng)最早是應(yīng)用于玉米根蟲(chóng)和棉鈴蟲(chóng)。研究者喂養(yǎng)玉米根蟲(chóng)含有290條dsRNAs的人工飼料，發(fā)現(xiàn)14個(gè)基因會(huì)使成蟲(chóng)的生理活動(dòng)下降，并且對(duì)液泡ATP酶亞基A基因（V-ATPase）進(jìn)行了詳細(xì)的分析。人工飼料中只含有低濃度V-ATPase的dsRNAs，經(jīng)玉米根蟲(chóng)取食后，相應(yīng)的mRNA受到抑制。更重要的是，研究者將玉米根蟲(chóng)喂養(yǎng)在表達(dá)V-ATPase dsRNAs的轉(zhuǎn)基因玉米上后，發(fā)現(xiàn)根蟲(chóng)的V-ATPase基因表達(dá)量下降，玉米根部受損程度降低[1]。研究者發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲(chóng)有1個(gè)靶標(biāo)基因細(xì)胞色素P450（CYP6AE1），該基因在幼蟲(chóng)中腸中表達(dá)，對(duì)棉花的二級(jí)次生代謝產(chǎn)物棉子酚具有解毒功能[2]。當(dāng)將棉鈴蟲(chóng)喂養(yǎng)在表達(dá)CYP6AE14 dsR-NA的轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草上時(shí)，該基因在蟲(chóng)體中腸里的表達(dá)量下降，幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育減速[3]。同時(shí)在玉米根蟲(chóng)和棉鈴蟲(chóng)上也都有了新發(fā)現(xiàn)[4]。其中Snf7基因主要參與膜受體的運(yùn)輸，在玉米根蟲(chóng)中的效果非常顯著。同時(shí)在棉花中表達(dá)半胱氨酸蛋白酶，棉鈴蟲(chóng)取食后，蟲(chóng)體圍食膜功能減弱，變得更容易吸收dsRNA。更重要的是，棉花同時(shí)表達(dá)dsCYP6AE14和半胱氨酸蛋白酶比單一表達(dá)其中一個(gè)基因的抗性強(qiáng)[5]。

上述研究闡明利用RNAi控制害蟲(chóng)有2個(gè)關(guān)鍵因素：①用于RNAi靶標(biāo)基因序列的選擇；②傳遞dsRNA的方式。其中靶標(biāo)基因必須是昆蟲(chóng)的關(guān)鍵基因，同時(shí)在昆蟲(chóng)的整個(gè)生活史中要持續(xù)表達(dá)。隨著技術(shù)從理論證明到應(yīng)用的轉(zhuǎn)變，嚴(yán)苛設(shè)計(jì)靶標(biāo)序列是必須的。先決條件就是從dsRNA中獲得的21～25 bp siRNAs必須與序列保證完全的一致性，同時(shí)與昆蟲(chóng)的mRNA具有同源性，與非靶標(biāo)物種的所有siRNAs和編碼蛋白基因具有序列差異性。在網(wǎng)上將候選dsRNA同時(shí)與靶標(biāo)物種的目的基因及所有公共基因組中預(yù)測(cè)的編碼蛋白的基因進(jìn)行比對(duì)，杜絕不能與靶標(biāo)序列完全匹配以及與非靶標(biāo)物種序列匹配的siRNAs。

RNAi成功的第2個(gè)關(guān)鍵就是在有效劑量下傳遞放大RNAi信號(hào)。目前dsRNA合成方法已有重大突破，一次能夠合成1 kg左右，合成成本的持續(xù)下降將有利于dsRNA產(chǎn)品應(yīng)用于魚(yú)餌、生物農(nóng)藥噴霧以及灌溉系統(tǒng)中。利用植物介導(dǎo)的RNAi已經(jīng)廣泛應(yīng)用于控制咀嚼式昆蟲(chóng)（例如玉米根蟲(chóng)和棉鈴蟲(chóng)）和刺吸式昆蟲(chóng)。Bt抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因作物控制刺吸式昆蟲(chóng)的作用甚微，因?yàn)锽t類(lèi)毒素尚未對(duì)這些昆蟲(chóng)產(chǎn)生作用。由于生態(tài)釋放導(dǎo)致廣譜殺蟲(chóng)劑的使用逐漸減少，Bt作物上的害蟲(chóng)卻逐年增加。因此，利用植物介導(dǎo)的RNAi解決了這個(gè)難題，在褐飛虱和蚜蟲(chóng)中都得到了應(yīng)用。此方法可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)殺蟲(chóng)劑，例如可以作為城市害蟲(chóng)（螞蟻、蟑螂、白蟻）的殺蟲(chóng)餌劑；其商業(yè)潛力主要取決于dsRNA傳遞給靶標(biāo)昆蟲(chóng)的效率、dsRNA是否在昆蟲(chóng)體內(nèi)能穩(wěn)定存在、作為殺蟲(chóng)餌劑的濃度。上述因素均影響dsRNA的生產(chǎn)成本。因此，加強(qiáng)昆蟲(chóng)細(xì)胞吸收dsRNA和保證dsRNA在昆蟲(chóng)體內(nèi)不被dsRNases降解至關(guān)重要。

2.2 利用RNAi保護(hù)益蟲(chóng)

