李林林， 張夢柯， 金征宇， 王麗華， 王金鵬*

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

雙酶法催化玉米淀粉制備γ-CD

李林林1，2， 張夢柯1，2， 金征宇1，2， 王麗華1，2， 王金鵬*1，2

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

以玉米淀粉為底物，研究了來自于棲熱水生菌的4α-糖基轉(zhuǎn)移酶（4αGTase）和來自于嗜堿芽孢桿菌的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase）作用于淀粉制備γ-CD的影響因素。結(jié)果表明：兩種酶的添加方式為先加入4αGTase、再加入CGTase；γ-CD的最佳制備條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，4αGTase加酶量4 U/g淀粉，CGTase加酶量8U/g淀粉，反應(yīng)時間30 h。在此條件下γ-CD的得率最高為12.83%，比對照組提高了76.7%。

4α-糖基轉(zhuǎn)移酶；環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；γ-環(huán)糊精；玉米淀粉

環(huán)糊精（cyclodextrin，簡稱CD）是由環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 （cyclodextringlycosyltransferase，簡稱CGTase）酶解淀粉或者淀粉類似物產(chǎn)生的由D-吡喃型葡萄糖單元通過α-1，4-糖苷鍵連接而成的一類環(huán)狀低聚化合物[1-2]。常見的為含有6、7和8個葡萄糖單元的分子，根據(jù)環(huán)中葡萄糖單元的數(shù)量，分別稱為α-CD、β-CD和γ-CD。與α-CD、β-CD相比，γ-CD具有較大的空腔和較高的溶解度，能夠包接較大的分子[2]。然而，盡管市場對γ-CD的需求很大，但是由于其轉(zhuǎn)化率低、產(chǎn)物特異性差以及分離純化困難造成的高成本大大限制了其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，使其只占有較小部分的市場份額[3]。

由于野生型的CGTase作用淀粉產(chǎn)生的都是不同比例的3種環(huán)糊精的混合物，因而其產(chǎn)物特異性差，并且后期的分離純化困難[4]。針對其產(chǎn)物特異性差的問題，目前很多人采用基因工程的手段，對現(xiàn)有的CGTase基因進(jìn)行突變，從而提高其產(chǎn)物專一性。Kian Mau Goh等[5]對來自于Bacillus sp.G1菌株的CGTase進(jìn)行突變，其突變體H43TCGTase產(chǎn)γ-CD的產(chǎn)率從 10%提高到了 39%。王峰等[6]從Bacillusmacorous中篩選出產(chǎn)γ-CGTase的菌株。此外，通過控制反應(yīng)條件和加入有機(jī)溶劑，也可實現(xiàn)提高產(chǎn)物比例和產(chǎn)率[7-8]。Bender等[9]向反應(yīng)體系中加入溴化苯和醋酸鈉使γ-CD的產(chǎn)率達(dá)到了18.7%。Rendleman等[10]以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的淀粉為底物，加入C12化合物反應(yīng)24 h后，γ-CD的產(chǎn)率有較大的提高。但是，這些有機(jī)化合物對于工業(yè)生產(chǎn)而言成本較高并且在后期分離過程中很難除去。

淀粉作為底物生產(chǎn)環(huán)糊精過程中存在的基本問題是高濃度淀粉粘度大，阻礙了酶和底物之間的接觸，使得環(huán)糊精產(chǎn)率低。因此可以通過物理、化學(xué)和酶法先對淀粉進(jìn)行預(yù)處理[11]。比如用α-淀粉酶或者熱穩(wěn)定性的CGTase先液化淀粉，降低體系的粘度[12-13]。但是Ivan Pishtiyski等[14]發(fā)現(xiàn)添加α-淀粉酶后并沒有使環(huán)糊精的產(chǎn)率增加。并且α-淀粉酶液化后必須要調(diào)節(jié)體系的pH，才能加入CGTase進(jìn)一步反應(yīng)，操作過程較復(fù)雜。另一種提高γ-CD產(chǎn)率的方法是用脫支酶比如異淀粉酶或者普魯蘭酶對淀粉先進(jìn)行預(yù)處理。因為在反應(yīng)過程中，脫支酶可以首先水解掉支鏈淀粉中的α-1，6糖苷鍵，之后再加入CGTase利用這部分淀粉發(fā)生環(huán)化作用[14-15]。Rendleman等[10]以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的支鏈淀粉為底物，先后加入普魯蘭酶和α-CGTase在15℃反應(yīng)，總環(huán)糊精的產(chǎn)率為84%。然而，先用脫支酶預(yù)處理淀粉后容易形成大量的直鏈淀粉晶體，使反應(yīng)周期延長[16]。

