張楚紅，胡 甜，陽(yáng)學(xué)風(fēng)，李 賽，呂 秀，賀 莎，嚴(yán)漢興，譚貽兮，陳榮如，文美玲，李金成，左建宏

（1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，衡陽(yáng) 421000；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，衡陽(yáng) 421000；3.邵陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)部，邵陽(yáng)422000）

循環(huán)microRNA-122a和microRNA-6086在肝癌診斷及預(yù)后中的作用

張楚紅1，2，胡 甜1，2，陽(yáng)學(xué)風(fēng)1，李 賽1，呂 秀1，賀 莎1，嚴(yán)漢興1，譚貽兮1，陳榮如1，文美玲1，李金成3，左建宏1，2

（1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，衡陽(yáng) 421000；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，衡陽(yáng) 421000；3.邵陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)部，邵陽(yáng)422000）

目的：檢測(cè)肝癌患者血清中miR-122a、 miR-6086含量，研究其在肝癌診斷及預(yù)后中的作用。方法：采用 real-time PCR方法進(jìn)一步檢測(cè)血清中 miR-122a和 miR-6086的表達(dá)水平。 結(jié)果：觀察組血清中 miRNA-122a的相對(duì)含量低于對(duì)照組；miR-6086 的含量高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在不同年齡、分期、分型、腫瘤大小及AFP水平、肝功能等，患者間相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MiRNA-122a的AUC面積為0.842，大于miRNA-6086 的0.782 AUC面積，且對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷的敏感性高于miRNA-6086，特異度無(wú)明顯區(qū)別；MiRNA-6086的表達(dá)量越高患者的生存時(shí)間越短，相反表達(dá)量越低生存時(shí)間越長(zhǎng)；miRNA-122a的表達(dá)量較正常人下調(diào)，但是其生存曲線上低表達(dá)量生存時(shí)間長(zhǎng)于高表達(dá)的生存時(shí)間。結(jié)論：MiRNA-6086、miRNA-122a的表達(dá)水平較正常人有顯著差異，可以作為肝癌診斷及預(yù)后的新指標(biāo)。

肝癌；MiR-122a；MiR-6086

肝細(xì)胞癌（HCC）是消化道最常見的惡性腫瘤，具有侵襲性高、轉(zhuǎn)移率高、病死率高，5年生存率低的特點(diǎn)［1-2］。全世界每年約有70 萬(wàn)人死于HCC，高居全球惡性腫瘤相關(guān)死亡率的第3位［3］。目前HCC患者早期手術(shù)切除的5年生存率不到80%［4］，肝移植后的5 年生存率只有70%左右，而經(jīng)皮射頻消融術(shù)后5年生存率僅有50%［5］。通常在肝癌早期無(wú)特異性癥狀，一旦發(fā)現(xiàn)則進(jìn)入晚期，進(jìn)而失去手術(shù)時(shí)期［6］。因此尋找新的、靈敏度高的診斷方法，對(duì)肝癌的早期診斷，指導(dǎo)治療極為重要［7］。

MicroRNA是一類廣泛存在于真核生物中序列高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)約 20 ～ 24 個(gè)核苷酸，它主要通過(guò)與靶基因信使RNA的 3'非翻譯區(qū)部分或完全互補(bǔ)結(jié)合抑制信使RNA的翻譯或使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)［8-9］。MiRNA存在各種體液中如血液、尿液、眼淚等，并且能在其中穩(wěn)定表達(dá)［10］。MiRNA參與腫瘤的生物調(diào)控機(jī)制，有癌基因和抑癌基因作用［11-12］，檢測(cè)相關(guān)miRNA不僅可以優(yōu)化腫瘤診斷和個(gè)體化治療，而且可以作為判斷疾病預(yù)后的工具［13-14］。越來(lái)越多的研究證實(shí)了肝癌組織與正常組織中的miRNA表達(dá)具有顯著差異，miRNA在肝癌的發(fā)生、分化、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和凋亡階段起著重要的調(diào)控作用［15］。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將 2014 年 10 月～2015 年 12 月在南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院確診并接受治療的 45 例肝癌患者納入實(shí)驗(yàn)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)合臨床癥狀、 體征，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及影像學(xué)、病理學(xué)檢查確診為肝癌；②取得患者知情同意。 參照觀察組患者的基本資料，選擇同期在我院體檢的45例健康者納入研究的對(duì)照組。

1.2 材料 所有實(shí)驗(yàn)材料均購(gòu)買于QLAGEN GMBH德國(guó)公司，包括miRNA 提取、 cDNA 合成以及 real-time PCR 檢測(cè)的試劑盒。熒光定量PCR 儀為 美 國(guó) Life Technologies Applied 公 司 的Biosystems-7500 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 1.3.1 樣本收集 觀察組患者于確診后采集外周血3 mL，對(duì)照組患者于體檢時(shí)采集外周血3mL，室溫下離心機(jī)3600轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上層血清保存于-80℃冰箱，用于 microRNA 檢測(cè)。