許多真核寄生蟲(chóng)對(duì)RNAi敏感，可以利用這一特點(diǎn)增強(qiáng)益蟲(chóng)的健康。當(dāng)然，這個(gè)策略不適用于細(xì)菌性病原體或某些真核生物（如錐和瘧原蟲(chóng)物種），因?yàn)槠淙狈NAi的能力。最經(jīng)典的例子就是蜜蜂的寄生蟲(chóng)疾病，此疾病會(huì)導(dǎo)致蜜蜂高發(fā)病率和高死亡率。蜜蜂的寄生蟲(chóng)具備應(yīng)用RNAi的2個(gè)要點(diǎn)：首先，其具有RNAi的分子機(jī)制；其次，中腸作為攝取dsRNA的場(chǎng)所，寄生蟲(chóng)能夠在蜜蜂中腸上繁殖。蜜蜂寄生蟲(chóng)的ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)子對(duì)于能量代謝是至關(guān)重要的，當(dāng)感染疾病的蜜蜂取食了含有寄生蟲(chóng)的ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)子的dsRNA后，寄生蟲(chóng)的靶標(biāo)基因表達(dá)量下降，蜜蜂的死亡率會(huì)隨之下降。

真核寄生蟲(chóng)除了能夠利用腸道作為傳遞RANi的場(chǎng)所，還可以利用昆蟲(chóng)器官傳遞系統(tǒng)性RNAi信號(hào)，已經(jīng)在以蜜蜂血液為食的寄生蟲(chóng)瓦螨中得到證實(shí)。當(dāng)蜜蜂取食了瓦螨特定基因的dsRNA之后，寄居在蜜蜂上的螨蟲(chóng)群體明顯減少，同時(shí)對(duì)蜜蜂沒(méi)有明顯的有害影響。隨后，研究者利用熒光蛋白的dsRNA（dsRNA-GFP）檢測(cè)蜜蜂體內(nèi)是否能夠進(jìn)行系統(tǒng)性RNAi。蜜蜂和寄生蟲(chóng)體內(nèi)均沒(méi)有綠色熒光蛋白基因，故可以利用GFP-RNA檢測(cè)干擾效果。當(dāng)感染寄生蟲(chóng)的蜜蜂取食含有dsRNA-GFP的蔗糖溶液后，寄生蟲(chóng)全身覆蓋GFP-RNA。除此而外，將這些寄生蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到?jīng)]有取食dsR-NA-GFP的蜜蜂上，蜜蜂體內(nèi)會(huì)含有GFP-RNA。說(shuō)明RNAi信號(hào)不僅可以在昆蟲(chóng)個(gè)體水平進(jìn)行傳播和放大，同時(shí)還可以在蜜蜂繁殖群體水平進(jìn)行傳播。下一步需要研究如何使RNAi的效率和劑量持續(xù)保護(hù)益蟲(chóng)群體，同時(shí)控制寄生蟲(chóng)的成本是否合理，以及對(duì)蜜蜂群體的健康是否有害都需要加以考慮。

可以利用RNAi抗病毒保護(hù)昆蟲(chóng)，同時(shí)也可以利用RNAi進(jìn)行抗病毒治療。利用RNAi介導(dǎo)來(lái)抑制昆蟲(chóng)感染病毒，同時(shí)還可以預(yù)防一些人類(lèi)、牲畜和農(nóng)作物嚴(yán)重病毒性疾病。外源提供和攝取的dsRNA可以提高宿主本身RNAi運(yùn)轉(zhuǎn)效率，保護(hù)宿主包括預(yù)防和直接治療。RNAi介導(dǎo)的抗病毒免疫有利于抑制蚊子的登革熱病毒、辛德畢斯病毒和西尼羅河病毒等。此外，加強(qiáng)RNAi通路能夠促進(jìn)病毒抑制，例如通過(guò)基因工程使昆蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)特定病毒序列的反向重復(fù)RNA，從而促發(fā)dsRNA生成。

蜜蜂是另一個(gè)遭病毒侵襲亟須被保護(hù)的昆蟲(chóng)，其中以色列急性麻痹病毒（IAPV）可能導(dǎo)致蜜蜂種群持續(xù)下降和群落消失的危險(xiǎn)?？茖W(xué)家通過(guò)體外合成IAPV基因組的dsRNA，感染IAPV的蜜蜂取食后，體內(nèi)的RNAi工廠機(jī)制可以消除IAPV。實(shí)驗(yàn)室和蜂場(chǎng)試驗(yàn)表明，在接種IAPV以前飼喂特異RNA的IAPV，與只接種IAPV比較，其幼蟲(chóng)孵化率和產(chǎn)蜜量均明顯較高。此結(jié)果在美國(guó)已經(jīng)進(jìn)行了大量的田間試驗(yàn)。2007年Beeologics公司成立了一個(gè)研究小組，開(kāi)始研制一種治療此病毒的制劑，研發(fā)出殺死IAPV的藥物Remebee，是利用核糖核酸干擾機(jī)制，阻止目的基因表達(dá)。Remebee是以RANi為基礎(chǔ)，理論上RANi生物制劑能促使RANi發(fā)生。

3 展望

近年對(duì)昆蟲(chóng)RNAi的研究展示了科學(xué)發(fā)現(xiàn)的偉大力量和其控制昆蟲(chóng)種群的潛力。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，RNAi已經(jīng)不再是靈丹妙藥，但卻提出了一系列的新概念，給昆蟲(chóng)學(xué)家提出了新的技術(shù)挑戰(zhàn)，沒(méi)有一種技術(shù)是適用于所有物種的。同時(shí)，RNAi信號(hào)是如何在單個(gè)細(xì)胞里放大和在昆蟲(chóng)細(xì)胞間傳播的也始終困擾著科學(xué)家。因此，昆蟲(chóng)RNAi如何運(yùn)轉(zhuǎn)的問(wèn)題仍需堅(jiān)持不懈的研究探索。

4 參考文獻(xiàn)

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