劉秋偉,張會(huì)麗,李陽(yáng)杰,翟廣玉，2*

(1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，河南 鄭州 451150;2.鄭州大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，河南 鄭州 450052)

槲皮素鈣的合成及其生物活性研究

劉秋偉1,張會(huì)麗1,李陽(yáng)杰1,翟廣玉1，2*

(1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，河南 鄭州 451150;2.鄭州大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，河南 鄭州 450052)

合成了槲皮素鈣，觀察了其生物活性。將槲皮素與醋酸鈣在pH=8.5的條件下加熱回流6h，生成了槲皮素鈣。分析發(fā)現(xiàn)槲皮素鈣紫外光譜帶Ⅰ和帶Ⅱ比槲皮素分別紅移了28nm和8nm；槲皮素鈣的羰基振動(dòng)頻率υC=O為1647.52cm-1比槲皮素向紅移了15.58cm-1，在高場(chǎng)出現(xiàn)了新的吸收峰υM-O=640.64cm-1，說(shuō)明有金屬配位鍵生成；氫譜中槲皮素鈣的3-OH和3'-OH上的氫消失，7-OH，5-OH，4'-OH上的氫依然存在，這說(shuō)明槲皮素的3位羥基和4位羰基上的氧與鈣離子配位，3'和4'位羥基與鈣離子結(jié)合。用DPPH法測(cè)定了槲皮素鈣與槲皮素的EC50分別是8.17和14.07mg/L，說(shuō)明槲皮素鈣的清除自由基的能力沒(méi)有槲皮素強(qiáng)。

槲皮素；槲皮素鈣；合成；表征；自由基清除能力

前言

鈣是人體必需的營(yíng)養(yǎng)元素,它能調(diào)節(jié)人體各系統(tǒng)、組織、器官的正常生理功能,人體中每個(gè)細(xì)胞的活動(dòng),都受鈣的制約。骨骼是人體的支架,鈣是骨、牙齒的主要成分。骨、牙齒是人體的鈣庫(kù),它調(diào)節(jié)人體細(xì)胞外液的鈣離子濃度，并保持恒定。鈣離子是神經(jīng)和肌肉之間的介質(zhì),始終控制著肌肉的起動(dòng)、舒張過(guò)程。鈣離子通過(guò)改變胞漿內(nèi)濃度而直接參與神經(jīng)末梢的傳導(dǎo)過(guò)程,神經(jīng)介質(zhì)的釋放、正常肌力的維持都需要鈣離子的參加。很多參與細(xì)胞代謝的酶活性都需要鈣離子激活，如三磷酸腺苷酶、脂肪酶、淀粉酶、腺苷酸環(huán)化酶、磷酸二脂酶、色安酸羥化酶等。鈣離子在機(jī)體凝血過(guò)程中起著重要作用，機(jī)體缺鈣時(shí)可能出現(xiàn)出血不止或凝血過(guò)度、血液黏稠度過(guò)高的癥狀[1，2]。

槲皮素廣泛存在于水果（蘋(píng)果、草莓）、蔬菜（洋蔥、蕃茄）、飲料（茶葉、咖啡、紅酒）中[3]，它顯示出多方面的生物活性，是天然的抗氧化劑，特別是具有清除體內(nèi)自由基的性能，保護(hù)細(xì)胞氧化造成的損傷，能夠調(diào)整細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞的存活，還具有抗癌、抗炎、抗病毒、降血壓，改善肥胖[4～9]等作用。

