范家強(qiáng)，苑舉輝，郝云甲，周密，陳偉，王愛國*

(1.江蘇省徐州市中心醫(yī)院，江蘇 徐州 221009；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130033；3.吉林大學(xué)物理學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130033)

實(shí)驗(yàn)研究

膝關(guān)節(jié)表面軟骨與游離體表面軟骨FT-IR光譜成像的對(duì)比研究

范家強(qiáng)1，苑舉輝2，郝云甲1，周密3，陳偉2，王愛國1*

(1.江蘇省徐州市中心醫(yī)院，江蘇 徐州 221009；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130033；3.吉林大學(xué)物理學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130033)

目的 研究游離體表面軟骨與關(guān)節(jié)軟骨的差異，為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損提供借鑒。方法 以膝關(guān)節(jié)表面軟骨及關(guān)節(jié)內(nèi)游離體表面軟骨為研究對(duì)象，通過FT-IR光譜成像的分析方法及主成分分析法，從分子水平辨別同處于一個(gè)關(guān)節(jié)腔微環(huán)境中兩種軟骨的差別。結(jié)果 兩種軟骨中作為填充物的蛋白多糖，沒有明顯的變化，二階導(dǎo)數(shù)波數(shù)位置中1 514 cm-1所代表的膠原N-H彎曲振動(dòng)(實(shí)驗(yàn)組為1 516 cm-1，對(duì)照組為1 514 cm-1)與1 574 cm-1所代表的酰胺Ⅱ(實(shí)驗(yàn)組為1 575 cm-1，對(duì)照組為1 573 cm-1)表現(xiàn)出藍(lán)移。主成分散點(diǎn)圖顯示關(guān)節(jié)表面軟骨主要分布于第一象限，游離體表面軟骨主要分布于三四象限。結(jié)論 游離體表面軟骨基質(zhì)成分尤其是膠原已發(fā)生變化，具有一定的缺陷性。

關(guān)節(jié)；軟骨；傅里葉轉(zhuǎn)換紅外；游離體；主成分分析

關(guān)節(jié)軟骨于胚胎期伴隨著骨關(guān)節(jié)的出現(xiàn)而發(fā)生，研究表明[1]諸多的調(diào)節(jié)因子參與了關(guān)節(jié)軟骨生長(zhǎng)，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞成熟之后轉(zhuǎn)而成為功能性細(xì)胞，分泌膠原等關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)。游離體的產(chǎn)生與很多因素有關(guān)[2]：創(chuàng)傷致關(guān)節(jié)軟骨撕脫進(jìn)入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，炎性因子的分泌和失衡等。曾報(bào)道[3]膝關(guān)節(jié)軟骨游離體在關(guān)節(jié)腔生理環(huán)境中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)進(jìn)行性軟骨結(jié)構(gòu)性破壞、生理活性下降。有學(xué)者研究[4]發(fā)現(xiàn)游離體內(nèi)的軟骨細(xì)胞體積增大，排列紊亂，基質(zhì)減少，出現(xiàn)正常軟骨細(xì)胞不表達(dá)的Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA。Arokoski研究[5]發(fā)現(xiàn)游離體軟骨細(xì)胞周圍基質(zhì)降解使軟骨陷窩的容積增大，其中的軟骨細(xì)胞失去了基質(zhì)的保護(hù)和制約，受到了異常力學(xué)和細(xì)胞因子的影響。

