常海龍++胡后祥++張偉++陳俊呂++邱永生++周峰++張垂明++吳其衛(wèi)++吳建濤++劉壯++許環(huán)映++王勤南

摘 要 在溫室內(nèi)觀察甘蔗開花動(dòng)態(tài)，用TTC法測(cè)定甘蔗花粉活力，聯(lián)苯胺-過氧化氫法測(cè)定柱頭可授性。結(jié)果表明：花穗上小蠡花開放順序，一般是自上而下，由外至內(nèi)；ROC22和科五花粉活力于開花第1 天達(dá)到80%以上，第2 天有小幅度上升，之后迅速降低，第7 天僅采到少許花粉，但活力仍在32%左右。甘蔗雌蕊柱頭開花前1天具有可授性，自交授粉后的1～2 d內(nèi)保持強(qiáng)可授性，之后柱頭迅速變黑枯萎；未授粉柱頭花開后的9 d內(nèi)一直保持靚麗的艷紅色，具強(qiáng)可授性。柱頭可授性的最佳時(shí)期為開花后第1～9 天，甘蔗的最佳授粉期為母本開花2 d后再授以父本花粉，4 d內(nèi)即可完成雜交過程。

關(guān)鍵詞 開花動(dòng)態(tài) ；花粉活力 ；柱頭可授性 ；雜交授粉

中圖分類號(hào) S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.04.002

Flowering Phenology and Pollen Activity of Sugarcane

CHANG Hailong1，2） HU Houxiang1，2） ZHANG Wei1，2） CHEN Junlv1，2）

QIU Yongsheng1，2） ZHOU Feng1，2） ZHANG Chuiming1，2） WU Qiwei1，2）

WU Jiantao1，2） LIU Zhuang1，2） XU Huanying1，2） WANG Qinnan1，2）

（1 Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of

Sugarcane Improvement & Biorefinery， Guangzhou， Guangdong 510316；

2 Guangdong Scientific Observation Station of Sugarcane Germplasm Resources and

Their Utilization， Ministry of Agriculture， Sanya， Hainan 572025）

Abstract The sugarcane flowering dynamics was observed in a greenhouse. Sugarcane stigma receptivity was tested by using the benzidine-hydrogen peroxide method， and sugarcane pollen activity was measured by using 2，3，5 triphenyl tetrazolium chloride （TTC） test. The results showed that the tiny flowers on an inflorescence generally bloom from the top to the bottom and from the outside to the inside. The pollen activity of sugarcane varieties ROC22 and Kewu was observed to be over 80% at the first day of flowering， rose modestly at the second day and then fell rapidly. Only a little pollen was collected at the seventh day， but the pollen activity was still around 32%. The stigma of sugarcane pistil had receptivity prior to the first day of flowering， its receptivity was high within the first two days after self-pollination， and then the stigma pollinated rapidly turned black and withered. The non-pollinated stigma was bright red with strong receptivity within the first 9 days after flowering. The best time for the receptivity of stigma was from the first day to the 9th day after flowering. It was best to pollinate the sugarcane female parent with pollen of the male parent after 2 days of flowing of the female parent， and the hybridization process was completed in 4 days.

Keywords flowering dynamics ； pollen activity ； stigma receptivity ； hybrid pollination

目前，利用雜種優(yōu)勢(shì)、有性雜交選育仍是甘蔗育種的主要方式[1]。海南甘蔗育種場(chǎng)作為全國(guó)甘蔗花穗雜交制種基地，每年承擔(dān)的花穗雜交任務(wù)在2 000個(gè)組合左右，能完成雜交授粉的僅有1 500個(gè)組合，而其中500個(gè)組合因花穗結(jié)實(shí)率太低或不結(jié)實(shí)達(dá)不到種子生產(chǎn)要求，嚴(yán)重浪費(fèi)勞動(dòng)力[2-3]。因此，研究甘蔗有性生殖的整個(gè)過程，提高甘蔗花穗結(jié)實(shí)率是甘蔗雜交育種的一個(gè)重點(diǎn)。

