楊 丹，李 懿，陳陽曄，張 冉，李 翔，瞿樹林，張堅(jiān)松，申 麗

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410013）

FilipinⅢ對肺泡巨噬細(xì)胞caveolin-1的影響

楊 丹，李 懿，陳陽曄，張 冉，李 翔，瞿樹林，張堅(jiān)松，申 麗

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410013）

目的：探索FilipinⅢ對肺泡巨噬細(xì)胞caveolin-1的影響。方法：采用肺泡灌洗的方法分離提取小鼠原代肺泡巨噬細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定其純度，Western印跡分析FilipinⅢ處理30min后caveolin-1蛋白水平的變化。利用細(xì)胞系RAW264.7觀察FilipinⅢ處理后15min、30min、1h、2h、4h、6h的caveolin-1的動態(tài)變化。結(jié)果：FilipinⅢ處理30min后原代肺泡巨噬細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞caveolin-1的蛋白水平都有增加。結(jié)論：FilipinⅢ可以提高肺泡巨噬細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞caveolin-1的蛋白表達(dá)。

FilipinⅢ；caveolin-1；caveolae；肺泡巨噬細(xì)胞

FilipinⅢ是一種多烯類抗生素，主要用于真菌感染的治療。它可以選擇性的與細(xì)胞膜上的膽固醇結(jié)合形成復(fù)合體，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的紊亂［1］。小窩（caveolae）是存在于細(xì)胞膜表面的囊狀內(nèi)陷的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，直徑50-100nm，主要由小窩蛋白（caveolins）和脂質(zhì)（膽固醇和鞘磷脂）構(gòu)成。小窩蛋白-1（caveolin-1）是構(gòu)成的caveolae的重要亞單位，在它的參與下，caveolae執(zhí)行了很多重要的功能，包括物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、脂質(zhì)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞間的信號調(diào)控等，是近年來研究的熱點(diǎn)［2］。在有關(guān)caveolae的研究中，F(xiàn)ilipinⅢ常被用于干擾caveolae的結(jié)構(gòu)［3-5］，以便觀察caveolae結(jié)構(gòu)破壞后，其功能有哪些變化。但是FilipinⅢ對caveolin-1本身有沒有影響呢？有研究人員證實(shí)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中，F(xiàn)ilipin破壞caveolae結(jié)構(gòu)，未發(fā)現(xiàn)caveolin-1的蛋白表達(dá)水平有變化［6］。

血液單核細(xì)胞源自骨髓中的前體細(xì)胞，隨著血液循環(huán)到機(jī)體各處，進(jìn)入組織形成巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞是參與機(jī)體防御保護(hù)與體內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持的一個(gè)重要的細(xì)胞群體，一方面它可以通過吞噬作用殺滅和清除病原體、異物、損傷組織及細(xì)胞碎片，另一方面可通過加工和提呈抗原，啟動免疫應(yīng)答從而發(fā)揮進(jìn)一步的防御功能［7］。肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophages，AMs）的數(shù)量占肺泡常駐細(xì)胞的80%，通過分泌細(xì)胞因子，吞噬，殺菌等作用參與肺部細(xì)胞間的調(diào)控和免疫應(yīng)答反應(yīng)，在肺部的急慢性炎癥中都發(fā)揮著重要的作用，是肺部疾病防治研究中的重要領(lǐng)域。AMs上有caveolin-1的表達(dá)［8］。如果用FilipinⅢ干擾AMs上的caveolae，caveolin-1的表達(dá)有沒有變化未見報(bào)道。本研究旨在探索FilipinⅢ對肺泡巨噬細(xì)胞caveolin-1的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑FilipinⅢ（F4767，美國SIGMA公司）；兔抗caveolin-1多克隆抗體（#3267，美國cell signaling公司）；兔抗GAPDH和鼠抗tublin（武漢塞維爾生物）；BCA蛋白定量試劑盒（南京諾唯贊生物）；ECL化學(xué)發(fā)光液（Advansta，德國拜耳公司）；RIPA細(xì)胞裂解液（北京索萊寶生物）；PMSF蛋白酶抑制劑（北京索萊寶生物）；其余通用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器電泳儀（北京六一儀器廠）；Tanon 5500化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；正置熒光顯微鏡（日本尼康ECLIPSETI CI）；成像系統(tǒng)（日本尼康DS-U3）。

