劉 楓，趙 群，戴 軍，陳存武，陳乃富，韓邦興

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.安徽省石斛產(chǎn)業(yè)化開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 六安 237012)

DNA分子標(biāo)記技術(shù)在石斛屬鑒別中的應(yīng)用進(jìn)展

劉 楓1，2，趙 群1，3，戴 軍1，3，陳存武1，3，陳乃富1，3，韓邦興1，3

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.安徽省石斛產(chǎn)業(yè)化開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 六安 237012)

DNA分子標(biāo)記是基于物種間遺傳物質(zhì)差異的最直接反應(yīng)，結(jié)果穩(wěn)定可靠可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)中藥鑒定中的不足。本文基于DNA測(cè)序分析和PCR方法的DNA分子標(biāo)記技術(shù)的兩個(gè)方面，對(duì)近些年石斛屬的分子鑒別研究進(jìn)行闡述。文獻(xiàn)顯示，在涉及石斛屬鑒別的DNA序列片段中，以核基因組中的ITS序列、葉綠體基因組的matK、rbcL和psbA-trnH等基因片段應(yīng)用較多；而在PCR的方法中，以SSR、RAPD、AFLP等標(biāo)記技術(shù)相對(duì)普遍。本文通過對(duì)不同分子技術(shù)手段的比較，以期為其余石斛種的研究奠定基礎(chǔ)，也為市場(chǎng)交易中石斛的鑒別提供參考資料。

石斛屬；中藥鑒別；DNA測(cè)序分析；PCR方法

石斛屬Dendrobium為蘭科大屬，約有1 500余種，主要分布在亞洲、大洋洲等熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國(guó)含有76種，包括2個(gè)變種[1](P153)，多作為觀賞植物，部分也作藥用石斛被收錄于《中國(guó)藥典》，具有益胃生津、滋陰清熱等功效[2](P92)。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，石斛中的石斛多糖、石斛堿等化學(xué)成分具有明顯的藥理活性，在抗氧化、抗腫瘤方面效果顯著[3-4]。在該屬中，物種在形態(tài)上極其相似，變異較小，多數(shù)種需在開花期才能進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別，且不同地方的同種石斛種內(nèi)變異也較大，難以區(qū)分。而通過化學(xué)、顯微等傳統(tǒng)鑒別的方法雖然能夠?qū)Σ糠质N進(jìn)行鑒別[5]，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且結(jié)果易受材料的產(chǎn)地、采摘時(shí)期、儲(chǔ)存條件的影響，具有一定的局限性。

近年來，各種分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛地運(yùn)用于藥用動(dòng)植物的鑒別研究當(dāng)中，如DNA barcoding，RAPD、AFLP、SSR等，由于結(jié)果穩(wěn)定可靠且不受上述多種因素的影響，已成為中藥鑒別研究中的熱點(diǎn)而被普遍關(guān)注。分子鑒定主要是基于各物種間DNA序列上的堿基位點(diǎn)的差異，包括替換、缺失、插入等，有單個(gè)核苷酸位點(diǎn)的差異(SNPs)，也有序列長(zhǎng)度的差異(ISSR、SSR等)，針對(duì)不同的變異類型設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)疑難物種進(jìn)行鑒別。目前，用于石斛屬分子標(biāo)記技術(shù)可分為兩類：1)直接測(cè)序-基于DNA測(cè)序分析分子標(biāo)記技術(shù)；2)基于PCR方法的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。在石斛屬中，除了鑒別之外，分子技術(shù)在石斛育種、資源保護(hù)、遺傳圖譜構(gòu)建等方面也常見報(bào)道[6]。

由于我國(guó)石斛藥用歷史悠久，但不同石斛所含化學(xué)成分可能有所不同，而部分偽品的出現(xiàn)為臨床的藥用安全帶來了隱患。此外，石斛屬中部分石斛(如霍山石斛D.huoshanense)價(jià)格昂貴，偽品的流通也使得消費(fèi)者的財(cái)產(chǎn)遭受嚴(yán)重?fù)p失。因此，本文對(duì)石斛屬的鑒別研究進(jìn)行綜述，通過不同分子技術(shù)手段的比較，以期為其余石斛種的研究奠定基礎(chǔ)，也為實(shí)際交易中石斛的鑒別提供參考資料。