4α-糖基轉(zhuǎn)移酶（4αGTase）是淀粉代謝酶類，它可以產(chǎn)生含有16個葡聚糖單元及以上的大環(huán)糊精[17]。大環(huán)糊精可以轉(zhuǎn)化為 β-CD和 γ-CD。并且4αGTase更能耐受高溫，可以用4αGTase先預(yù)處理淀粉，降低淀粉的粘度，再加入CGTase進(jìn)一步反應(yīng)。而4αGTase是否有助于提高γ-CD的產(chǎn)率目前尚不清楚。作者將來自于棲熱水生菌的4αGTase和來自于嗜堿性芽孢桿菌的G825-6的CGTase進(jìn)行結(jié)合，探索雙酶作用催化玉米淀粉對γ-CD產(chǎn)率的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

馬鈴薯直鏈淀粉：Sigma公司產(chǎn)品；普通玉米淀粉：杭州普羅星淀粉有限公司產(chǎn)品；α-CD、β-CD及γ-CD標(biāo)準(zhǔn)樣品：Sigma公司產(chǎn)品；可溶性淀粉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；棲熱水生菌4α-糖基轉(zhuǎn)移酶及嗜堿性芽孢桿菌CGTase G825-6：作者所在實驗室制備；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

雙光束紫外可見分光光度計（TU-1900）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠產(chǎn)品；低速臺式大容量離心機(jī)（RJTDL-50A）：無錫瑞江分析儀器有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)（BIOFUGE PRIMOR）：美國Thermo Scientific有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀（LC-20AT230V），示差折光檢測器（RID-10A），AKTA purifier900蛋白純化系統(tǒng)：島津公司產(chǎn)品；Hypersil NH2色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 mAPS-2Hypersil微粒）：美國Thermo公司產(chǎn)品；純泰Ni-NTA親和層析柱：GE Healthcare life sciences公司產(chǎn)品；ShodexOHpak SB-804 HQ色譜柱、OHpak SB-802.5 HQ色譜柱：日本昭和公司產(chǎn)品。

2 實驗方法

2.1 棲熱水生菌4α-糖基轉(zhuǎn)移酶的制備

由基因工程菌E.coli培養(yǎng)發(fā)酵，再經(jīng)Ni-NTA親和層析柱分離純化得到4α-糖基轉(zhuǎn)移酶[18]。

4α-糖基轉(zhuǎn)移酶酶活測定：淀粉-碘顯色法[18]。

2.2 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的制備

從低溫冰箱中取出一支甘油管保藏菌接種至含有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)10h。按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種至含有100mL培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，待A=1.0時加入IPTG使其終濃度為0.05 mmol/L，在18℃、200 r/min下誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h。培養(yǎng)結(jié)束后，菌液5 000 r/min離心30 min，棄掉上清液，收集菌體。菌體懸浮于pH 8.5的Tris-HCl中超聲破碎，離心后所得上清液即粗酶液。