1.3.2 MicroRNA 含量檢測(cè) 取出已離心好的血清再次離心，按照文獻(xiàn)的方法用QIAZOL法提取血液樣本的 RNA，按1：5比例加入QIAZOL提取總 mRNA，再用75%乙醇洗滌沉淀出 mRNA 后，用DEPC水溶解待用。按照QLAGEN逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法，在普通 PCR 儀上將溶解的總 RNA 為模版，加入試劑盒提供的逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP 以及反應(yīng)緩沖液，將 mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 °C 保存待用。檢測(cè)時(shí)采用 miRNA 熒光定量 PCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行 real time-PCR 檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用 SPSS 18.0 軟件，T檢驗(yàn)方法分析所有數(shù)據(jù)，采用（均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiRNA-6086、miRNA-122a表達(dá)水平的檢測(cè)在正常人與原發(fā)性肝癌患者血清中的PCR的熒光信號(hào)達(dá)閾值后，讀出各組血清 miRNA-6086、miRNA-122a達(dá)到熒光閾值所需循環(huán)數(shù)（Ct）值，根據(jù)方法中的公式算出血清miRNA-6086、miRNA-122a 的△CT。如表1所示原發(fā)性肝癌患者血清miRNA-6086 水平與正常人血清中相比，明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著意義（P＜0.05）；而血清miRNA-122a水平與正常人血清中相比，明顯下調(diào)，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P＜0.05）。

表1 原發(fā)性肝癌患者與正常人MiRNA -6086 、MiRNA-122a △CT的比較

將肝癌血清miRNA-6086、miRNA-122a的△CT分別與正常組的△CT比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步做統(tǒng)計(jì)圖直觀表達(dá)（如圖1），肝癌miR-6086表達(dá)明顯高于正常人；miRNA-122a表達(dá)低于正常人。

圖1 肝癌患者與正常人血清miRNA散點(diǎn)圖注：A代表miRNA-6086，B代表miRNA-122a

2.2 原發(fā)性肝癌患者循環(huán)miR-6086、miR-122a與其臨床病理資料相關(guān)性分析 對(duì)血清miR-6086、miRNA-122a在不同臨床病理特征中的△CT差異的比較采用SPSS18.0軟件。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)（表2），在不同年齡、分期、分型、腫瘤大小及AFP水平、肝功能等，患者間相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 血清miRNA-6086、miRNA-122a在肝癌診斷中的ROC曲線分析 應(yīng)用ROC曲線分析顯示，在區(qū)分肝癌患者與正常人時(shí)，miR-6086 AUC（曲線下面積）為0.782（95CI：0.688～0.875，P＜0.001）（圖2A），敏感度為71.10%，特異度為71.10%；miRNA-122a的AUC為0.842（95CI：0.756～0.928，P＜0.001）（圖2B），敏感度為95.60%，特異度為71.10%。為進(jìn)一步探討miRNA 與AFP之間關(guān)系，我們將miRNA-6086和miRNA-122a分別聯(lián)合AFP做ROC曲線分析。miRNA-6086聯(lián)合AFP的曲線下面積為0.888（95CI：0.824～0.952，P＜0.001）（圖2C），敏感度為71.10%，特異度為91.10%；MiRNA-122a聯(lián)合AFP的曲線下面積為0.913（95CI：0.854～0.972，P＜0.001）（圖2D），敏感度為95.60%，特異度為83.30%。

表2 血清miR-6086、miR-122a與肝癌臨床病理資料相關(guān)性分析

圖2 肝癌患者與正常人血清miRNA的ROC曲線圖注：A代表miRNA-6086，B代表miRNA-122a；C代表miRNA-6086聯(lián)合AFP，D代表miRNA-122a聯(lián)合AFP

2.4 循環(huán)miRNA-6086及miRNA-122a對(duì)原發(fā)性肝癌患者生存期限關(guān)系的分析 我們將肝癌患者的預(yù)后與miRNA-6086及miRNA-122a的表達(dá)量做了統(tǒng)計(jì)分析。以miRNA-6086及miRNA-122a的平均△CT為界，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)：肝癌患者miRNA-6086的表達(dá)量越高患者的生存時(shí)間越短，相反表達(dá)量越低生存時(shí)間越長(zhǎng)，P＜0.05（圖3A）。 肝癌患者血清miRNA-122a的表達(dá)量較正常人下調(diào)，但是其生存曲線上低表達(dá)量肝癌患者生存時(shí)間長(zhǎng)于高表達(dá)量患者的生存時(shí)間，P＜0.05（圖3B）。

圖3 肝癌患者與正常人血清miRNA生存期限圖注：A代表miRNA-6086，B代表miRNA-122a

3 討論

腫瘤引起患者死亡最主要的原因在于其無(wú)限的生長(zhǎng)及易轉(zhuǎn)移造成相應(yīng)并發(fā)癥引起患者一系列的臨床癥狀，進(jìn)而導(dǎo)致患者死亡。這一過(guò)程受多種基因的調(diào)控，因此對(duì)肝癌生物標(biāo)記物的研究有重要意義，有助于進(jìn)一步診斷肝癌并判斷患者預(yù)后［16］。