1 基于DNA測(cè)序分析分子標(biāo)記技術(shù)

2003年，Hebert首次提出以一段DNA片段對(duì)物種進(jìn)行鑒別。隨后，多種DNA序列片段被作為潛在條形碼應(yīng)用到石斛屬的鑒別當(dāng)中，來源包括核基因rDNA、葉綠體基因cpDNA和線粒體基因mtDNA，涉及的候選片段有核糖體DNA中的LEAFY(LFY)同源基因[7]、ITS序列，葉綠體DNA中的編碼基因matK、rbcL、rpoB、rpoC1、rps16和非編碼區(qū)psbA-trnH、psbK-psbI[8]序列以及線粒體DNA中的nad1 intron2序列等。在石斛屬中，以核糖體DNA中內(nèi)間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)ITS序列運(yùn)用最多，其次為葉綠體基因cpDNA。

1.1 核糖體DNA

核糖體DNA位于細(xì)胞核內(nèi)，可分為編碼區(qū)(如5.8S、16S、18S等)和非編碼區(qū)(如ITS序列)。但是，由于編碼區(qū)受自然選擇壓力大，變異位點(diǎn)較少，具有高度保守性，難以作為石斛屬分類鑒定的序列片段[9]。而nrITS序列(Internal Transcribed Spacer)為內(nèi)間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)，所受選擇壓力較小，目前已被廣泛用于石斛屬的鑒別研究，可見表1。石斛屬物種繁多，分化時(shí)間較短，部分種尚未分化完全[10]，種間變異較少，在已報(bào)道的數(shù)據(jù)中，ITS序列雖然具有一定鑒別能力，但對(duì)于親緣關(guān)系更近的石斛卻無能為力。因此，黃海[11]建議采用不同目的序列的聯(lián)合片段對(duì)石斛屬進(jìn)行DNA barcoding鑒定。Xu[12]通過對(duì)186種石斛1698條序列分析認(rèn)為ITS+matK聯(lián)合片段可作為石斛的核心條形碼。Singh13]利用ITS、matK、rbcL、psbA-trnH、rpoB、rpoC1的單獨(dú)序列和聯(lián)合片段對(duì)36種石斛分析，結(jié)果表明，單一序列ITS、兩片段聯(lián)合matK+rbcL、三片段聯(lián)合rpoB+rpoC1+matK在各水平中鑒別效率最高。

表1 ITS序列在石斛屬鑒別中的應(yīng)用

1.2 葉綠體DNA

葉綠體DNA為質(zhì)體基因，多為單性遺傳，在物種群體遺傳及進(jìn)化方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。此外，相對(duì)于核糖體DNA來說，質(zhì)體基因多以單拷貝形式存在，無多倍體現(xiàn)象，在基因同源性上爭(zhēng)論較少。石斛屬cpDNA為閉合環(huán)狀雙鏈DNA，由一個(gè)大單拷貝區(qū)(Large single copy， LSC)、兩個(gè)反向重復(fù)序列區(qū)(IRa和IRb)和一個(gè)小單拷貝區(qū)(Small single copy，SSC)組成。目前，運(yùn)用較多片段也都分布在LSC區(qū)，如rbcL、matK、psbA-trnH等。