粗酶液的純化采用淀粉吸附法[19]：首先向粗酶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的玉米淀粉和1 mol/L的硫酸銨，在4℃緩慢攪拌1 h，使酶充分被淀粉吸附；反應(yīng)混合物6 500 r/min離心10 min，沉淀用預(yù)冷的1mol/L的硫酸銨洗滌兩次，除去未被吸附的蛋白；為充分洗脫下吸附在淀粉上的CGTase，殘渣用含有1 mmol/Lγ-CD的50 mmol/L、pH 8.5的Tris-HCl在37℃振蕩培養(yǎng)30min得到洗脫液1；離心后的沉淀再用同樣含有γ-CD的緩沖液洗脫，得到洗脫液2；兩次得到的洗脫液合并，用50 mmol/L、pH 8.5的Tris-HCl緩沖液在4℃透析24 h，每隔6 h換一次緩沖液。

2.3 CGTase環(huán)化活力的測定

將適量 CGTase的酶液加入預(yù)先裝有用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 （pH 8.5）配制的可溶性淀粉溶液（2 g/dL）的試管中，充分混勻，在50℃反應(yīng)30min后，沸水浴10 min終止反應(yīng)。用HPLC測定環(huán)糊精含量。

酶活力單位（U）定義為：在上述條件下每30 min生成1μmolγ-CD所需的酶量。

2.4 酶解淀粉產(chǎn)物測定

采用HPLC法對酶催化產(chǎn)物進(jìn)行分析，色譜條件為：Hypersil NH2色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 mAPS-2Hypersil微粒），示差折光檢測器 （RID-10A）；流動相為70%乙腈水溶液，流量為1mL/min，柱溫40℃。

2.5 淀粉相對分子質(zhì)量測定

分別稱取50 mg原淀粉和經(jīng)4αGTase處理過的淀粉分散于5 mL體積分?jǐn)?shù)90%的DMSO中，沸水浴煮沸1 h使其完全溶解并在室溫下磁力攪拌12 h。取1mL經(jīng)DMSO處理過的淀粉溶液用6mL的無水乙醇沉淀，5 000 r/min離心10 min沉淀淀粉。離心結(jié)束后棄上清液，向沉淀物中加入10mL的沸水溶解并在沸水浴中攪拌30min。樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，以未經(jīng)4αGTase處理的玉米淀粉溶液為對照，進(jìn)行高壓體積排阻色譜（HPSEC）色譜分析。ShodexOHpak SB-804 HQ色譜柱和OHpak SB-802.5 HQ色譜柱串聯(lián)后保持柱溫50℃，超純水作為流動相，流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20μL，分析時間為30min。在上述色譜條件下分析的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)樣品 （相對分子質(zhì)量為 9 600，21 100， 107 000，337 000，642 000）用于分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

2.6 支鏈淀粉鏈長分布測定

分別稱取20 mg原淀粉和經(jīng)4αGTase處理過的淀粉分散于2 mL體積分?jǐn)?shù)90%的DMSO中，沸水浴煮沸1 h使其完全溶解，用4倍體積的無水乙醇沉淀，5 000 r/min離心10min沉淀淀粉。離心結(jié)束后棄上清液，向沉淀物中加入2 mL預(yù)熱的50 mmol/L的醋酸鹽緩沖溶液（pH 3.5）使其溶解，再加入50 U/g的異淀粉酶40℃下反應(yīng)24 h，沸水浴10 min終止反應(yīng)。10 000 r/min離心10min，取上清液稀釋10倍，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，采用高效陰離子交換色譜（HPAEC）法測定鏈長分布。

色譜柱型號：CarboPacPA200，檢測器為安培脈沖檢測器；溫度：25℃；流量：0.5 mL/min，流動相A為0.15 mol/L NaOH溶液，流動相B為0.15 mol/L NaOH和0.5mol/L醋酸鈉混合液，采用梯度洗脫，程序為：體積分?jǐn)?shù)60%流動相A+40%流動相B保持2 min，體積分?jǐn)?shù)50%流動相A+50%流動相B保持8 min，體積分?jǐn)?shù)40%流動相A+60%流動相B保持30 min，體積分?jǐn)?shù)20%流動相A+80%流動相B保持20 min[20]。

