李 貞,張芳霞，馬雅玲

·論 著·

枸杞多糖對體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用

李 貞1，2,張芳霞1,2，馬雅玲3

目的 觀察枸杞多糖對體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用。方法 實驗分為正常對照組、H2O2組、H2O2+ LBP(40 mg/L)組。正常對照組：DMEM完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；H2O2組：含體積分數(shù)10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時加入200 μmol/L H2O2溶液造成氧化應(yīng)激損傷模型；H2O2+LBP(40 mg/L)組：用含10%FBS和200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時加入不同濃度的枸杞多糖(10 mg/L，20 mg/L，40 mg/L)進行干預(yù)，最終選用40 mg/L枸杞多糖進行保護。使用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法和AnnexinV-FITC法檢測細胞存活率及凋亡率。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，H2O2能夠降低RGC-5細胞活性，并呈濃度依賴性，200 μmol/L H2O2作用24 h后RGC-5細胞活性為正常對照組的50%,繼續(xù)加入不同濃度LBP (10 mg/L，20 mg/L，40 mg/L)干預(yù)后細胞存活率分別為52.5%、62.8% 和68.6%，與H2O2組相比較細胞存活率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。AnnexinV-FITC檢測結(jié)果顯示，正常對照組、H2O2組、H2O2+LBP(40 mg/L)組細胞凋亡率，分別為4.90%、32.35%、24.21%，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 枸杞多糖對RGC-5氧化應(yīng)激損傷有保護作用。

枸杞多糖；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞；細胞凋亡

青光眼是一類以特異性視神經(jīng)萎縮和視野缺損為特征的致盲眼病[1]，嚴重影響患者的健康和生活質(zhì)量。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)的進行性凋亡是青光眼最主要的病理生理學特征。保護視神經(jīng)，阻止視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡成為近年來的研究熱點。枸杞多糖(LBP)是寧夏特色植物枸杞的主要有效成分之一，有多種藥理學作用。RGC-5細胞是應(yīng)用Ψ2E1A病毒轉(zhuǎn)染出生后1 d大鼠RGC獲得的永生細胞株[2]，近年來廣泛用于RGCs的相關(guān)研究。本研究應(yīng)用外源性活性氧(H2O2)制作RGC-5凋亡模型，用LBP進行干預(yù)，進而研究LBP對RGC-5的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器:LBP(40%，寧夏啟元國藥有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，MTT(Sigma)，AnnexinⅤ-FITC /PI 凋亡檢測試劑盒(北京貝博公司)，水套式二氧化碳培養(yǎng)箱(HF160W)，酶標儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠RGC-5細胞的培養(yǎng):RGC-5細胞常規(guī)培養(yǎng)于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，隔日換液。顯微鏡下觀察細胞生長情況，每2～3 d用2.5 g/L胰蛋白酶消化并按1∶2～1∶4進行傳代。

1.2.2 H2O2誘導(dǎo)RGC-5氧化應(yīng)激損傷模型的建立:將正常對照組和4個濃度H2O2組(50、100、200、400 μmol/L)分別培養(yǎng)24 h后，應(yīng)用MTT法檢測各組細胞存活率。不同濃度H2O2組細胞存活率分別為正常對照組的91.3%、87.6%、49.7%、26.5%，200 μmol/L H2O2組細胞存活率約為對照組的50%。本研究選用200 μmol/L H2O2建立RGC-5氧化應(yīng)激損傷模型。

1.2.3 LBP對RGC-5氧化應(yīng)激損傷的影響

1.2.3.1 實驗分組:實驗分為3組，即：正常對照組，只加DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；H2O2組，除了DMEM高糖培養(yǎng)基外，加入濃度200 μmol/L H2O2溶液造成氧化應(yīng)激損傷模型；H2O2+LBP(40 mg/L)組，用濃度為200 μmol/L的H2O2溶液作用24 h后，繼續(xù)加入濃度為40 mg/L LBP培養(yǎng)24 h。

1.2.3.2 MTT法檢測細胞活性:取對數(shù)生長期的RGC-5，將RGC-5細胞按每孔1.0×104個細胞接種至96孔板內(nèi)，按照1.2.3.1中的方法進行干預(yù)，LBP(40 mg/L)作用24 h后每孔加入20 μl MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h；終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀用490 nm波長處測量各孔的吸光度(A)，實驗重復(fù)至少3 次。細胞存活率= 處理組A值/對照組A值。

