陳 蓉，唐弼熙，李 敏，周虹延，張 佩，朱源志，蘇 遠，陳興華，何純蓮

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙410006）

優(yōu)選維Vitamin C測定方法在果蔬中的應(yīng)用

陳 蓉，唐弼熙，李 敏，周虹延，張 佩，朱源志，蘇 遠，陳興華，何純蓮

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙410006）

目的：為完善藥品、食品中維生素C含量測定方法，指導(dǎo)合理攝入維生素C，正確推廣健康飲食，找到一種準確快速測定維生素C含量的方法。方法：采用直接碘量法、2，6-二氯酚靛酚法、紫外分光光度法、熒光分光光度法測定維生素C的含量，系統(tǒng)比較維生素C含量測定的方法優(yōu)缺點。結(jié)果：直接碘量法、2，6-二氯酚靛酚法、紫外分光光度法、熒光分光光度法（鄰苯二胺體系、苯甲酸體系）測得維生素C片中維生素C的含量絕對誤差分別為0.094mg/mL，0.095mg/mL，0.357mg/mL，0.120mg/mL，0.009mg/mL。結(jié)論：在苯甲酸體系，采用熒光分光光度法測得維生素C的含量準確度高，操作簡易，方便應(yīng)用于果蔬中 維生素C測定。

維生素C；熒光分光光度法；紫外分光光度法；2，6-二氯酚靛酚法

維生素C（VitaminC）是人體必需營養(yǎng)素，其藥理及多種生理活性已得到證實［1-4］，作為純粹藥物或食品添加劑已被廣泛應(yīng)用。然而，研究表明過高劑量的VC（達2g/d）可能增加細胞DNA對H2O2或其它有害物質(zhì)損害的敏感性［5］，同時對DNA可能產(chǎn)生多方面的損傷，如阻礙DNA修復(fù)合成、抑制DNA半保留復(fù)制、破壞核苷酸、斷裂DNA、引起基因突變或染色體損傷等，因此建立快速準確測定VC的方法尤為重要。目前維生素 C含量的測定方法很多，有碘滴定法、高效液相色譜法、2，6-二氯酚靛酚法、極譜法、2，4-二硝基苯肼比色法、熒光分光光度法、電化學(xué)法、鉬藍比色法、過氧化酶法等。但這些方法都有一定的缺陷，如中國藥典中采用的置換碘量法在測定深色樣品時，準確度欠佳［6］；反相HPLC 法用于復(fù)雜基體的樣品測定比較困難［7］；2，6-二氯酚靛酚法利用 DCIP 染料滴定果蔬提取液，滴定終點為紅色，如果待測果蔬呈紅色，提取液本身顏色會干擾滴定終點的觀察，若對果蔬提取液進行脫色處理后利用該法測定深色果蔬中維生素C的含量，準確度和精密度依然欠佳。極譜法測定實驗過程中所用汞蒸氣有毒，且毛細管易堵塞［8］。酶分析法成本低廉，快速，且不需要對被分析物預(yù)先提純，由于目前提高常規(guī)法自動化程度的趨勢限制酶分析法的廣泛應(yīng)用［9］等。

本研究通過對維生素C含量測定方法進行系統(tǒng)比較研究，旨在找到一種準確快速維生素C分析方法，完善藥典和食品中維生素C含量測定的國家標(biāo)準，指導(dǎo)合理攝入維生素C，正確推廣健康飲食。

1 資料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

1.1.1 儀器 紫外分光光度計：LabTech BlueStar，電熱恒溫水浴鍋：DK-98-1A型，天津市泰斯特儀器有限公司，熒光分光光度計：LS-45/55（美國PE公司），高速冷凍離心機（thermo scientific FRESC017）。