對(duì)關(guān)節(jié)表面軟骨與游離體表面軟骨通過FT-IR紅外光譜成像進(jìn)行對(duì)比研究，并應(yīng)用相對(duì)廣泛的二階導(dǎo)數(shù)和主成分分析法(PCA)分析兩者的異同點(diǎn)，能夠從分子水平更深入地了解軟骨的差異和變化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)器材 甲醛(天津永晟精細(xì)化工有限公司)；無水乙醇，二甲苯，濃鹽酸(北京化工廠)；載玻片(Labserv Fisher Scientific，8106W-4)；蘇木精-伊紅Y染色劑(北京賽馳生物科技有限公司)；溴化鉀(上海譜振生物科技有限公司)；X線成像儀(德國西門子公司)；包埋機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司TB-718L)；切片機(jī)(上海倍曼生物科技有限公司)；染色機(jī)(德國MICROM公司HMS740)；恒溫水浴箱(德國leica HI1210)；光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX41TF)；高溫烘箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；封裝機(jī)(德國MICROM公司CTM6)；FT-IR紅外光譜成像儀器(ominic nicolet 360，USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 取材 膝關(guān)節(jié)表面軟骨及關(guān)節(jié)內(nèi)游離體(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科術(shù)中收集，標(biāo)本取材符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求，并由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審議批準(zhǔn))：關(guān)節(jié)表面軟骨(對(duì)照組，n=10)及游離體(實(shí)驗(yàn)組，n=10)來自于臨床診斷為OA的患者。其中男性4例，女性6例；年齡60～75歲，平均64.1歲。術(shù)中提取對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本：作為對(duì)照組的關(guān)節(jié)表面軟骨取材區(qū)位于股骨內(nèi)外髁表面，游離體取材區(qū)為其表面軟骨，所有軟骨樣本均取自表層軟骨下1 mm的中淺層。同時(shí)將術(shù)中提取到的同源實(shí)驗(yàn)標(biāo)本部分制備病理切片，來確定樣本的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)性。

1.2.2 樣品制備 取病理切片同源的游離體及關(guān)節(jié)軟骨的薄片，厚度約1 mm的中淺層軟骨，脫蠟，去離子水充分沖洗，干燥，將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的軟骨標(biāo)本與KBr粉末按一定比例(約1︰20)混合后，置于瑪瑙研缽中充分研磨，壓片機(jī)壓制透明薄片(壓片機(jī)壓力約P=16 kPa)。

1.2.3 紅外吸收譜線的采集 紅外光譜成像儀實(shí)驗(yàn)區(qū)域經(jīng)二氧化碳干燥，采取的樣本類型窗口為KBr，調(diào)整分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次，取平均值，波段范圍400～4 000 cm-1，預(yù)先掃描背景，去除水蒸氣與CO2的干擾，將壓制好的透明薄片樣本置于紅外光譜系統(tǒng)中采集光譜。利用onimic 7.0軟件(ominic nicolet，USA)對(duì)光譜進(jìn)行收集及保存，對(duì)紅外吸收譜線進(jìn)行自動(dòng)基線校準(zhǔn)及平滑。二階導(dǎo)數(shù)譜圖采用Savizky-Golay算法(7點(diǎn)平滑)。

2 結(jié) 果

2.1 組織切片結(jié)果 正常關(guān)節(jié)表面軟骨，可見軟骨分布具有明顯分層，基質(zhì)由淺至深逐漸減少，軟骨細(xì)胞由淺至深逐漸增多，而游離體表面的軟骨基質(zhì)染色均一化，無軟骨陷凹存在，軟骨細(xì)胞呈簇型結(jié)節(jié)樣聚集現(xiàn)象而未有層次出現(xiàn)，伴細(xì)胞外基質(zhì)染色異常(見圖2)。

圖1 關(guān)節(jié)表面軟骨(a)和游離體表面軟骨(b)的吸收光譜 圖2 正常表面軟骨(左)及游離體表面軟骨(右)對(duì)比(HE染色，10*10)