在甘蔗雜交授粉過程中，一般都對(duì)選定的父母本進(jìn)行人工異花授粉，甘蔗花粉必須在具有活力時(shí)到達(dá)適宜的接受柱頭才能完成傳粉過程，能夠接受花粉的適宜柱頭即處于柱頭可授期[4-5]?；ǚ郾３只盍Φ臅r(shí)間長(zhǎng)短和柱頭可授期的長(zhǎng)短組合在一起，深刻影響著甘蔗授粉成功率、花穗結(jié)實(shí)率等。因此，甘蔗花粉和柱頭的形態(tài)結(jié)構(gòu)、花粉的活力與壽命以及柱頭的可授性等便成為關(guān)注的重點(diǎn)。在國(guó)內(nèi)外，關(guān)于植物的花粉活力和柱頭形態(tài)變化、可授性變化等已有很多研究[6-10]，但關(guān)于甘蔗生殖特性的研究則未見報(bào)道。本試驗(yàn)主要針對(duì)甘蔗開花的生物學(xué)特性、花粉活力及其柱頭可授性等方面開展研究，探討其雜交成功的基礎(chǔ)，為揭示該物種的生殖特性及提高結(jié)實(shí)率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年11月至2016年1月，以海南甘蔗育種場(chǎng)親本圃內(nèi)種植的ROC22、科五（有花粉）、粵糖92-1287（無花粉）作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

甘蔗花為頂生的大型圓錐花序，一個(gè)花穗上有小穗8 000～15 000個(gè)，每個(gè)小穗內(nèi)含有1個(gè)子房，2個(gè)柱頭，3～4個(gè)花藥，為雌雄同花。因小穗極小，難以人工去雄，本研究中花粉活力檢測(cè)及柱頭可授性試驗(yàn)分別采用2個(gè)不同品種。試驗(yàn)前1天，選取長(zhǎng)勢(shì)一致、包莖長(zhǎng)根且第2天可開花的ROC22、科五、粵92-1287 3個(gè)品種各3株，靠發(fā)根底部整齊砍斷，帶回溫室大棚將其養(yǎng)植于充氧的水槽中，每株單獨(dú)存放于專用雜交單元格中以防其雜交串粉。

1.2.1 開花生物學(xué)特性觀察

試驗(yàn)于2015年12月1日開始，于每天上午8：00進(jìn)行連續(xù)采樣和觀察，并在體式顯微鏡下拍照記錄。第1天采樣前將無花粉的粵糖92-1287、有花粉的ROC22兩品種花穗下部未開花和頂部發(fā)育不良的1/5處去掉，僅保留穗中部開花小穗。每次分別隨機(jī)抽取10個(gè)甘蔗小穗，在體式顯微鏡下用手術(shù)鑷子小心剝?nèi)ネ夥f殼后觀察子房及柱頭形態(tài)、顏色，并用圖片形式記錄比較。

1.2.2 花粉活力測(cè)定

花粉活力采用TTC檢測(cè)法。從甘蔗花穗散粉的第1天開始，分別在每天上午的8：00采集ROC22、科五新鮮花粉，用鑷子撒置于載玻片中央，同時(shí)滴1～2滴0.5%TTC（2，3，5-uiphenyl tetrazolium chloride）溶液于花粉樣品中，充分混勻，蓋上蓋玻片，置于濕潤(rùn)培養(yǎng)皿中，于37℃的水浴鍋中放置20 min；在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察，每品種觀察3個(gè)載玻片，每片取6個(gè)不重疊視野，每個(gè)視野花粉總數(shù)不少于100個(gè)。若花粉變紅則表明有活力，若紅色很淺或無變化則表明為無活力。統(tǒng)計(jì)全部花粉中紅色花粉所占比例。

花粉活力=紅色花粉/觀察花粉總數(shù)×100%

1.2.3 柱頭可授性測(cè)定

用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測(cè)定柱頭可授性。將開花后不同天數(shù)的ROC22、粵糖92-1287兩品種的柱頭完全浸泡在聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液中（1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22，V∶V）放置黑暗環(huán)境下25 min[若柱頭具有可授性（呈現(xiàn)出過氧化氫酶活力），則柱頭周圍的反應(yīng)液呈現(xiàn)藍(lán)色并有大量的氣泡出現(xiàn)]；放置在10倍體式顯微鏡下觀察柱頭染色部位。將至少2/3部位呈現(xiàn)藍(lán)色并伴有大量氣泡出現(xiàn)的柱頭算作具有可授性，否則認(rèn)為沒有可授性；根據(jù)氣泡多少判斷柱頭可授性的相對(duì)強(qiáng)弱：（1）“+++”表示柱頭可授性強(qiáng)，柱頭至少2/3部位呈現(xiàn)藍(lán)色并伴有大量氣泡出現(xiàn)；（2）“++”表示柱頭可授性較強(qiáng)，柱頭至少2/3部位呈現(xiàn)藍(lán)色并伴有較多氣泡出現(xiàn)；（3）“+”表示柱頭具有可授性，柱頭可授性弱，柱頭呈淡藍(lán)色或不明顯，周圍僅有幾個(gè)小氣泡；（4）“+/-”表示部分柱頭具有可授性；（5）“-”表示柱頭不具有可授性。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗開花生物學(xué)特性

2.1.1 甘蔗開花動(dòng)態(tài)