1.2 方法

1.2.1 AMs的提取分離 Balb/c小鼠麻醉后頸部解剖暴露氣管，將12號針頭插入氣管，注入1mlPBS灌洗，反復(fù)回抽5次，灌洗3遍?；厥辗闻莨嘞匆?，于4℃、1000r/min離心10分鐘，用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞接種于六孔板中置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中過夜，棄去上清，再添加10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測AMs的純度 將細(xì)胞接種于光學(xué)培養(yǎng)皿，用PBS浸洗3次，每次3min，用4%的多聚甲醛固定15min，PBS浸洗光學(xué)培養(yǎng)皿3次，每次3min，濾紙吸干PBS。在光學(xué)培養(yǎng)皿上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min，濾紙吸掉封閉液，滴加CD68一抗4℃孵育過夜。PBST浸洗光學(xué)培養(yǎng)皿3次，每次3min，濾紙吸干光學(xué)培養(yǎng)皿上多余液體后滴加熒光二抗，37℃孵育1h，PBST浸洗光學(xué)培養(yǎng)皿3次，每次3min。滴加DAPI避光孵育5min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 洗4次每次5min，洗去多余的DAPI，用濾紙吸干光學(xué)培養(yǎng)皿上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液壓片，再在激光共聚焦顯微鏡下隨機(jī)觀察3個(gè)視野并計(jì)數(shù)CD68陽性細(xì)胞的百分率。

1.2.3 小鼠單核/巨噬細(xì)胞系RAW264.7的培養(yǎng)和傳代 RAW264.7細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫（中國上海市）。用含10% 胎牛血清、100U/mL青霉素和100 U/ mL鏈霉素的高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、飽和濕度的5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁生長。待細(xì)胞匯合度為80%左右時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。棄去培養(yǎng)基中的舊培養(yǎng)基，用2mL PBS沖洗2遍后，用0.05%胰蛋白酶（含EDTA）消化2min后，棄去胰蛋白酶，加入3mL含血清的新鮮培養(yǎng)基終止消化，并將細(xì)胞吹打成均勻的單細(xì)胞懸液，按1：3傳代。

1.2.4 FilipinⅢ處理小鼠AMs及RAW264.7細(xì)胞

細(xì)胞用無血清的高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基饑餓處理24小時(shí)，PBS洗兩次，處理組加FilipinⅢ，終濃度為2.5μg/ mL；對照組加二甲基亞砜（DMSO），終濃度為2.5μg/ mL，處理30min后收集蛋白進(jìn)行檢測。

1.2.5 Western印跡分析 根據(jù)文獻(xiàn)［9］常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒定量，以兔抗鼠caveolin-1多克隆抗體（稀釋比例1：1000）進(jìn)行；GAPDH及tublin用作內(nèi)參對照。用Image J程序計(jì)算caveolin-1蛋白信號與內(nèi)對照信號之比，獲得的caveolin-1印跡條帶相對密度比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用mean±SD表示，組間比較用單因素方差分析，均數(shù)間的比較用t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AMs的純度鑒定 為了鑒定所提取的AMs的純度，用DAPI對肺泡灌洗液里的所有細(xì)胞進(jìn)行核染，用巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD68［10］來標(biāo)記巨噬細(xì)胞。在600×的激光共聚焦顯微鏡下，免疫染色的結(jié)果顯示（圖1），隨機(jī)選取三個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，所提取AMs純度為96±2%。

圖1 原代肺泡巨噬細(xì)胞純度鑒定

2.2 FilipinⅢ對AMs caveolin-1表達(dá)的影響 用FilipinⅢ處理AMs 30min后提取蛋白，常規(guī)Western blot檢測caveolin-1蛋白表達(dá)（圖2）。DMSO對照組與FilipinⅢ處理組caveolin-1分別為（0.764±0.0782），（0.871±0.0857）；結(jié)果顯示，相比于DMSO對照組，F(xiàn)ilipinⅢ處理組caveolin-1蛋白水平升高，兩組間caveolin-1有差異（P＜0.05）。

圖2 FilipinⅢ處理AMs caveolin-1的表達(dá)

2.3 FilipinⅢ對RAW264.7細(xì)胞caveolin-1表達(dá)的時(shí)效關(guān)系 為了明確FilipinⅢ處理后caveolin-1表達(dá)的動態(tài)變化，用FilipinⅢ分別處理RAW264.7細(xì)胞15min、30min、1h、2h、4h、6h后Western blot檢測caveolin-1蛋白表達(dá)（圖3）。結(jié)果用FilipinⅢ處理組的caveolin-1與內(nèi)對照的灰度比再比上DMSO對照組的caveolin-1與內(nèi)對照的灰度比表示。15min、30min、1h、2h、4h、6h的結(jié)果分別為0.8255±0.1577，1.0201 ±0.0359，1.1478±0.1836，1.6408±0.1885，0.7088 ±0.2238，0.8171±0.08858；圖示結(jié)果說明在30min時(shí)，caveolin-1的表達(dá)同樣為升高的趨勢；在4h時(shí)，caveolin-1的表達(dá)開始下降。