1.1.2 試劑 抗壞血酸，無水乙酸鈉，十六烷基三甲基溴化銨，冰醋酸，乙酸鈉，硼酸，鄰苯二胺，碘化鉀，氧化砷，碳酸氫鈉，2，6-二氯靛酚鈉，鹽酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），硫酸（株洲磺化玻有限公司），偏磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），高嶺土，苯甲酸（上海山浦有限公司），硫酸銅（天津市博迪化工有限公司）。實驗所用試劑均為分析純；實驗所用水均為二次蒸餾水。

1.1.3 材料

1.1.3.1 維生素C 標(biāo)準溶液，精密稱定1.0g維生素C標(biāo)準品，溶解，定容至1000mL容量瓶，得到1.0mg/mL維生素C標(biāo)準溶液，備用。

1.1.3.2 果蔬樣品 稱水果（橙子，草莓等）樣品各 100 g 加 100 mL偏磷酸-乙酸溶液，倒入研缽內(nèi)研成勻漿。用百里酚藍指示劑調(diào)試勻漿酸堿度，若呈紅色，立即用偏磷酸-乙酸溶液稀釋；若呈黃色或藍色則用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀釋。用干凈紗布過濾一次，再用高速冷凍離心機離心取上清液，備用。

2 結(jié)果

通過直接碘量法、2，6-二氯酚靛酚法、紫外分光光度法、熒光分光光度法（鄰苯二胺體系、苯甲酸體系），從精密度、準確度、檢測限、回收率考察VC含量的測定方法，完善藥典和食品中維生素C含量測定的國家標(biāo)準，指導(dǎo)合理攝入維生素C，正確推廣健康飲食。

2.1 直接碘量法 維生素C烯二醇基具有還原性，能被I2定量地氧化成二酮基，因而可用I2標(biāo)準溶液直接測定。C6H8O6＋I2= C6H6O6＋2HI

2.1.1 方法 精確量取維生素C標(biāo)準溶液1.00mL，加入10mL HAc（2mol/L）和1mL淀粉指示劑（10g/L），立即用0.05mol/Ll I2標(biāo)準滴定溶液滴定至穩(wěn)定的淺藍色，即為終點。計算維生素C濃度。

2.1.2 結(jié)果性染料，可將還原態(tài)的維生素C氧化成脫氫維生素C，而染料本身從深藍色被還原成無色的衍生物。2，6-二氯酚靛酚鈉在酸性條件下呈紅色。在滴定終點之前，滴下的2，6-二氯酚靛酚鈉立即被還原成無色。當(dāng)溶液從無色轉(zhuǎn)變成微紅色時，即為滴定終點。

表1 直接碘量法

2.2.1 方法 取2，6-二氯酚靛酚230mg，加入適量4%HCl使其溶解，加210mgNaHCO3，500 mL蒸餾配成標(biāo)準溶液，使用前過濾，取續(xù)濾液。精確量取標(biāo)準維生素C標(biāo)準溶液5.00 mL，加入10 mL 2mol/L HAc 至錐形瓶中，用2，6-二氯酚靛酚標(biāo)定，直至出現(xiàn)微紅色30秒不退色為終點。計算VC的含量

2.2.2 結(jié)果

表2 2，6-二氯酚靛酚法

2. 3 紫外分光光度法 維生素 C 在紫外區(qū) 246.0nm 處有最大吸收，并且線性良好因此可以采用紫外分光光度法進行測量。

2.3.1 方法

2.3.1.1 建立標(biāo)準曲線 取維生素C標(biāo)準溶液10.00mL，用10%HCl定容至100.00mL，得維生素C標(biāo)準儲備液，從中取0.00mL、1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL，5.00mL，6.00mL維生素C標(biāo)準儲備液，定容至50.00mL，以蒸餾水做參比，在246.0nm處測定吸光度，繪制吸光度A與濃度C的標(biāo)準曲線。