1.2.3.3 Annexin V-FITC凋亡檢測:將RGC-5 按各組以每孔2.0×106個接種于6孔板中，按照1.2.3.1中的方法進行干預(yù)。培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)基，用冷PBS洗滌一次，用不含EDTA的胰酶消化，1 000 r/ min離心5 min；棄去上清，然后將細胞重懸于400 μl 1×Binding Buffer中，再加入10 μl Annexin V-FITC 4 ℃避光孵育15 min，加入5 μl PI于4 ℃避光孵育5 min。用流式細胞儀觀察LBP對RGC-5凋亡的影響。

2 結(jié)果

2.1 RGC-5細胞形態(tài)學觀察：將RGC-5細胞放于倒置相差顯微鏡下觀察可見細胞接種4 h后即可貼壁生長，貼壁培養(yǎng)的RGC-5細胞有較短的突起，邊緣清晰，細胞透亮、折光性好。顯微鏡下觀察呈單層生長，見圖1(目錄后)。

2.2 MTT檢測：分別用濃度為50、100、200、400 μmol/L的H2O2作用24 h，細胞存活率分別為91.33%、87.67%、49.68%、26.50%。200 μmol/L H2O2RGC-5細胞活性為對照組的50%，本實驗選擇此濃度H2O2建立視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞氧化應(yīng)激損傷模型。不同濃度LBP(10 mg/L、20 mg/L和40 mg/L)干預(yù)后，細胞存活率分別為52.5%、62.8%和68.6%，較H2O2組細胞活性明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本實驗采用40 mg/L LBP 進行保護，見表1。

表1 LBP對H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細胞活性的影響±s)

注：*與正常對照組比較，P<0.05；#與H2O2組比較，P<0.05；◆與10 mg/L LBP組比較，P<0.05；★與20 mg/L LBP組比較，P<0.05。

2.3 Annexin V-FITC 凋亡檢測：正常對照組細胞凋亡率為4.90%，200 μmol/L H2O2作用24 h，細胞凋亡率為32.35%，加入40 mg/L LBP干預(yù)后細胞凋亡率為24.21%，LBP組與H2O2組凋亡細胞所占比例差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2，圖2(目錄后)。

表2 LBP對H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細胞凋亡率的影響±s)