2.2 游離體表面軟骨中蛋白多糖結(jié)果 軟骨成分方面的研究[7]表明，水分最為豐富，占總重的70%，經(jīng)過干燥等光譜測(cè)試前處理的軟骨樣本，主要含有膠原和蛋白多糖，其比值為1/4～2/3，而膠原主要是Ⅱ型膠原為主。蛋白多糖[8](984～1 140 cm-1)和Amide I(1 585～1 720 cm-1)含量[9]的比值(Carb/Amide I)可間接反映膠原蛋白多糖的比值關(guān)系[10]。吸收光譜譜線下面積經(jīng)修正表示，對(duì)照組為(0.335±0.100)，實(shí)驗(yàn)組為(0.410±0.200)，P=0.480，兩者未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3)。二階導(dǎo)數(shù)的對(duì)比中，對(duì)照組紅外光譜中的甲基CH3-的對(duì)稱振動(dòng)位置在(1 387±5)cm-1，實(shí)驗(yàn)組的位置在(1 385±5)cm-1，P=0.779。SO3-的對(duì)稱拉伸振動(dòng)的波數(shù)位置對(duì)照組在(1 068±3)cm-1，實(shí)驗(yàn)組在(1 067±5)cm-1，P=0.911，兩者結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 游離體表面軟骨中膠原結(jié)果 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在1 202 cm-1，1 336 cm-1，1 448 cm-1，1 640 cm-1等波數(shù)位置均未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。代表膠原主鏈結(jié)構(gòu)肽鍵中C-N鍵拉伸和C-N鍵折疊的酰氨Ⅱ波數(shù)位置1 574 cm-1，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組發(fā)生明顯藍(lán)移，對(duì)照組為(1 573±0)cm-1，實(shí)驗(yàn)組為(1 575±2)cm-1，P=0.015，兩者之間存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。代表膠原分子中N-H鍵彎曲振動(dòng)波數(shù)位置1 514 cm-1，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組發(fā)生明顯藍(lán)移，對(duì)照組為(1 514±2)cm-1，實(shí)驗(yàn)組為(1 516±1)cm-1，P<0.01，兩組存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(詳見圖3～4)。

圖3 關(guān)節(jié)表面軟骨(a)和游離體表面軟骨(b)的平均二階導(dǎo)數(shù)譜線圖 圖4 對(duì)照組(CG)和實(shí)驗(yàn)組(EG)二階導(dǎo)數(shù)中不同波數(shù)位置的統(tǒng)計(jì)值

2.4 主成分分析法結(jié)果分析 主成分分析的結(jié)果顯示前兩個(gè)的主成分特征值及積累可信度PC_1合計(jì)值為33.19，積累值為85.10%，PC_2的合計(jì)值為4.618，積累可信度96.94%。通過兩個(gè)主成分值即可說明所有樣本的信息，以PC_1為橫坐標(biāo)，PC_2為縱坐標(biāo)，對(duì)20個(gè)樣本的主成分得分值點(diǎn)進(jìn)行作圖，得到圖5所示散點(diǎn)圖。

圖5 樣本的主要成分得分值坐標(biāo)圖(a為對(duì)照組，b 為實(shí)驗(yàn)組)

3 討 論

通過對(duì)兩者的病理結(jié)果分析，可說明這些關(guān)節(jié)內(nèi)游離體與關(guān)節(jié)表面軟骨的退變存在必然的相關(guān)性。Yorgancigi研究[17]表明關(guān)節(jié)腔內(nèi)游離體的數(shù)量呈現(xiàn)由多到少，外形呈現(xiàn)由光滑到粗糙的變化趨勢(shì)。游離體的表面均可見軟骨包裹，喪失正常軟骨的平整光滑特性。這說明在同一關(guān)節(jié)腔內(nèi)，除在關(guān)節(jié)表面存在軟骨外，關(guān)節(jié)內(nèi)其他部位仍可存在軟骨組織。游離體表面的軟骨基質(zhì)染色均一化，未出現(xiàn)正常軟骨隨深度而出現(xiàn)變少的跡象，無軟骨陷凹存在，軟骨細(xì)胞呈簇型結(jié)節(jié)樣聚集現(xiàn)象，細(xì)胞外基質(zhì)增生異常(見圖1)。由此可見，來源同一機(jī)體內(nèi)在同一關(guān)節(jié)腔內(nèi)生長(zhǎng)、相同空間微環(huán)境情況下，軟骨發(fā)育是不完全相同的。而這種差別在細(xì)胞形態(tài)上很難區(qū)分，主要表現(xiàn)在細(xì)胞分布、細(xì)胞排列等方面。這種差異考慮與以下幾方面有關(guān)：不同部位軟骨營養(yǎng)供應(yīng)來源不同[18]，不同部位的軟骨細(xì)胞表型改變，外傷致軟骨所受壓力負(fù)荷的不均衡。并有研究[19]發(fā)現(xiàn)，通過免疫組織化學(xué)方法處理樣本后，關(guān)節(jié)表面軟骨與游離體表面軟骨在膠原表達(dá)方面存在較大差異。