2.7 酶的添加順序?qū)Ζ?CD產(chǎn)率的影響

采用同時加酶及先后加酶兩種方式。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的玉米淀粉溶液 （溶解于pH 8.5的Tris-HCl緩沖液中），電爐煮沸糊化10 min，冷卻至反應(yīng)溫度。對于先后加酶的方式：向冷卻后的淀粉溶液中分別加入一定量的4αGTase，充分混勻后在70℃、800 r/min下振蕩反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴30min滅酶，待溶液溫度冷卻至50℃左右時，向溶液中加入CGTase反應(yīng)24 h。對于同時加酶的方式：向淀粉溶液中同時加入一定量的 4αGTase和CGTase，在不同溫度下反應(yīng)一定的時間。上述反應(yīng)結(jié)束后，取樣500μL，沸水浴10 min滅酶，10 000 r/min離心15 min除去變性的酶蛋白和未反應(yīng)的淀粉，上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后取20μL進(jìn)行HPLC分析。

2.8 單因素試驗

對先后加酶方式進(jìn)行單因素實驗。首先對4αGTase的添加量進(jìn)行了單因素實驗，然后分別探討了CGTase的添加量、反應(yīng)時間及底物濃度對對γ-CD產(chǎn)率的影響，此時4αGTase加酶量為4 U/g淀粉，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時間為24 h。

2.8.1 4αGTase添加量對對γ-CD產(chǎn)率的影響 向以5%的淀粉為底物中分別加入1、2、4、8、16 U/g淀粉的4αGTase，70℃反應(yīng)24 h后，加入8 U/g淀粉的CGTase，50℃反應(yīng)24 h后進(jìn)行產(chǎn)物分析。

2.8.2 CGTase添加量對γ-CD產(chǎn)率的影響 向以5%的淀粉為底物且經(jīng)4αGTase反應(yīng)后的溶液中加入CGTase，加入量分別為0．05、1、2、8、10 U每克淀粉，50℃反應(yīng)24 h后進(jìn)行產(chǎn)物分析。

2.8.3 CGTase反應(yīng)時間對γ-CD產(chǎn)率的影響 向以5%的淀粉為底物且經(jīng)4αGTase反應(yīng)后的溶液中加入 8 U/g淀粉的 CGTase，50℃反應(yīng) 2、5、8、11、24、30 h后對產(chǎn)物進(jìn)行分析。

2.8.4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對γ-CD產(chǎn)率的影響 向以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、3%、5%、10%、15%的淀粉為底物且經(jīng)4αGTase反應(yīng)后的溶液中加入 8 U/g淀粉的CGTase，50℃反應(yīng)24 h后對產(chǎn)物進(jìn)行分析。

2.9 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交表對底物濃度，4αGTase添加量，CGTase添加量和CGTase反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化，以γ-CD得率為評定指標(biāo)，試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計表Table 1 Design table of factor and level in orthogonal test

3.1 酶的添加順序?qū)Ζ?CD產(chǎn)率的影響

由圖1可知：先加入4αGTase預(yù)處理淀粉后再加入CGTase這種先后加酶的方法所制備γ-CD的產(chǎn)率顯著優(yōu)于兩種酶同時加入的方式，并且兩種酶協(xié)同作用所產(chǎn)γ-CD的產(chǎn)率均顯著高于對照組；當(dāng)加入 4 U/g的 4αGTase時，γ-CD的產(chǎn)率最高為10．43%，比對照組多41．71%。

圖1 酶的添加順序?qū)Ζ?CD產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of the adding sequence of enzymes on theγcyclodextrinyiled