槲皮素對(duì)金屬離子具有強(qiáng)烈的螯合作用，可生成穩(wěn)定的環(huán)狀化合物。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素與不同金屬離子形成配合物，其生物活性得到了不同程度的改進(jìn)[10]。Ferrer等[11]合成了槲皮素釩配合物，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素釩可以刺激I型骨生長(zhǎng)，對(duì)磷酸酯酶有抑制作用，它可促進(jìn)骨細(xì)胞的分裂、增殖，具有抗骨癌的作用。Bukhari等[12]合成了槲皮素鈷配合物，運(yùn)用DPPH自由基清除法，研究其體外抗氧化活性，結(jié)果表明槲皮素鈷配合物清除自由基的活性明顯高于槲皮素。周晶等[13]合成了槲皮素銅，研究表明槲皮素銅能夠插入DNA的堿基對(duì)中，從而影響DNA分子的構(gòu)型，抑制了DNA分子的進(jìn)一步復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，最終達(dá)到抗癌效果。譚君等[14]發(fā)現(xiàn)槲皮素鋅和槲皮素鎳也能嵌入DNA的堿基對(duì)中，使細(xì)胞核皺縮，引起細(xì)胞凋亡。因此，近年來(lái)，對(duì)槲皮素金屬配合物的研究逐年增多，這對(duì)槲皮素的開(kāi)發(fā)利用及尋找新藥開(kāi)辟了新的途徑[15]。在我們?nèi)粘Ｉ钪薪?jīng)常食用一些含有槲皮素的黃酮類(lèi)蔬菜和水果，如蕃茄、洋蔥、蘋(píng)果、柑橘等，可清除體內(nèi)的自由基，使機(jī)體免受自由基的損傷，對(duì)降低人體內(nèi)重金屬離子的含量起著重要的作用。

本文介紹了合成槲皮素鈣的方法，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，研究了其清除自由基的能力。

圖1 槲皮素的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of quercetin

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 藥品與器材

槲皮素（自制：蘆丁酸水解，分離，甲醇純化），醋酸鈣（分析純），其他試劑均為分析純。

FTS-3000型紅外光譜儀（KBr壓片，美國(guó)尼高力）；德國(guó)耐馳 (Netzsch)STA 409 PC/PG差熱分析儀；UV-240型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；400MHz核磁共振儀（德國(guó)Brucker）。

1.2 槲皮素鈣的制備

按文獻(xiàn)[16]的方法適當(dāng)改進(jìn)，在三頸燒瓶中，取1mmol（302mg）槲皮素，加入25mL甲醇，攪拌使完全溶解，加入甲醇鈉調(diào)pH=8.5。加入預(yù)先溶于25mL甲醇中的1mmol（111mg）無(wú)水醋酸鈣溶液。在可加熱的磁力攪拌器上加熱回流6h。用硅膠G板監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程，待反應(yīng)完成時(shí)停止回流。過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，得棕黃色固體，用甲醇沖洗三次，真空干燥器中干燥，得深棕黃色固體。

槲皮素鈣為深棕黃色粉末，溶于甲醇、乙醇、DMSO，微溶于丙酮，乙酸乙酯，不溶于苯、甲苯和四氯化碳。

1.3 清除自由基實(shí)驗(yàn)

1×10-4mol/L的DPPH溶液的配制：精密稱(chēng)取10mg DPPH，置于250mL容量瓶中，加入少量無(wú)水乙醇，待溶解后再用無(wú)水乙醇定容至刻度，混勻，避光，置于冰箱保存。供試液的配制：精密取各樣品適量，以乙醇為溶劑，分別配制100mg/L，80mg/L，60mg/L，40mg/L，20mg/L的待測(cè)溶液。精確吸取不同濃度的樣品溶液1mL，分別與3mL 1×10-4mol/L的DPPH溶液混合，避光放置30min，在517nm處測(cè)吸光度Ay。以相應(yīng)溶劑代替樣品作為空白對(duì)照，吸光度為As，相應(yīng)樣品溶液的吸光度為A0。DPPH自由基清除活性按下式計(jì)算：

式中Ay—1mL樣品溶液與3mL DPPH溶液混勻后的吸光度值；As—1mL乙醇溶液與3mL DPPH溶液混勻后的吸光度值；A0—1mL樣品溶液與3mL乙醇溶液混勻后的吸光度值；參考文獻(xiàn)[16]計(jì)算自由基半數(shù)清除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜分析

槲皮素在258nm和360nm有兩個(gè)吸收峰，分別屬于n→π*（A環(huán)）電子躍遷和π→π*（B環(huán)）電子躍遷，分別對(duì)應(yīng)兩個(gè)生色團(tuán)組成：258nm吸收帶由苯甲酰生色團(tuán)產(chǎn)生，為帶Ⅱ；360nm吸收帶由肉桂酰生色團(tuán)產(chǎn)生，為帶Ⅰ[17]。