rbcL和matK同為編碼基因。其中，rbcL基因編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亞基，長(zhǎng)約1400 bp，但進(jìn)化速率慢，較為適合親緣關(guān)系較遠(yuǎn)或科級(jí)以上的研究。而matK基因編碼絡(luò)氨酸蛋白激酶，參與RNA轉(zhuǎn)錄中II型內(nèi)含子的剪切，長(zhǎng)度約為1.5 kb，被認(rèn)為是cpDNA中編碼基因進(jìn)化速率最快的基因[22]。Asahina[23]用rbcL和matK基因?qū)?種石斛進(jìn)行區(qū)分，結(jié)果matK能夠明顯區(qū)分5種石斛，而rbcL區(qū)分效果不明顯。YAO[24]利用rbcL基因可對(duì)市場(chǎng)上D.officinale的種苗及其偽品進(jìn)行區(qū)分，但認(rèn)為將rbcL作為石斛屬的條形碼仍需進(jìn)一步的研究。但聯(lián)合片段rbcL+matK對(duì)36種石斛鑒別的成功率為86.11%。由此可見，rbcL不適合作為單獨(dú)序列對(duì)石斛屬進(jìn)行鑒別。然而，matK基因在不同研究中，結(jié)果差異較大[13]，因此，在能否作為石斛屬的候選條形碼仍需要深入研究。

psbA-trnH是cpDNA中psbA和trnH基因之間長(zhǎng)度約300 bp的片段，由于位于非編碼區(qū)，其進(jìn)化速率大大快于rbcL和matK基因。邵世光[25]等構(gòu)建15種楓斗類石斛的psbA-trnH數(shù)據(jù)庫，并成功鑒定了待檢種。YAO[26]等對(duì)17種石斛的psbA-trnH序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種間變異系數(shù)為1.2%(0.3%～2.3%)，種內(nèi)變異為0%～0.1%，認(rèn)為psbA-trnH可作為石斛的鑒別條形碼。但不足的是，psbA-trnH序列中存在的poly結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致擴(kuò)增成功率較低，使其在鑒別中的應(yīng)用受到限制[27]。

1.3 線粒體DNA

在動(dòng)物的分子鑒別中，以線粒體基因COI作為通用條形碼，但在植物中，線粒體基因進(jìn)化速度慢，遺傳分化小，而并不適用于植物。目前，也只有nad1 intron2(NADH脫氫酶亞基1編碼基因內(nèi)含子2)用于石斛屬的鑒別中。張婷[28]等發(fā)現(xiàn)nad1 intron2中有17個(gè)變異位點(diǎn)，可以鑒別除D.loddigesii之外的其余8種石斛。隨后，李國(guó)良[29]也利用nad1 intron2及其他聯(lián)合片段對(duì)D.huoshanense和D.officinale展開了研究。

2 基于PCR方法的分子標(biāo)記技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymearse Chain Reaetion，PCR)是在體外進(jìn)行的酶促合成特異性核酸片段的技術(shù)，基于PCR技術(shù)開發(fā)的各種分子標(biāo)記方法也已廣泛應(yīng)用于中藥的鑒定和多態(tài)性研究中[30]。目前，在石斛屬中，以簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeats，SSRs)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Radom amplified polymorphic DNAs，RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性DNA(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)等技術(shù)應(yīng)用較為普遍。

2.1 微衛(wèi)星標(biāo)記DNA

微衛(wèi)星DNA又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeats，SSRs)，由中央核心重復(fù)序列和兩端側(cè)翼序列組成，廣泛的分布在真核生物的基因組中[31]。此外，在基于微衛(wèi)星的基礎(chǔ)上，又開發(fā)出一種新的ISSR(Inter-simple sequence repeats)技術(shù)，與SSR相同的是，都是基于基因序列中簡(jiǎn)單重復(fù)序列，依據(jù)高度的多態(tài)性，對(duì)物種進(jìn)行遺傳多樣性分析和鑒別[32]。與RAPD、AFLP等技術(shù)相比，SSR和ISSR具有的多態(tài)性更豐富、更高。由于SSR和ISSR即具有特異性，又具有一定的種間通用性[33]。因此，在石斛屬中，開發(fā)出來的SSR和ISSR分子標(biāo)記可以在同屬內(nèi)通用，一定程度上節(jié)約了研究成本。