注：#與正常對照組比較，P<0.05；*與H2O2組比較，P<0.05。

3 討論

青光眼是世界范圍內(nèi)第二大致盲性眼病[3],以特異性視神經(jīng)萎縮和視野缺損為共同特征[4]。目前認為青光眼致視功能損害的共同病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡及其神經(jīng)纖維的喪失，從而導(dǎo)致不可逆性視神經(jīng)萎縮和視野改變[5]。因此阻止視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡，保護視神經(jīng)已成為近年來的研究熱點。已有研究表明，青光眼的發(fā)生與氧化應(yīng)激有關(guān)[6]。氧化應(yīng)激(OS)是指氧化程度超出氧化物的清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。Ishisaka[7]等的實驗表明，H2O2是一種細胞凋亡介質(zhì)，其誘導(dǎo)細胞凋亡的途徑就是引起機體氧化應(yīng)激，H2O2作為一種細胞凋亡介質(zhì)被廣泛用于各種氧化應(yīng)激損傷模型[8]。LBP是從寧夏特色植物枸杞中分離出的主要多糖之一。研究發(fā)現(xiàn)，LBP具有多種藥理學作用，在抗凋亡、抗氧化、延緩衰老[9]、加強免疫功能、降低血糖[10]、清除自由基[11]中發(fā)揮重要的作用。本研究采用H2O2誘導(dǎo)RGC-5氧化應(yīng)激損傷模型，應(yīng)用MTT及Annexin V-FITC檢測LBP對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用。MTT比色法是最為常見的一種用來檢測細胞活性的方法，其結(jié)果顯示，200 μmol/L H2O2作用24 h后細胞存活率為49.68%，與正常對照組相比，造成約50%的RGC-5凋亡；不同濃度LBP(10 mg/L、20 mg/L和40 mg/L)進行干預(yù)后細胞存活率分別為52.5%、62.8%和68.6%，較H2O2組細胞存活率明顯提高，并呈濃度依賴性，證明LBP能夠提高細胞存活率，從而對氧化應(yīng)激損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞起到保護作用。本實驗采用濃度為40 mg/L LBP來進行保護。AnnexinV/PI雙染法是目前最為常用的一種檢測細胞凋亡的方法,該方法具有靈敏度高、操作簡便易行等特點。在流式細胞分析圖中，正常細胞不能被AnnexinV及PI染色(AnnexinV-PI-)，位于圖的左下區(qū)Q3區(qū)(LL)；早期凋亡的細胞可被Annexin V染色而不被PI染色(Annexin V+PI-)，分布在圖的右下區(qū)Q4區(qū)(LR)；晚期凋亡細胞均能被Annexin V及PI染色(AnnexinV+PI+)，分布在圖的右上區(qū)Q2區(qū)(UR)。本實驗Annexin V-FITC 檢測結(jié)果顯示，H2O2組Q2和Q4區(qū)細胞明顯多于正常對照組，即早期凋亡和晚期凋亡細胞明顯增加，進一步證明H2O2誘導(dǎo)RGC-5細胞損傷為凋亡。40mg/L LBP進行干預(yù)后，細胞凋亡率為(24.21±4.56)%，與H2O2組的(32.35±5.17)%相比明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義。綜上所述，本實驗結(jié)果表明H2O2能夠誘導(dǎo)RGC-5細胞發(fā)生凋亡，LBP則可以抑制H2O2對RGC-5造成的損傷，減少細胞凋亡，從而發(fā)揮視網(wǎng)膜神經(jīng)保護作用。但是LBP能否作為一種臨床可用的預(yù)防視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的治療方法，還有待進一步研究。

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Effects of lycium barbarum polysaccharides therapy on oxidative stress-induced apoptosis of cultured retinal ganglion cells

LIZhen1，2,ZHANGFangxia1，2,MAYaling3.

1.NingxiaEyeHospital,NingxiaPeople’sHospital,Yinchuan750002,China;1.TheFirstClinicalMedicalCollegeofNorthwestUniversityforNationalities,Yinchuan750002,China;3.DepartmentofOphtalmology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

MAYaling,Email: myleye@163.com

Objective To investigate the neuroprotective effects of lycium barbarum polysaccharides (LBP) against oxidative stress-induced injury in cultured retinal ganglion cells.Methods Rat RGC line RGC-5 were cultured in vitro,and were randomly divided into the normal group,H2O2group and H2O2+LBP (40mg/L) group.Then apoptosis models were cultured a series concentration of LBP (10 mg/L,20 mg/L and 40 mg/L).Cell viability of the RGC-5 cell line was measured with MTT assay,flow cytometry was used to detect the apoptosis process.Results The results of MTT colorimetry showed that H2O2may induce cell death of RGC-5 cells in a concentration-dependent manner,exposure to 200 μmol/L H2O2clearly induced cell death in 50% of the cells within 24 hours,the survival ratio after exposure to 200μmol/L H2O2was lower than that in control cell.The survival ratio in LBP group (10 mg/L,20 mg/L,40 mg/L) were 52.5%,62.8% and 68.6%,respectively.There was statistical difference between 10 mg/L,20 mg/Land 40 mg/L group (P< 0.05).Flow cytometry showed apoptosis ratio of RGC-5 in control group,H2O2group and H2O2+LBP group were respectively 4.90%,32.35% and 24.21%，(P<0.05).Conclusion The study demonstrates that LBP can prevent RGC-5 from apoptosis.

Lyciumbarbarumpolysaccharides；Retinalganglioncells；Apoptosis

10.13621/j.1001-5949.2017.03.0193

寧夏自然科學基金資助項目(NZ13283)

1.寧夏人民醫(yī)院眼科醫(yī)院，寧夏 銀川 750002 2.西北民族大學第一附屬醫(yī)院，寧夏 銀川 750002 3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院眼科，寧夏 銀川 750004

李貞(1989-)，女，甘肅籍，碩士研究生，住院醫(yī)師，從事眼科專業(yè)工作。

馬雅玲，Email:myleye@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170313.0934.004.html

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2016-06-18 [責任編輯]王凱榮