甘蔗抽穗后，通常經(jīng)3～7 d即開花。一個(gè)花穗上小蠡花開花順序，一般是自上而下，由外至內(nèi)；成對(duì)小穗花的開放，一般是有柄小穗花先開，無柄小穗花后開，7 d內(nèi)整株花穗開放完畢。小花中鱗片吸水膨脹產(chǎn)生膨壓促使穎片張開，花絲在開花時(shí)迅速伸長(zhǎng)，花藥吐出，羽狀柱頭露出。花藥開裂通常遲于小花開放，開花后鱗片水分散失，花絲萎縮，穎片閉合，但柱頭及花藥仍露于穎外。一個(gè)小穗由穎片開放到閉合平均約需2 h。

2.1.2 甘蔗雌蕊動(dòng)態(tài)變化

通過對(duì)自身有花粉的ROC22及雄性不育的粵糖92-1287雌蕊整個(gè)開花期的動(dòng)態(tài)變化跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2品種甘蔗雌蕊開花前2～3 d內(nèi)羽狀柱頭未露出穎殼時(shí)為白色，慢慢變?yōu)榫植糠凵?，子房相?duì)于柱頭較小，呈橢圓形。開花前1天紅色逐漸加深，變?yōu)樯罴t色，富有光澤，柱頭緊實(shí)而不蓬松，子房亮麗。開花當(dāng)天，柱頭形態(tài)伸展，羽狀鱗片蓬松，顏色艷紅。自身含有花粉的ROC22柱頭開花當(dāng)天8：00即進(jìn)行自花授粉，柱頭沾滿花粉（圖1）。柱頭授粉后，隨后的2～5 d內(nèi)，柱頭的顏色逐漸加深，由原先的深紅色變?yōu)榧t黑色，最后變成黑色，柱頭失去光澤，干枯。開花后第4 天，子房發(fā)育膨脹，外觀形態(tài)拉伸變長(zhǎng)，呈現(xiàn)出快速發(fā)育趨勢(shì)；第7天，子房發(fā)育到原來體積的2倍，柱頭與子房連接的部位變細(xì)，顏色變褐即將脫落。粵糖92-1287雌蕊開花后1～4 d，因柱頭未授粉，顏色一直保持鮮紅色，富有光澤，柱頭變化不明顯，子房不膨脹，顏色漸深（圖2）；5～7 d，羽狀柱頭蓬松，光澤減少，整個(gè)柱頭顏色變淡，子房發(fā)黃暗淡；自第8天開始，柱頭頂端開始褪色； 9 d時(shí)子房出現(xiàn)萎縮，柱頭頂部紅色褪去明顯，白色區(qū)域逐步擴(kuò)大；13 d時(shí)柱頭雖仍有部分較鮮艷，但子房基本消失，無雜交授粉結(jié)實(shí)可能。

2.2 甘蔗花粉活力檢測(cè)

通過TTC染色后觀察花粉活力，結(jié)果如圖3所示。甘蔗采回溫室后，第1天花粉活力可達(dá)到80%～90%；隨著開花時(shí)間延長(zhǎng)，花粉活力有小幅度上升，第2天活力最高，2品種花粉活力增幅達(dá)6%以上，其中科五花粉活力達(dá)到92%以上；第3天起花粉活力急速降低，至第7天花粉存活率僅為32%左右，且2品種所采集到的花粉極少，已經(jīng)不再適合做雜交親本。

2.3 甘蔗柱頭可授性

通過聯(lián)苯胺-過氧化氫法測(cè)定柱頭可授性可知，甘蔗在開花前3～2 d內(nèi)，羽狀柱頭顏色沒有變紅之前沒有可授性，開花前1天柱頭已具備強(qiáng)可授性。ROC22在開花當(dāng)天柱頭即沾滿花粉，在1 ～2 d內(nèi)仍具有強(qiáng)可授性，至第3 天柱頭可授性急劇減弱，第5 天柱頭局部發(fā)黑，過氧化氫酶活力降低，已經(jīng)不具有可授性（表1，圖4）?；浱?2-1287柱頭一直未有授粉，在開花前1天（-1 d）直至開花后第9天，均具有強(qiáng)可授性；開花后第10～12 天柱頭仍具有可授性，第13 天開始僅有部分柱頭具可授性（表1，圖5）