圖2 槲皮素的結(jié)構(gòu)及其紫外光譜特征Fig.2 The structure of quercetin and its UV spectrum signature

槲皮素鈣的UV吸收帶Ⅱ由258nm紅移至266nm，紅移8nm；帶Ⅰ由360nm紅移至388nm，紅移28nm。這是由于形成配合物后，共軛體系增大，能量降低，最大吸收向長(zhǎng)波方向移動(dòng)引起的。帶Ⅰ紅移遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于帶Ⅱ，這說(shuō)明Ca2+是在帶Ⅰ區(qū)域內(nèi)與槲皮素配位形成配合物的[18]。

圖3 槲皮素和槲皮素鈣的紫外光譜圖Fig.3 The UV spectra of quercetin and quercetin calcium

2.2 紅外光譜分析

槲皮素分子主要官能團(tuán)紅外吸收歸屬：υC=O1663.10cm-1；苯環(huán)骨架振動(dòng)頻率 υC=C1610.89cm-1，1449.49cm-1；δC3-OH1382.03cm-1；υC-O酚1319.41cm-1；υ-OH3408.74cm-1。

圖4 槲皮素的紅外光譜Fig.4 The IR spectrum of quercetin

槲皮素鈣的紅外光譜顯示，羰基吸收峰υC=O1663.10cm-1，紅移至1647.52cm-1，這是因?yàn)轸驶纬闪伺浜衔镆鸬?。槲皮素的特征吸收峰?OH3408.74cm-1，在槲皮素鈣中是3405.15cm-1幾乎沒(méi)有發(fā)生變化，這說(shuō)明槲皮素的基本骨架沒(méi)有發(fā)生變化。

圖5 槲皮素鈣的紅外光譜Fig.5 The IR spectrum of quercetin calcium

槲皮素和槲皮素鈣的紅外圖譜特征吸收峰比較結(jié)果顯示：①槲皮素的υC=O1663.10cm-1羰基振動(dòng)頻率移至1647.52cm-1，向紅移了15.58cm-1，可見(jiàn)槲皮素的4-羰基參與了槲皮素鈣配合物的形成[19]。②槲皮素鈣配合物在640.64cm-1出現(xiàn)了υM-O，說(shuō)明有金屬配位鍵生成。③苯環(huán)骨架振動(dòng)頻率υC=C1610.89cm-1，和υC-O-C1262.46cm-1，分別移至1596.11cm-1和1267.07cm-1，說(shuō)明在形成配合物后，苯環(huán)骨架的存在，只是向紅移動(dòng)了約幾個(gè)至幾十個(gè)波數(shù)[20]。

表1 槲皮素和槲皮素鈣的紅外吸收數(shù)據(jù)比較Table 1 The IR absorption data of quercetin and quercetin calcium

2.3 槲皮素鈣的氫譜

1H NMR譜是鑒定黃酮化合物的結(jié)構(gòu)類(lèi)型、確定取代基的位置和進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究的有效方法。氫譜可以提供有關(guān)分子中不同種類(lèi)氫原子的情況，如根據(jù)化學(xué)位移和偶合常數(shù)可以判斷有關(guān)氫原子的化學(xué)環(huán)境，每種不同環(huán)境下氫原子的數(shù)目以及每個(gè)氫原子相鄰的基團(tuán)的結(jié)構(gòu)等。槲皮素和槲皮素鈣的氫譜如表2所示。

表2 槲皮素和槲皮素鈣的氫譜Table 2 The H-NMR spectrum data of quercetin and quercetin calcium

由上述氫譜數(shù)據(jù)可知，槲皮素鈣中的3-OH和3'-OH上的氫消失，而其它3個(gè)羥基（7-OH，5-OH，4'-OH）上的氫依然存在，這說(shuō)明槲皮素的3位羥基和4位羰基上的氧與鈣離子配位，3'和4'位羥基與鈣離子結(jié)合。這與紫外光譜和紅外光譜數(shù)據(jù)是一致的[21～22]。