2.3.1.2 VC含量的測定 精確量取維生素C標(biāo)準樣品溶液1.00mL，用10%HCl定容至100.00mL，以蒸餾水做參比，波長246.0nm處測定吸光度。

2.3.2 結(jié)果

圖1 紫外分光光度法標(biāo)準曲線

表3 紫外分光光度法

2.4 熒光分光光度法-鄰苯二胺體系 維生素C樣品在酸性條件下經(jīng)活性炭氧化成脫氫抗壞血酸，與鄰苯二胺反應(yīng)生成有熒光的喹唔啉，測定喹唔啉熒光值，計算維生素 C 的含量。

2.4.1 方法

2.4.1.1 建立標(biāo)準曲線 精密量取10.00mL維生素C標(biāo)準液至100.00mL容量瓶用蒸餾水稀釋至刻度，加入2g活性炭，過濾，收集續(xù)濾液，作為標(biāo)準氧化儲備液，備用，精密量取1.00mL，2.00 mL，3.00 mL，4.00 mL標(biāo)準氧化儲備液，于50mL容量瓶中，加入5mL硼酸-醋酸鈉（3%），用蒸餾水定容至50.00mL，搖勻，得標(biāo)準氧化液，取上述標(biāo)準氧化液5.00mL，加入鄰苯二胺溶液（0.02%）5mL，混合反應(yīng)35分鐘，測定熒光強度。以不含鄰苯二胺作為空白對照液，以濃度為橫坐標(biāo)、熒光強度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準曲線。

2.4.1.2 含量的測定 精確量取10.00mL維生素C標(biāo)準樣品液置100.00mL容量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，加入2g活性炭，過濾，棄去初濾液，收集濾液，作為標(biāo)準樣品氧化儲備液，備用。取1.00mL標(biāo)準樣品氧化儲備液置于50mL容量瓶中，加入5mL硼酸-醋酸鈉，用水稀釋至刻度，搖勻，從中取1.00mL，加入鄰苯二胺溶液5mL，混合反應(yīng)35分鐘，測定熒光強度，以不含鄰苯二胺作為空白對照液。

2.4.2 結(jié)果

表4 熒光分光光度法-鄰苯二胺體系

2.5 熒光分光光度法-苯甲酸體系

2.5.1 原理 維生素 C經(jīng)Cu2+氧化為脫氫抗壞血酸，與苯甲酸及十六烷基三甲基溴化銨產(chǎn)生熒光協(xié)同增敏作用。

2.5.2 方法

2.5.2.1 建立標(biāo)準曲線 精密量取維生素C標(biāo)準溶液5ml，加入適量10%鹽酸溶液，加蒸餾水定容至

100.00 mL，得到5μg/mL VC稀釋液。取5個50mL容量瓶，加入1.20mL硫酸銅（0.2%）、4.00mL十六烷基溴化銨溶液（0.06%）、4.00mL苯甲酸（0.01%），再向5個容量瓶中依次加入1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL，5.00 mL 維生素C稀釋液后加入10.00mL磷酸氫二鈉-磷酸氫二鉀緩沖溶液，定容，搖勻。在35℃恒溫水浴加熱

30min，在發(fā)射波長417nm處測定熒光強度F，無VC試劑為空白F0，記為△F=F-F0。

2.5.2.2 含量的測定 精確量取維生素C標(biāo)準樣品溶液10mL，加入適量10%HCl，于100mL容量瓶中，定容，搖勻，得維生素C標(biāo)準樣品儲備液。在50mL的容量瓶中加入1.20mL硫酸銅、4mL十六烷基溴化銨溶液、4mL苯甲酸，一定體積維生素C標(biāo)準樣品儲備液，10mL磷酸氫二鈉-磷酸氫二鉀緩沖溶液，定容。在35℃恒溫水浴加熱30min，冷卻至室溫，在發(fā)射波長417nm處測定熒光強度F，無VC試劑為空白F0，記為△F=F-F0。

2.5.3 結(jié)果

表5 熒光分光光度法-苯甲酸體系

圖2 熒光分光光度法-苯甲酸體系

圖3 熒光分光光度法-苯甲酸試驗

2.6 橙子中VC含量測定，優(yōu)選測定方法

表6 五種方法測定橙子比較結(jié)果（n=3）

經(jīng)過五種方法的比較，我們發(fā)現(xiàn)熒光法（苯甲酸）體系測定VC含量準確度高，由此構(gòu)建熒光法（苯甲酸）體系進行方法學(xué)驗證。