目前臨床上常用的肝癌診斷標(biāo)記物為甲胎蛋白（AFP）、 血清谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、胰島素生長(zhǎng)因子（IGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）等［17］，然而這些診斷標(biāo)記物的敏感度和特異度并不十分理想，如AFP 在妊娠婦女、急慢性肝炎、生殖腺腫瘤和胃腸道腫瘤等人群中也可能升高［18-19］。研究表明［20］，外周血中的miRNA不被RNA酶裂解，因此通過(guò)外周血檢測(cè) miRNA，可以用于惡性腫瘤的篩查和診斷。研究報(bào)導(dǎo)一些 miRNA 與HCC 的發(fā)生、發(fā)展、組織分型 分化程度密切相關(guān)［21］，具有組織特異性，提示 miRRNA 可在 HCC 的早期診斷及預(yù)后判斷方面極具臨床價(jià)值。

目前肝功能指標(biāo)、門靜脈高壓、腫瘤狀態(tài)以及體能狀態(tài)等臨床表現(xiàn)均被作為肝癌預(yù)后判斷和治療選擇的參考因素，miRNA可用來(lái)改進(jìn)肝癌分類和預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)［22］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清miRNA-122a水平與正常人血清相比，明顯下調(diào)，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著意義，與前人研究結(jié)果比較一致［23-24］；但其與患者年齡、分期、分型、腫瘤大小及AFP水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚無(wú)其他有關(guān)此方面的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。

同樣目前尚未明確發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清miRNA-6086的研究報(bào)道，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：原發(fā)性肝癌患者血清miRNA-6086水平與正常人血清中相比，明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義，但與患者年齡、分期、分型、腫瘤大小、AFP水平及肝功能等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。比較miRNA-122a與miRNA-6086的ROC曲線，我們發(fā)現(xiàn)miRNA-122a的AUC面積大于miRNA-6086 AUC面積，因此推測(cè)它對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷性越好。MiRNA-6086和miRNA-122a分別聯(lián)合AFP做ROC曲線分析提示兩者的AUC面積均較單獨(dú)分析時(shí)增大，特異度均較單獨(dú)分析時(shí)提高，靈敏度沒(méi)有改變，證明microRNA聯(lián)合AFP可以提高對(duì)肝癌診斷的特異度。肝癌患者循環(huán)miRNA-6086較正常人表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)量越高生存期限越短；但是肝癌患者循環(huán)miRNA-122a較正常人表達(dá)量下調(diào)，且表達(dá)量越低生存時(shí)間反而越長(zhǎng)。綜上本研究證實(shí)，循環(huán)MiRNA-6086、MiRNA-122a的表達(dá)水平較正常人有顯著差異，可以作為診斷肝癌及判斷預(yù)后的參考。

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Role of circulating miRNA-122a and miRNA - 6086 in diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma

Zhang Chu-hong1, 2, Hu Tian1, 2, Yang Xue-feng1, Li Sai1, Lv Xiu1, He Sha1, Yan Han-xing1, Tan Yi-xi1, Chen Rong-ru1, Wen Mei-ling1, Li Jin-cheng3, Zuo Jian-hong1, 2
(1. Nanhua Hospital of University of South China, Hengyang 421000, China; 2. Medical College of University of South China, Hengyang 421000, China; 3. Shaoyang University, shaoyang 422000, China)

Objective The purpose of this study is to investigate the expression of miRNA-6086, miRNA-122a in the serum of normal and primary hepatocellular carcinoma, and to research the relationship between the diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. Methods The miR-122a and miR-6086 in serum were detected by real-time PCR method. Results The relative content of miRNA-122a in the experimental group was lower than that of the control group, but the content of miR-6086 was higher than that of the control group and the difference both were statistically significant. Statistical analysis revealed that there were no significant differences in the relative expression of the patients in different age, stage, classification, tumor size, AFP level, liver function and so on. AUC MiRNA-122a area was 0.842, greater than the 0.782 AUC area of miRNA-6086, which the sensitivity of the diagnosis of HCC was higher than miRNA-6086 and no significant difference in specificity. The higher expression level of miRNA-6086, HCC patients have shorter of survival time; the lower of expression level, HCC patients have longer of survival time. Although the expression level of miRNA-122a was down regulated, the lower expression of patients have longer survival time than the higher expression survival time. Conclusion MiRNA-122a and miRNA-6086 expression levels in the serum of HCC were significantly different from those of normal persons, which could be used as potential targets for the diagnosis and prognosis of HCC.

primary hepatocellular carcinoma; MiRNA-122a; MiRNA-6086

R735.7

A

1673-016X（2017）02-0012-05

2016-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（81272960）；湖南省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2013WK2010，2014SK2015）和天晴肝病研究基金

李金成，E-mail:hnsyljc63@163.com；左建宏，E-mail: 632138414@qq.com