以上結(jié)果得出，蛋白多糖作為關(guān)節(jié)軟骨的填充物未出現(xiàn)變化。一方面，兩者同處于關(guān)節(jié)腔同一個(gè)微環(huán)境下，因骨關(guān)節(jié)炎造成軟骨殘存不全，細(xì)胞外基質(zhì)裸露，游離體表面軟骨與關(guān)節(jié)軟骨中的蛋白多糖發(fā)生相互交換填充；另一方面，組成游離體表面軟骨的軟骨細(xì)胞表型發(fā)生變化，但合成和分泌PGs的能力未發(fā)生明顯變化，致使兩者的成分未見差別。

另外關(guān)節(jié)軟骨中的膠原是一種同源的三聚體結(jié)構(gòu)，即3條α多肽鏈相互螺旋狀排列做成的蛋白結(jié)構(gòu)，每條α鏈都是由Gly-X-Y這種序列多次重復(fù)排列組成的(Gly為甘氨酸，X為脯氨酸，Y為4-羥脯氨酸)。膠原α鏈的骨架結(jié)構(gòu)Gly-X-Y組成為C-C-N的重復(fù)序列，這種序列在組成α鏈的各個(gè)氨基酸分子內(nèi)，或者酰胺之中。而X和Y中C-C-N的連接因?yàn)樾纬闪穗s環(huán)樣結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致波數(shù)嚴(yán)重背離觀測(cè)波數(shù)位置，因此特定波數(shù)所代表的化學(xué)基團(tuán)的振動(dòng)信息可以代表膠原主鏈的信息，具體可見表1。

表1 關(guān)節(jié)軟骨的紅外光譜峰值所代表的基團(tuán)振動(dòng)(cm-1)

1720～1585(1640) AmideI(C=Ostretch)1064C=OstretchingofthecarbohydrateresiduesinPGs/SO3?symmetricstretchingofGAGs[11?12]1376CH3?symmetricbendingofGAGs[10]1202AmideⅢvibrationwithCH2waggingvibration[13]1336CH2?sidechainvibrationofcollagen[10]1448CH3?asymmetricbending[14]1409COO?stretchingofaminosidechains[10]1574AmideⅡ，C?NstretchingandN?Hbendingvibration[15]1514AmideⅡ，N?Hbendingvibration[16]

游離體表面軟骨的膠原分子排列不同于關(guān)節(jié)表面軟骨，實(shí)驗(yàn)組酰胺Ⅱ的波數(shù)位置出現(xiàn)明顯藍(lán)移，表明其膠原分子的穩(wěn)定性更高，而這種異常分泌的穩(wěn)定性更高的軟骨膠原基質(zhì)需要更高的能量來裂解。同處于裂解酶類及炎性因子作用環(huán)境中關(guān)節(jié)表面軟骨的膠原分子因穩(wěn)定性較差則首先發(fā)生裂解，這樣的變化帶來的是反饋調(diào)節(jié)還可以使同在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的正常軟骨更加容易產(chǎn)生裂解退變，加重了骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，并無法維持正常軟骨的功能。

通過對(duì)紅外譜線吸收值進(jìn)行主成分分析之后，在主成分散點(diǎn)圖上可得同時(shí)含有PC_1和PC_2兩種主成分的第一象限中只有對(duì)照組的樣本存在，絕大部分實(shí)驗(yàn)組都位于橫坐標(biāo)軸以下的三四象限，這說明關(guān)節(jié)表面軟骨的主要成分是正常的，游離體表面軟骨卻表現(xiàn)出各種不同成分的缺失，無論是PC_1還是PC_2。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的表層軟骨表現(xiàn)出成分的不同，結(jié)合之前的研究結(jié)果，作為填充物的蛋白多糖未出現(xiàn)變化，而作為軟骨骨架的膠原方面出現(xiàn)了變化，具體部位為構(gòu)成膠原骨架的主鏈結(jié)構(gòu)異常，致使游離體表面軟骨不能等同于關(guān)節(jié)表面軟骨應(yīng)用于臨床軟骨的移植等方面。