近年來，微衛(wèi)星標(biāo)記在石斛屬中的應(yīng)用越來越多，據(jù)統(tǒng)計(jì)，已有報(bào)道的就有D.huoshanense[34]、D.officinale[35]、D.nobile[36]、D.crystallinum[37]等。在石斛屬的鑒別研究中，Shen[38]等從76條ISSR引物中挑選出10條對(duì)來自8個(gè)居群的鐵皮石斛進(jìn)行擴(kuò)增，得到16條特異性條帶可有效區(qū)別出不同居群的鐵皮石斛。劉明珍[39]等為檢測(cè)霍山石斛及其相似種之間的差異，先后利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建研究石斛的指紋圖譜，對(duì)霍山石斛及其相似種鑒別。除了鑒別之外，微衛(wèi)星標(biāo)記在石斛屬的種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性上也有較多應(yīng)用[40-41]。

2.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA

1990年，Welsh[42]提出RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，以不同基因組DNA作為模板，引入人工合成單隨機(jī)寡聚核苷酸作為引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，對(duì)擴(kuò)增得到的不同長(zhǎng)度目的片段，構(gòu)建DNA指紋圖譜，對(duì)近緣物種進(jìn)行鑒別。由于事先不需知道模板DNA序列，且操作簡(jiǎn)單快捷、所需DNA量微少等特點(diǎn)，在石斛屬中運(yùn)用較多。目前，RAPD技術(shù)已在D.officinale、D.loddigesii、D.nobile等石斛屬植物鑒別研究中得到應(yīng)用。

張銘[43]等用對(duì)Dendrobium屬的26個(gè)種進(jìn)行了RAPD多態(tài)性分析，根據(jù)篩選到的特異性片段，將Sangon18引物從3’端延長(zhǎng)至20 bp，設(shè)計(jì)成的特異性引物對(duì)D.officinale進(jìn)行快速有效鑒別。此外，利用UPGAM聚類分析的方法對(duì)石斛屬的鑒別研究也有較多報(bào)道。朱勝男[44]等用18條RAPD引物對(duì)31種石斛進(jìn)行聚類分析，31種石斛形成7個(gè)分支，供試樣品也完全被區(qū)分開。除了種間，較高多態(tài)性使得RAPD標(biāo)記對(duì)于種內(nèi)不同居群間的石斛也能夠進(jìn)行鑒別。盡管RAPD技術(shù)可以用于石斛屬植物的物種鑒定和遺傳多樣性研究，但是由于RAPD技術(shù)結(jié)果重復(fù)性差等自身因素的限制，近些年來，在鑒別上應(yīng)用也相對(duì)減少。

2.3 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性DNA

在RAPD技術(shù)提出之后，以分子雜交技術(shù)RFLP(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)和RAPD技術(shù)相結(jié)合的新型分子標(biāo)記AFLP誕生。該技術(shù)既具有RFLP的穩(wěn)定性，又具有RAPD的簡(jiǎn)便性，在多態(tài)性和重現(xiàn)性上都要比RAPD要高，因此，在指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性研究上也更廣泛[45]。鄭勇平等利用熒光AFLP技術(shù)對(duì)春石斛30個(gè)引進(jìn)品種和雜交品種進(jìn)行分析，并構(gòu)建春石斛新品種的DNA指紋圖譜[46]。Wang等利用3種組合引物擴(kuò)增13種石斛的基因片段構(gòu)建指紋圖譜，并通過Nei相似性和UPGAM聚類分析，在得到346個(gè)片段中，有342個(gè)為多態(tài)性，多態(tài)性率為98.8%，為石斛的遺傳關(guān)系和分類鑒別研究提供了有效的技術(shù)手段[47]。

除了上述常見方法之外，SSH-array、AP-PCR、ARMS、PCR-RELP、SCAR等基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)也都相繼用于石斛屬的鑒別研究中。同時(shí)，各種新型DNA標(biāo)記技術(shù)在石斛屬中廣泛應(yīng)用也標(biāo)志著分子鑒別在理論和方法學(xué)上的日益成熟。