推測造成這一現(xiàn)象的原因可能是因為加入4αGTase在70℃對淀粉預(yù)處理后淀粉的相對分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，使得經(jīng)4αGTase處理后的淀粉比原淀粉更適合作為CGTase進(jìn)一步反應(yīng)的底物[21]。為驗證這一推測，研究了普通玉米淀粉經(jīng)4αGTase酶解后淀粉相對分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如圖2、圖3所示。經(jīng)測定未經(jīng)處理的普通玉米淀粉的重均相對分子質(zhì)量M w為3．36×107，而淀粉經(jīng)4αGTase酶解10 h之后的重均相對分子質(zhì)量M w為4．75×105，隨著酶解時間延長為24 h淀粉重均相對分子質(zhì)量M w變?yōu)?．35×105，而將這3種相對分子質(zhì)量的淀粉作為底物，再經(jīng)CGTase催化所得γ-CD的產(chǎn)率分別為7．26%、9．38%、10．43%。并且由圖3可知，隨著4αGTase酶添加量的增加，支鏈淀粉的A鏈（DP＜12）、B2（DP 25-36）、B3鏈（DP＞36）的相對含量都增加，而將這3種結(jié)構(gòu)的淀粉作為底物，再經(jīng)CGTase催化所得γ-CD的產(chǎn)率分別為9．52%、10．43%、10．34%。該結(jié)果表明，玉米淀粉經(jīng)4αGTase作用后的分子大小及分子結(jié)構(gòu)更適于作為CGTase的催化底物。

3.2 4αCGTase添加量對γ-CD產(chǎn)率的影響

由表2可以看出，隨著 4αGTase添加量的增加，γ-CD的產(chǎn)率先上升后下降，4αGTase加入量為4 U/g時γ-CD的產(chǎn)率達(dá)到最高。原因可能是過多的4αGTase作用淀粉之后所產(chǎn)生的較小分子量的物質(zhì)不適于作為CGTase的最佳底物。

圖2 普通玉米淀粉經(jīng)4通GTase酶解前后相對分子質(zhì)量分布圖Fig.2 M olecular weight distribution of nativeand 4nGTase-treated corn starch

圖3 普通玉米淀粉經(jīng)4αGTase酶解前后支鏈淀粉鏈長分布圖Fig.3 Chain length distribution ofnativeand 4αGTasetreated corn starch

表2 4αGTase加酶量對γ-CD產(chǎn)率的影響Table 2 Effect of the amount of 4-α-glucosyltransferase on theγ-cyclodextrinyiled

3.3 CGTase添加量對γ-CD產(chǎn)率的影響

由表3可知，γ-CD的得率隨著CGTase添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)CGTase添加量為8 U/g時，γ-CD的得率達(dá)到最大，為11.93%；并且隨著加酶量繼續(xù)增加，不僅γ-CD的得率下降，而且γ-CD所占的百分比也減少，β-環(huán)糊精所占百分比增加。引起這一現(xiàn)象的原因可能是產(chǎn)生的γ-CD進(jìn)一步被CGTase催化轉(zhuǎn)化為β-CD或其他小分子低聚糖所致。

表3 CGTase加酶量對γ-CD產(chǎn)率的影響Table 3 Effect of the amount of cyclodextrin glucosyl trans ferase on theγ-cyclodextrinyiled

3.4 CGTase反應(yīng)時間對γ-CD產(chǎn)率的影響

由圖4可知，γ-CD的得率隨著反應(yīng)時間的增加呈先增加后下降的趨勢，當(dāng)反應(yīng)24 h時γ-CD的得率最高，為11.83%，因此確定CGTase的最佳反應(yīng)時間為24 h。

圖4 反應(yīng)時間對γ-CD產(chǎn)率的影響Fig.4 Effectof the reaction timeon theγ-cyclodextrinyiled