根據(jù)上述UV、IR、H NMR可得出槲皮素鈣的結(jié)構(gòu)：

圖6 槲皮素鈣的結(jié)構(gòu)Fig.6 The structure of quercetin calcium

2.4 槲皮素鈣清除DPPH自由基的作用

DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液在517nm處有最大吸收，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于DPPH自由基的單電子被配對(duì)，從而使得在517nm處的吸光度減小，因此該法常被用來(lái)評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力[23～24]。

圖7 槲皮素和槲皮素鈣對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.7 The DPPH free radical scavenging capacity of quercetin and quercetin calcium

從圖7可見(jiàn)，槲皮素和槲皮素鈣都隨著濃度的增大，對(duì)DPPH自由基的清除率也增大，但是很明顯槲皮素與鈣離子形成配合物后，其對(duì)DPPH自由基的清除能力略有降低。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，槲皮素鈣與槲皮素的EC50分別是8.17和14.07mg/L，進(jìn)一步說(shuō)明槲皮素在與鈣配位后，其清除DPPH自由基能力降低，這可能是形成配合物后，鄰二酚結(jié)構(gòu)的羥基與鈣離子配位，使其接受質(zhì)子的能力降低引起的。

3 結(jié)論

槲皮素與醋酸鈣在堿性條件下，生成了槲皮素鈣配合物。通過(guò)紫外、紅外、核磁等手段對(duì)槲皮素鈣進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。光譜數(shù)據(jù)闡明了配位的位點(diǎn)：槲皮素的3位羥基和4位羰基上的氧與鈣離子配位，3'和4'位羥基與鈣離子結(jié)合。通過(guò)DPPH法測(cè)定了槲皮素鈣清除自由基的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槲皮素鈣清除自由基的能力沒(méi)有槲皮素強(qiáng)。

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Synthesis and Biological Activity of Quercetin Calcium Complexes

LIU Qiu-wei1,ZHANG Hui-li1,LI Yang-jie1and ZHAI Guang-yu1,2
（1.College of Pharmacy,Zhengzhou University of Industrial Technology,Zhengzhou 451150,Chnia;2.College of Nursing,Zhengzhou University, Zhengzhou 450052,China）

The quercetin calcium is synthesized and its bioactivity is observed.The quercetin and acetate calcium are heated and refluxed for 6 hours at pH=8.5 to form quercetin calcium.The UV spectrum bandⅠandⅡof quercetin calcium has a red shifted by 28nm and 8nm respectively compared with that of quercetin;the carbonyl vibration frequency of quercetin calcium was 1647.52cm-1,which shifts to red about 15.58cm-1than that of quercetin,the new absorption peak υM-O=640.64cm-1appears in the high field,which indicates that there is a formation of metal coordination bond; the hydrogen spectrum of quercetin calcium shows that the 3-OH and 3'-OH hydrogen disappears,but the 7-OH,5-OH and 4'-OH still exists, which indicates that the oxygen at the 3-hydroxyl and 4-carbonyl groups of quercetin coordinates with the calcium ion and the hydroxyl groups at the 3'and 4'position combines with calcium ion.The free radical scavenging capacity of quercetin calcium and quercetin is measured by DPPH method, and their EC50are 8.17 and 14.07mg/L respectively,and this means the free radical scavenging capacity of quercetin calcium is worse than that of quercetin.

Quercetin;quercetin calcium complexes;synthesis;characterization;free radical scavenging capacity

TQ460.32

A

1001-0017（2017）01-0025-05

2016-08-01

劉秋偉（1984-），女，河南平頂山人，講師，從事天然產(chǎn)物有效成分的提取及教學(xué)工作。

*通訊聯(lián)系人：翟廣玉（1954-），男，河南項(xiàng)城人，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中草藥有效成分的結(jié)構(gòu)優(yōu)化、藥物化學(xué)合成及教學(xué)工作。

E-mail:Zhaiguangyu1@sina.com。