3 討論與結(jié)論

甘蔗開花習(xí)性易受環(huán)境因素影響，不但品種間差異大，而且同一品種年際間的變化也可能很大[11-13]。同時(shí)，由于不同材料的花期長(zhǎng)短、開花抽穗特點(diǎn)也不同，因此在制定雜交計(jì)劃時(shí)應(yīng)對(duì)相關(guān)材料的開花生物學(xué)特性有所了解，以提高雜交計(jì)劃的完成率。甘蔗親本材料花穗的開花特點(diǎn)分為：邊抽邊開型、先抽后開型和前期先抽后開、后期邊抽邊開型[14]。本研究選用的3種材料都為先抽后開型，開花集中，柱頭艷麗，羽狀柱頭極易沾染花粉。若本身花粉發(fā)育正常，開花1 h內(nèi)柱頭即可完成自交授粉；3 d后子房迅速發(fā)育膨脹，柱頭由艷麗的深紅色迅速變?yōu)楹谏?，并逐漸脫落；授粉7 d后子房即發(fā)育到原體積2倍大。若小穗開放后柱頭一直未授粉，在9 d內(nèi)柱頭一直保持艷麗的深紅色，羽狀鱗片舒展蓬松，不但增加了授粉概率且對(duì)傳媒小動(dòng)物極具吸引性，這一生物學(xué)特性在一定意義上提高了甘蔗花穗授粉率。雜交授粉一般可在一周內(nèi)完成，這類品系無論作母本或作父本，花穗的用量都是比較經(jīng)濟(jì)的。

植物花粉的活力與壽命受遺傳因素和環(huán)境條件的影響較大，果樹類花粉壽命可維持?jǐn)?shù)月至一年以上[15-17]，低溫干燥條件下可極大延長(zhǎng)雙核花粉的生活力，而三核花粉則以高濕度為好[18]。栽培芍藥花粉壽命為7 d，野生芍藥植物的花粉活力比栽培品種壽命長(zhǎng)，一般為15 d[19]；花粉活力及其下降快慢隨生境不同而有所差異，錦帶花的花粉活力在70%以上能維持3 d，之后明顯下降，但至花朵枯萎時(shí)，仍有少量花粉具有活力[20]。本研究是在溫室內(nèi)進(jìn)行，為保持甘蔗花穗正常生長(zhǎng)狀態(tài)，每隔6 h都會(huì)對(duì)其進(jìn)行噴淋增濕，2品種花穗每天都會(huì)有部分小穗開放，早晨7：30左右花藥逐漸開裂，開始散粉。經(jīng)TTC檢測(cè)表明，2品種開花后第1 天收集的花粉活力都達(dá)到80%以上；第2 天花粉活力略有提高，之后迅速降低，至第7 天花粉活力降低至30%左右?？莆寤ǚ刍盍σ恢备哂赗OC22花粉，這應(yīng)該為基因因素影響。開花初期前1～2 d內(nèi)散粉最多，之后逐漸減少，第7天采集到的花粉極少，已經(jīng)不再適合作花穗雜交使用。從本研究結(jié)果可推測(cè)，甘蔗花穗雜交適宜時(shí)間為開花后的前4 d內(nèi)，且以第1～2天內(nèi)效果最好。

柱頭可授期是花朵成熟過程中的一個(gè)重要時(shí)期，其可授期長(zhǎng)短直接影響花穗授粉結(jié)實(shí)[21]。不同植物的柱頭可授期因物種和品種的差異而有所不同，榴蓮花的柱頭僅在開花前幾個(gè)小時(shí)內(nèi)具有可授性[22]，水稻、棉花的可授期可保持1～2 d，油菜為開花后1～3 d，第4 天生活力下降，約6 d失去作用[23]，歐榛如柱頭未授粉，可授性可保持3個(gè)月長(zhǎng)[24]。本研究中，甘蔗柱頭可授期長(zhǎng)達(dá)13 d，開花前1 天（-1 d）至第9 天（9 d）內(nèi)柱頭都具有強(qiáng)的可授性；柱頭授粉后，2 d內(nèi)都具有強(qiáng)可授性，之后活力迅速降低，羽狀柱頭顏色變暗，逐漸呈黑色，柱頭萎蔫脫落。柱頭的顏色變化和可授性有一定的相關(guān)性，隨著開花授粉過程的進(jìn)行，柱頭顏色由白色到鮮紅色再到暗黑色；若柱頭從開花當(dāng)天一直未有授粉，且柱頭顏色由未開時(shí)的白色至艷紅色再逐漸褪至白色，則柱頭可授性相應(yīng)的從弱到強(qiáng)再到喪失。

根據(jù)上述試驗(yàn)可知，甘蔗柱頭最佳授粉期在開花后9 d內(nèi)，花粉活力較高時(shí)期是開花后的4 d內(nèi)。利用其這一特點(diǎn)，可以待母本花穗開放2 d后，整穗小花開放至1/3處時(shí)，再集中放置父本花穗中進(jìn)行雜交，4 d內(nèi)即可完成雜交過程，中間不用重復(fù)替換父本，不但節(jié)省父本花穗用量，且極大地提高花穗雜交效率。

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