3.5 底物濃度對γ-CD產(chǎn)率的影響

由圖5可知，隨著反應(yīng)底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，γ-CD的得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。當(dāng)反應(yīng)底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到5%時，γ-CD的得率最高，為10.43%；隨著淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加，γ-CD得率迅速下降。造成這一現(xiàn)象的原因可能有：隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)從5%增加到15%，玉米淀粉的粘度增大，導(dǎo)致流動性變差，底物和酶分子之間無法充分相互接觸，從而使得反應(yīng)速率降低；其次是高濃度的底物，使得多個底物分子占據(jù)酶蛋白的部分活性位點，形成無效的中間產(chǎn)物，從而抑制了酶活性；此外，體系中較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的小分子物質(zhì)將抑制CGTase的環(huán)化作用，增強(qiáng)其偶合和歧化作用，從而降低γ-CD的得率。

圖5 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對γ-CD產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of the substrate concentration on γcyclodextrin yield

3.6 正交試驗結(jié)果

按照表1的設(shè)計進(jìn)行正交試驗，結(jié)果如表4所示。根據(jù)極差R的大小，由直觀分析可知各因素對γ-CD產(chǎn)率影響的大小順序為C（CGTase添加量）＞A（底物濃度）＞D（CGTase反應(yīng)時間）＞B（4αGTase添加量），最佳工藝為A2B2C2D3，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、4αGTase添加量 4 U/g、CGTase添加量 8 U/g、CGTase反應(yīng)時間30 h。按照方案A2B2C2D3進(jìn)行驗證試驗，γ-CD的產(chǎn)率為12．83%，比單酶法制備γ-CD產(chǎn)率提高了76．7%。

表4 正交試驗結(jié)果Table 4 ResuLts of the orthogonal test

4 結(jié)語

通過4αGTase和CGTase雙酶修飾淀粉，研究了其對γ-CD得率的影響。發(fā)現(xiàn)雙酶法能夠顯著提高γ-CD的得率，雙酶的添加順序為先加入4αGTase，再加入CGTase；反應(yīng)條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，4αGTase添加量4 U/g淀粉，CGTase添加量8 U/g淀粉，反應(yīng)時間30 h，在此條件下γ-CD的得率為12．83%，比單酶法制備γ-CD的得率提高了76．7%。

[1]FREUDENBERG K，CRAMER F.Notizen：Die Konstitution der Schardinger-Dextrineα，βandγ [J].Zeitschrift für Naturforschung B，1948，3（11-12）：464-466.

[2]金征宇，徐學(xué)明，陳寒青，等.環(huán)糊精化學(xué)-制備與應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：1-35.

[3]LIZ，WANGM，WANG F，etal.γ-Cyclodextrin：a review on enzymatic production and applications[J].Applied M icrobiology and Biotechnology，2007，77（2）：245-255.

[4]KIRK O，BORCHERT TV，F(xiàn)UGLSANG CC.Industrialenzyme applications[J].Current Opinion in Biotechnology，2002，13（4）：345-351.

[5]GOH K M，MAHADINM，HASSAN O，etal.The effectsof reaction conditionson the production ofγ-cyclodextrin from tapiocastarch by using a novel recombinant engineered CGTase[J].Journal of M olecuLar Catalysis B：Enzymatic，2007，49（1）：118-126.

[6]WANG F，DU G，LIY，etal.Optim ization of cuLtivation conditions for the production ofγ-cyclodextrin glucanotransferase by Bacillusmacorous[J].Food Biotechnology，2005，18（2）：251-264.

[7]BIWER A，ANTRANIKIAN G，HEINZLE E.Enzymatic production of cyclodextrins[J].App lied M icrobiology and Biotechnology，2002，59（6）：609-617.

[8]FUJITA Y，TSUBOUCHIH，INAGIY，et al.Purification and properties of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus sp. AL-6[J].Journal of Fermentation and Bioengineering，1990，70（3）：150-154.

[9]BENDER H.An improved method for the preparation of cyclooctaamylose，using starches and the cyclodextrin glycosyltransferase of K lebsiella pneumoniaeM 5 al[J].Carbohydrate Research，1983，124（2）：225-233.

[10]RENDLEMAN JA.Enhanced production of cyclomaltooctaose （γ-cyclodextrin）through selective complexation w ith C 12 cyclic compounds[J].Carbohydrate Research，1992，230（2）：343-359.