2.7 熒光法（苯甲酸）體系方法學(xué)驗證。

2.7.1 穩(wěn)定性試驗 將體系放置不同的時間進行測定。當(dāng)放置 15min時，體系的熒光強度達到最大值并趨于穩(wěn)定。

圖4 穩(wěn)定性試驗

2.7.2 共存離子干擾試驗 測定濃度為 2μg / m L的維生素 C時，當(dāng)允許誤差在5%以內(nèi)時，共存離子的允許量如表7所示。

表7 共存離子允許量

2.7.3 工作曲線、線性范圍、檢出限 配制濃度為0.00，0.01，0.02，0.08，0.10，0.50，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00，10.00，12.00，14.00 u g/mL的系列維生素C標(biāo)準工作溶液。按實驗方法進行測定，以熒光強度F對維生素C的濃度。（μg/mL）進行線性回歸，結(jié)果見圖5。維生素C濃度在0.02 ～8.0 μg /mL范圍內(nèi)，與熒光強度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為F = 124.18c+ 14.63相關(guān)系數(shù)為0 9998；檢出限為0.0065μg/mI。

圖5 工作曲線

2.7.4 精密度試驗 對3.0 μg /mL的維生素C標(biāo)準工作溶液測定6次，測定結(jié)果見表8。由表8可知，其相對標(biāo)準偏差為 0. 12%。

表8 精密度試驗結(jié)果

2.7.5 測定果蔬中VC 用熒光分析法（苯甲酸體系）以下五種果蔬中的維生素C進行測定，實驗結(jié)果見表9。

表9 果蔬中VC測量結(jié)果

3 討論

通過用多種方法對比和分析同一批次的維生素C含量，發(fā)現(xiàn)在苯甲酸體系中，熒光分光光度法測定維生素C具有操作簡單，準確度高，檢出限低，專屬性強等優(yōu)點，優(yōu)選為維Vitamin C 測定方法，該法可應(yīng)用于水果、蔬菜和藥物中維生素C的檢測，適于推廣。

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The preferentialvitamin Canalysis methods apply to fruits and vagetables

Chen Rong, Tang Bi-xi, Li Min, Zhou Hong-yan, Zhang Pei, Zhu Yuan-zhi, He Chun-lian
(Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410006, China)

Objective To find a accurate and easier acceptable analysis methods, perfecting the pharmacopoeia and the national standard for the determination of vitamin C content in food, and to guide the reasonable intake of vitamin C, right to promote a healthy diet. Methods Comparing with five kinds of method systemly for determination of vitamin C content［2, 6-Dichlorophenol indophenol method, uv spectrophotometry, fluorescence spectrophotometry(o-phenylendiamine), fluorescence spectrophotometry(benzoic acid)］, and analysis the advantages and disadvantages of each method. Results The results shows that 2, 6-Dichlorophenol indophenol method, uv spectrophotometry, fluorescence spectrophotometry(o-phenylendiamine), fluorescence spectrophotometry(benzoic acid)measured the content of vitamin C in the vitamin C absolute error were 0.095mg/mL, 0.094mg/mL, 0.357mg/mL, 0.120mg/mL, 0.009μg/mL Conclusion The method of the most suitable for determination of vitamin C is fluorescence spectrophotometry(benzoic acid system), The vitamin Canalysis methods easy to be applied to fruits and vagetables.

vitamin C; fluorescence spectrophotometry; uv spectrophotometry; 2, 6-Dichlorophenol indophenol method

R652.1

A

1673-016X（2017）02-0186-04

2016-12-10

教育廳重點項目（NO.12A085）；湖南師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新實驗通訊作者： 何純蓮，E-mail:chunlianhe68@163.com