趙書林，蔡雙山，夏木陽，夏德才，胡 銳，楊齊華，閔征橋，張 念

(湖北福星生物科技有限公司，湖北 孝感 432100)

生物工程

裂殖壺菌補(bǔ)糖發(fā)酵研究

趙書林，蔡雙山，夏木陽，夏德才，胡 銳，楊齊華，閔征橋，張 念

(湖北福星生物科技有限公司，湖北 孝感 432100)

為了探索不同碳源濃度對裂殖壺菌(Schizochytrium)細(xì)胞營養(yǎng)生長和油脂積累的影響，對發(fā)酵調(diào)控進(jìn)行研究，同時(shí)測定發(fā)酵液生物量、含油量、DHA含量和DHA產(chǎn)量。結(jié)果表明：發(fā)酵過程中通過補(bǔ)糖可以提高發(fā)酵液含油量和DHA產(chǎn)量，但糖濃度過高也會抑制發(fā)酵；當(dāng)還原糖質(zhì)量濃度調(diào)控在40 g/L左右時(shí)，生物量、含油量、DHA含量和DHA產(chǎn)量均達(dá)最高，分別為8.95 g/100 mL、22.42 g/L、41.71%、9.35 g/L，比對照組高出了76.18%、61.88%、4.3%、68.77%。

裂殖壺菌；高強(qiáng)度；發(fā)酵調(diào)控；DHA

裂殖壺菌(Schizochytrium)是一類屬于真菌門(Eumycota)、卵菌(Oomycetes)、水霉目(Saprolegniales)、破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)的類藻海洋真菌[1]。利用裂殖壺菌高強(qiáng)度發(fā)酵生產(chǎn)富含DHA的油脂，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效應(yīng)[2]。近年來，國內(nèi)許多企業(yè)紛紛加入到DHA發(fā)酵生產(chǎn)行列，但在DHA發(fā)酵調(diào)控過程中，仍存在細(xì)胞生長緩慢、活性低、DHA產(chǎn)量少和代謝難以調(diào)控等問題，導(dǎo)致產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量均與國外企業(yè)有一定的差距。因此，穩(wěn)定、高效的發(fā)酵調(diào)控技術(shù)對DHA的生產(chǎn)至關(guān)重要[3]。

裂殖壺菌在細(xì)胞生長中若沒有及時(shí)的碳源補(bǔ)給，便會分解自身的油脂來提供生存所必需的能量，因此應(yīng)及時(shí)補(bǔ)糖，保證裂殖壺菌有充足的碳源進(jìn)行油脂的積累和DHA的合成。因此，對裂殖壺菌發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵調(diào)控，可以提高其含油量和DHA含量[4]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

裂殖壺菌(Schizochytrium)，來自湖北福星生物科技有限公司。培養(yǎng)基均為常用的培養(yǎng)基。

堿性酒石酸銅甲液、堿性酒石酸銅乙液、甲醇、正己烷、95%乙醇、亞甲基藍(lán)、甲基紅、堿性蛋白酶(酶活20萬U/g)等均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A氣相色譜儀，D-1高壓蒸汽滅菌鍋，SW-CJ-1F型超凈工作臺，RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海高機(jī)100 L發(fā)酵罐。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 裂殖壺菌的富集和培養(yǎng)[5]

從平板中挑選裂殖壺菌單菌落到搖瓶中進(jìn)行種子一級培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min；一級培養(yǎng)3 d后以10%的接種量進(jìn)入種子二級培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min；二級培養(yǎng)3 d后以5%的接種量進(jìn)入100 L 發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，罐壓0.03 MPa，通氣量8 m3/h，攪拌速度40 r/min，發(fā)酵168 h后收獲菌體。

1.2.2 裂殖壺菌糖、氮代謝分析

A為對照組，不進(jìn)行補(bǔ)糖調(diào)控；B、C、D、E、F為5個(gè)調(diào)控實(shí)驗(yàn)組，每隔24 h觀察碳和氮的利用情況，并且進(jìn)行補(bǔ)糖調(diào)控，調(diào)控質(zhì)量濃度分別約為10、20、30、40、50 g/L。

1.2.3 生物量、含油量、DHA含量和DHA產(chǎn)量的測定計(jì)算[6-7]

生物量：取100 mL發(fā)酵液通過離心、100℃干燥，獲得干菌體稱重。

含油量：取1 L發(fā)酵液離心酶解，然后用正己烷提取油脂稱重。

DHA含量：用氣相色譜測定油脂的DHA含量。

DHA產(chǎn)量：用1 L發(fā)酵液的含油量乘以DHA含量即為DHA產(chǎn)量。

1.2.4 還原糖和氨基酸的測定

還原糖的測定采用斐林試劑法，氨基酸的測定采用甲醛法。

2 結(jié)果與討論

2.1 裂殖壺菌糖、氮代謝分析

將對照組和實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵培養(yǎng)7 d，每隔24 h觀察碳、氮的利用情況，并且適當(dāng)補(bǔ)充碳源，繪制趨勢圖，結(jié)果如圖1～圖6所示。

圖1 對照組A碳、氮利用變化曲線

從圖1首先可以看出，前72 h是裂殖壺菌生長的主要時(shí)期，72 h后糖耗和氮耗趨于穩(wěn)定，72 h時(shí)還原糖質(zhì)量濃度為4.89 g/L；其次糖耗的速率先慢后快，而氮耗的速率則是先快后慢，說明裂殖壺菌對碳源的需求是逐漸增強(qiáng)的，后期補(bǔ)糖可以提高細(xì)胞的生長速度和代謝能力。當(dāng)168 h放罐時(shí)發(fā)酵液還原糖質(zhì)量濃度為5.00 g/L，氨基酸質(zhì)量濃度為0.32 g/L。