[11]CHAROENLAPN，DHARMSTHITIS，SIRISANSANEEYAKUL S，et al.Optimization of cyclodextrin production from sago starch[J].Bioresource Technology，2004，92（1）：49-54.

[12]PEDERSEN S，DIJKHUIZEN L，DIJKSTRA BW，etal.A betterenzyme for cyclodextrins[J].Chem tech，1995，25（12）：19-25.

[13]STARNESR L.Thermostable cyclodextrin glycosyl transferase and processesusing it：U.S.Patent6，184，001[P].2001-2-6.

[14]PISHTIYSKII，ZHEKOVA B.Effectof differentsubstratesand their preliminary treatmenton cyclodextrin production[J].World Journal of M icrobiology and Biotechnology，2006，22（2）：109-114.

[15]RENDLEMAN J A.Enhancement of cyclodextrin production through use of debranching enzymes[J].Biotechnology and Applied Biochem istry，1997，26（1）：51-61.

[16]POHU A，PUTAUX JL，PLANCHOTV，etal.Origin of the limitedα-amylolysis of debranchedmaltodextrins crystallized in the A form：A TEM study onmodelsubstrates[J].BiomacromolecuLes，2004，5（1）：119-125.

[17]ZHENGM，ENDO T，ZIMMERMANNW.Enzymatic synthesisand analysisof large-ring cyclodextrins[J].Australian Journal of Chem istry，2002，55（2）：39-48.

[18]JI Xuexia，WANG Jinpeng，XU Xuem ing，et al.Purification and properties of 4-a-glucanotransferase producing large-ring cyclodextrin[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2010，29（3）：336-41.（in Chinese）

[19]MARTINS R F，HATTI K R.A new cyclodextrin glycosyltransferase from an alkaliphilic Bacillus agaradhaerens isolate：purification and characterisation[J].Enzyme and M icrobial Technology，2002，30（1）：116-124.

[20]CAIL，SHIY C.Structure and digestibility of crystalline short-chain amylose from debranched waxy wheat，waxy maize，and waxy potato starches[J].Carbohydrate Polymers，2010，79（4）：1117-1123.

[21]YOSHINAO I，NOBUHIRO H，KAZUMASA S.Process forproducing cyclodextrins：Japan，Patent168295.1[P].1989.

γ-CD Catalyzed from M aize Starch by Dual Enzymatic Reaction

LILinlin1，2， ZHANGMengke1，2， JIN Zhengyu1，2， WANG Lihua1，2， WANG Jinpeng*1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Theconjunction of4α-glycosyltransferase（4αGTase）w ith cyclodextringlycosyltransferase（CGTase）were screened for their ability ofproducingγ-cyclodextrin（CD）usingmaize starch as substrate.The studies on the influence factors showed that4αGTase should be added first，followed byCGTase.The optimal conditions forγ-CD production was as follow ing：4U of 4αGTase and 8U ofCGTasepergram ofsubstratewereused to convertmaizestarch（5%，w/v）intoγ-CDw ith the reaction time of30 h.the subsequentyield ofγ-CD was12.83%，whichwas76.7%higher than the control.This studyhaspotentialvalue for theindustrialproductionofγ-CD.

4α-glycosyltransferase，cyclodextringlycosyltransferase，γ-cyclodextrin，maizestarch

TS 236.9

A

1673—1689（2017）04—0357—07

2015-05-15

國家自然科學(xué)基金項目 （31230057，31401524）；江蘇省自然科學(xué)基金項目 （BK20140143）；江蘇省科技支撐計劃項目（BE2013311）。

*通信作者：王金鵬（1984—），女，河南開封人，副教授，主要從事碳水化合物資源開發(fā)與利用研究。E-mail：jpwang1984@jiangnan.edu.cn

李林林，張夢柯，金征宇，等.雙酶法催化玉米淀粉制備γ-CD[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（04）：357-363.