3 總結(jié)與展望

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)不僅能夠?qū)κM(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別，彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒別的不足，而且DNA分子標(biāo)記也為石斛屬的分子育種、種質(zhì)保護(hù)等方面提供了新的技術(shù)手段。從文中可以看出，在目前石斛屬的分子鑒別研究中，利用測(cè)序獲得DNA目的片段的方法較為普遍，其中，以核糖體DNA中的內(nèi)間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)ITS序列應(yīng)用最多，其次為葉綠體DNA，而在cpDNA中，蛋白編碼的matK基因鑒別效果要高于其他葉綠體序列而備受青睞。此外，隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的基因序列被測(cè)出，從整個(gè)發(fā)展趨勢(shì)來看，也由單一片段向多基因聯(lián)合片段轉(zhuǎn)換。在所有石斛屬鑒別研究中，國(guó)內(nèi)研究相對(duì)于國(guó)外要較多，且對(duì)于各種分子標(biāo)記技術(shù)的在石斛屬中的應(yīng)用也走在國(guó)際前沿。但是，在整個(gè)的研究中，使用的基因片段仍舊多是CBOL和China Plant BOL Group提出的幾種(ITS、matK、rbcL、psbA-trnH)[48]，新型片段的開發(fā)應(yīng)用較少，對(duì)于部分疑難物種的鑒別依舊無法解決。而且，在一些研究中，對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證存在問題，多數(shù)實(shí)驗(yàn)缺乏大規(guī)模的樣本檢驗(yàn)。此外，在所綜述的分子標(biāo)記手段中，多數(shù)方法耗時(shí)耗力(如RAPD、AFLP等)，不利于推廣和實(shí)際運(yùn)用，為石斛屬分子鑒別帶來一定的限制。

因此，在今后的研究中，要注重新型片段的開發(fā)和樣本量的提高，參考相似種石斛的研究結(jié)果，實(shí)現(xiàn)成果轉(zhuǎn)移，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。通過已經(jīng)研究得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，尋找特異性強(qiáng)的位點(diǎn)或片段，設(shè)計(jì)特異性引物，運(yùn)用直觀的檢測(cè)方法，對(duì)石斛屬進(jìn)行鑒別，并且制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，實(shí)現(xiàn)分子鑒別的標(biāo)準(zhǔn)化。

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The Research Progress of Molecular IdentificationforDendrobiumSpecies

LIU Feng1,3, ZHAO Qun1,3, DAI Jun1,3, CHEN Cunwu1,3,CHEN Naifu1,3, HAN Bangxing1,3

(1.WestAnhuiUniversity,Lu’an237012,China；2.AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230012,China；3.SynergeticInnovationCenterofDendrobiaIndustrializationDevelopmentinAnhuiProvince,Lu’an237012,China)

DNA molecular marker technology is the essential response to the difference between species, the result is stable and reliable and make up for the deficiency of the traditional medicine identification. Therefore, this paper reviewed the research developments of identification ofDendrobiumspecies based on DNA sequences and PCR methods of DNA molecular biological technology. The existing documents revealed that DNA sequences used in identification ofDendrobiummainly include nuclear ITS, chloroplastrbcL,matK,psbA-trnH, and in the PCR molecular techniques, SSR, RAPD, AFLP are relatively common. The different molecular techniques are compared in order to lay the foundation for the research of otherDendrobiumspecies and provided the references for identification ofDendrobiumin practical trade.

Dendrobium; identification of TCM; DNA sequencing analysis; PCR methods

2017-02-14

國(guó)家林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目(2015-LY-152)；國(guó)家農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化示范區(qū)項(xiàng)目(SEQ8-109)；安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目([2014]162)；安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2013B329)。

劉楓(1992-)，男，安徽六安人，碩士研究生，研究方向：分子生藥學(xué)。

R282.71

A

1009-9735(2017)02-0009-05