圖2 實(shí)驗(yàn)組B碳、氮利用變化曲線

從圖2可以看出，實(shí)驗(yàn)組B分別在72、96、120、144 h補(bǔ)糖至10.11、11.05、11.98、10.96 g/L，然后又分別迅速消耗至5.24、5.79、5.42、5.37 g/L，期間裂殖壺菌對碳源的消耗很快，細(xì)胞大量繁殖。當(dāng)168 h放罐時(shí)發(fā)酵液還原糖質(zhì)量濃度約為5.37 g/L，與對照組相差不大。

圖3 實(shí)驗(yàn)組C碳、氮利用變化曲線

從圖3可以看出，實(shí)驗(yàn)組C分別在72、96、120、144 h補(bǔ)糖至20.15、20.26、20.63、20.50 g/L，然后又分別迅速消耗至5.24、5.47、6.79、7.50 g/L。當(dāng)168 h放罐時(shí)發(fā)酵液還原糖質(zhì)量濃度約為7.50 g/L，超出對照組2.50 g/L。

圖4 實(shí)驗(yàn)組D碳、氮利用變化曲線

從圖4可以看出，實(shí)驗(yàn)組D分別在72、96、120、144 h補(bǔ)糖至30.34、31.78、31.12、31.55 g/L，然后又分別迅速消耗至7.68、8.31、6.37、8.37 g/L。當(dāng)168 h放罐時(shí)發(fā)酵液還原糖質(zhì)量濃度約為8.37 g/L，超出對照組3.37 g/L。

圖5 實(shí)驗(yàn)組E碳、氮利用變化曲線

從圖5可以看出，實(shí)驗(yàn)組E分別在48、72、96、120、144 h補(bǔ)糖至40.65、40.13、40.55、40.35、40.88 g/L，然后又分別迅速消耗至13.54、11.56、15.38、16.49、14.54 g/L。當(dāng)168 h放罐時(shí)發(fā)酵液還原糖質(zhì)量濃度約為14.54 g/L，超出對照組9.54 g/L。

圖6 實(shí)驗(yàn)組F碳、氮利用變化曲線

從圖6可以看出，實(shí)驗(yàn)組F分別在48、72、96、120、144 h補(bǔ)糖至50.66、50.32、50.49、49.96、50.11 g/L，然后又分別迅速消耗至19.18、18.69、20.53、21.35、21.56 g/L。當(dāng)168 h放罐時(shí)發(fā)酵液還原糖質(zhì)量濃度約為21.56 g/L，超出對照組16.56 g/L。

2.2 補(bǔ)糖對裂殖壺菌含油量、生物量及DHA的影響

發(fā)酵168 h后同時(shí)對對照組A和實(shí)驗(yàn)組B、C、D、E、F提取油脂，并對其含油量、生物量、DHA產(chǎn)量和DHA含量進(jìn)行測定及計(jì)算，結(jié)果見表1。

由表1可知，實(shí)驗(yàn)組B、C、D、E、F中生物量、含油量、DHA產(chǎn)量及DHA含量明顯高于對照組，特別是E組的含油量及DHA產(chǎn)量分別比對照組高出了61.88%和68.77%。

從調(diào)控碳源濃度來看，5個(gè)不同的調(diào)控實(shí)驗(yàn)組油脂的生物量、含油量、DHA含量及DHA產(chǎn)量明顯高于對照組。Umemura[8]、Ishida[9]等對此進(jìn)行了研究：當(dāng)裂殖壺菌受到氮源的限制，油脂濃度與碳源的增長成正比。Hibbeln等[10]指出碳源濃度過高會導(dǎo)致裂殖壺菌自身分解，也會導(dǎo)致更多的飽和脂肪酸合成，相反氮源的限制可能使得更多的不飽和脂肪酸形成。當(dāng)?shù)春谋M時(shí)補(bǔ)糖不僅可以促進(jìn)油脂的產(chǎn)生，而且對DHA的形成也是有利的[11]。

表1 對照組和實(shí)驗(yàn)組的生物量、含油量、

3 結(jié) 論

補(bǔ)糖可以提高裂殖壺菌含油量和DHA產(chǎn)量，隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，裂殖壺菌對碳源的需求也會越來越大。當(dāng)調(diào)控發(fā)酵液還原糖質(zhì)量濃度為40 g/L 左右時(shí)，生物量、含油量、DHA產(chǎn)量及DHA含量達(dá)到最高，裂殖壺菌生長最旺盛。

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Feeding glucose fermentation ofSchizochytrium

ZHAO Shulin，CAI Shuangshan，XIA Muyang，XIA Decai，HU Rui，YANG Qihua，MIN Zhengqiao，ZHANG Nian

(Hubei Fuxing Biological Technology Co.，Ltd.，Xiaogan 432100，Hubei，China)

In order to investigate the effects of different concentrations of carbon source on the vegetative growth and oil accumulation ofSchizochytriumcells，the fermentation regulation was studied and the biomass，oil content，DHA content and DHA productivity of fermented liquid were determined. The results showed that the oil content and DHA productivity in fermented liquid could be improved by feeding glucose fermentation，but high concentration of sugar could inhibit fermentation. Under the conditions of mass concentration of reducing carbon 40 g/L，the biomass，oil content，DHA content and DHA productivity were 8.95 g/100 mL，22.42 g/L，41.71% and 9.35 g/L respectively，which were the highest and increased by 76.18%，61.88%，4.3% and 68.77% respectively than the control group.

Schizochytrium； high intensity； fermentation regulation； DHA

2016-05-07；

2016-11-06

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2014AA021702)

趙書林(1989)，男，工程師，碩士，主要從事微生物油脂的研究工作(E-mail)396858346@qq.com。

TS222;Q815

A

1003-7969(2017)02-0113-03