圖3 FilipinⅢ對RAW264.7細(xì)胞caveolin-1表達(dá)的時(shí)效關(guān)系

3 討論

研究表明caveolae的主要功能不僅包括參與物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，亦是細(xì)胞信號分子的富集區(qū)和信號傳導(dǎo)的樞紐。Caveolin-1是構(gòu)成caveolae的關(guān)鍵蛋白，可通過其腳手架區(qū)域?qū)芏嚓P(guān)鍵信號分子進(jìn)行調(diào)節(jié)從而參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可影響肺泡巨噬細(xì)胞IL-6，IL-10等因子的分泌，從而參與炎癥的調(diào)節(jié)［8］。

Caveolae功能的實(shí)現(xiàn)與膽固醇脂質(zhì)成分有關(guān)，F(xiàn)ilipin能與膽固醇結(jié)合，從而擾亂caveolae的功能，同時(shí)保留細(xì)胞的完整性［11］。因此在眾多的研究中FilipinⅢ常用來作為干擾caveolae的工具藥物［12-14］。然而用FilipinⅢ擾亂caveolae結(jié)構(gòu)之后caveolin-1的變化研究甚少。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中，F(xiàn)ilipin沒有引起caveolin-1的蛋白變化［6］。FilipinⅢ AMs caveolin-1的影響有待探索。

本研究提取小鼠AMs后，用FilipinⅢ處理30分鐘，以Western blot檢測caveolin-1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，F(xiàn)ilipinⅢ引起caveolin-1的表達(dá)升高。為了明確caveolin-1在FilipinⅢ處理下表達(dá)的動態(tài)過程，我們用巨噬細(xì)胞系RAW264.7做了時(shí)效關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在30min時(shí)，caveolin-1表達(dá)上升，與AMs的趨勢相同。提示，在研究AMs上的caveolin-1的功能時(shí)，用RAW264.7細(xì)胞系可以較好的模擬AMs的變化。

FilipinⅢ處理30min可以引起caveolin-1的表達(dá)升高，其機(jī)制仍待揭示。我們推測這樣的增高有可能是因?yàn)閏aveolae結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞為了維持自身功能的相對穩(wěn)定而產(chǎn)生的一種代償性變化。在使用FilipinⅢ作為干擾caveolae結(jié)構(gòu)的工具藥時(shí)，應(yīng)該考慮到caveolin-1的變化可能參與其中。

本研究證實(shí)了caveolae的結(jié)構(gòu)干擾劑FilipinⅢ對胞上caveolin-1的表達(dá)有影響，該發(fā)現(xiàn)對于設(shè)計(jì)caveolae研究策略具有重要參考價(jià)值。

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Effect of FilipinⅢ on caveolin-1 expression in alveolar macrophages

Yang Dan, Li Yi, Chen Yang-Ye, Zhang Ran, Qu Shu-Lin, Zhang Jian-Song, Li Xiang, Shen Li
(The Medicine College of Hunan Normal University, Changsha 410013, China)

Objective to investigate the effect of FilipinⅢ on caveolin-1 expression in alveolar macrophages (AMs). Methods Bronchoalveolar lavage was adopted to extract the primary AMs in mice, which is followed by immunocytochemistry staining to ensure AMs purity. The protein levels of caveolin-1 in AMs treated by FilipinⅢ or DMSO were detected with Western blot. RAW264.7 cells treated by FilipinⅢ were used to observe the possible change of caveolin-1 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h later. Results The data showed that caveolin-1 protein levels increased in both AMs and RAW264.7 cells after Filipin Ⅲ-treatment for 30 min. Conclusion FilipinⅢ can increase the expression of caveolin-1 in AMs and RAW264.7 cells.

FilipinⅢ; caveolin-1; caveolae; alveolar macrophages

R563.8

A

1673-016X（2017）02-0001-03

2017-01-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81100054）；留學(xué)回國人員科研啟動基金資助【2013】693；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（16C0959）

申麗，E-mail:shenli16@hotmail.com