膠原主鏈結(jié)構(gòu)上的這種差異體現(xiàn)在細(xì)胞表達(dá)的膠原類型上，就會(huì)出現(xiàn)膠原表型轉(zhuǎn)變或形成螺旋更加偏離非正常結(jié)構(gòu)；體現(xiàn)在組織結(jié)構(gòu)上，出現(xiàn)異常的軟骨排列和分布，這種變化帶來的反饋調(diào)節(jié)使同在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的正常軟骨更加容易產(chǎn)生裂解退變，表現(xiàn)出更多的不穩(wěn)定性和抗擠壓能力差，加重了骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，并無法維持正常軟骨的功能。導(dǎo)致這種情況發(fā)生的原因我們認(rèn)為有以下幾個(gè)方面：a)血供的影響，游離體作為獨(dú)立的個(gè)體與關(guān)節(jié)軟骨不同，無法從軟骨下骨獲得血液帶來的營養(yǎng)物質(zhì)，致使其合成代謝出現(xiàn)變異[20-21]；b)關(guān)節(jié)腔內(nèi)，或者滑膜分泌的某些炎性因子[22]，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、前列腺素E2等激活炎癥通路，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜的炎性增生致使關(guān)節(jié)病變；c)基質(zhì)金屬蛋白酶[23]及其拮抗因子基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑等[24]作用于表面軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)，使膠原骨架裂解破壞。

綜上所述，關(guān)節(jié)表面軟骨與游離體表面的軟骨細(xì)胞，除在細(xì)胞的分布及細(xì)胞基質(zhì)都有一定差距外，更重要的是通過紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)方法分析游離體表面軟骨的膠原組成在膠原分子的主鏈之中C-N鍵穩(wěn)定性差。游離體表面軟骨中膠原的主鏈結(jié)構(gòu)存在不穩(wěn)定性。說明游離表面軟骨的形成與關(guān)節(jié)軟骨雖然同在一個(gè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)，但是他們的生理環(huán)境卻不相同，表現(xiàn)在兩者的軟骨基質(zhì)成分，尤其是膠原存在差異性，同時(shí)也表明游離體的生成與骨關(guān)節(jié)炎有密切的相關(guān)性。

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The Comparative Research of Knees’ Articular Surface Cartilage and Loose Body’s Surface Cartilage Using Fourier Transform Infrared Spectroscopic Imaging

Fan Jiaqiang1，Yuan Juhui2，Hao yunjia1，et al

(1.Department of Orthopedics，Central Hospital of Xuzhou，Xuzhou 221009，China；2.China-Japan Fellowship Hospital，Changchun 130033，China)

Objective To study the difference between articular surface cartilage and loose body’s surface cartilage.Methods The knees’ articular surface cartilage and loose body’s surface cartilage were collected research objects，using Fourier Transform Infrared Spectroscopic Imaging and Principle Component Analysis to explore the different of the two samples.Results There was no different in the total PGs content of the two samples calculated by an indirection method.N-H bending vibration wavenumber of collagen in the second derivative peaks (in articular surface cartilage is 1 514 cm-1，in the loose body is 1 516 cm-1) and N-H bending vibration and C-N stretching vibration wavenumber of Amide Ⅱ in the second derivative peaks (in articular cartilage is 1 573 cm-1，in the loose body is 1 575 cm-1) showing up an obvious blue shift.PCA shows that the articular surface cartilage was mainly distributed in the first quadrant，and the loose body was mainly distributed in the three or four quadrant.Conclusion The component of loose body surface cartilage，especially collagen has some deficient compared with articular surface cartilage.

articular；cartilage；fourier transform infrared spectroscopic；loose body；principle component analysis

1008-5572(2017)04-0328-05

吉林省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(201215056)；*本文通訊作者：王愛國

R322.7+2

B

2016-08-15

范家強(qiáng)(1988-)，男，醫(yī)師，江蘇省徐州市中心醫(yī)院，221009。

范家強(qiáng)，苑舉輝，郝云甲，等.膝關(guān)節(jié)表面軟骨與游離體表面軟骨FT-IR光譜成像的對(duì)比研究[J].實(shí)用骨科雜志，2017，23(4)：328-332.