朱金鑫，孫金金，原曉龍，王 娟，楊宇明，王 毅

( 1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224； 2．國家林業(yè)局重點開放性實驗室云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實驗室，云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室，昆明 650204； 3.云南省林業(yè)科學(xué)院，昆明 650204)

生物工程

滇牡丹ω-3脂肪酸脫氫酶基因克隆與功能分析

朱金鑫1，2，孫金金1，2，原曉龍2，3，王 娟2，3，楊宇明2，3，王 毅2，3

( 1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224； 2．國家林業(yè)局重點開放性實驗室云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實驗室，云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室，昆明 650204； 3.云南省林業(yè)科學(xué)院，昆明 650204)

ω-3脂肪酸脫氫酶是多不飽和脂肪酸亞麻酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶。依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計特異性引物，使用RT-PCR方法從滇牡丹克隆得到1個FAD3基因的cDNA全長序列，命名為PdFAD3(GeneBank登錄號為KX289610)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明PdFAD3基因片段序列全長2 134 bp，包含完整的cDNA開放閱讀框，編碼含有450個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)；Blast比對結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)屬于FAD蛋白質(zhì)家族；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示與芍藥屬芍藥組植物芍藥親緣關(guān)系較近；該蛋白質(zhì)屬于跨膜蛋白質(zhì)，親水性較低；RT-PCR結(jié)果顯示其在種子中的表達(dá)隨著種子成熟出現(xiàn)雙峰型的表達(dá)量變化，與目前所報道的其他物種的FAD3表達(dá)情況相似。為進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)及獲得含高不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)基因滇牡丹品種奠定理論基礎(chǔ)。

滇牡丹；ω-3脂肪酸脫氫酶；基因克??；基因功能分析

牡丹是我國傳統(tǒng)名花，具有很高的觀賞和藥用價值，牡丹籽油作為中藥丹皮(牡丹根皮)的副產(chǎn)品，其食用藥用價值逐漸被人們發(fā)現(xiàn)并不斷加強(qiáng)重視。研究發(fā)現(xiàn)牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸[1]，具有重要的研究價值和應(yīng)用潛力，自2011年中華人民共和國衛(wèi)生部將牡丹籽油列入新資源食品后，油用牡丹迅速成為研究熱點。滇牡丹(Paeoniadelavayi)主要分布在我國云南中部至西北部、西藏東南部和四川西南部海拔在1 900～3 600 m的部分區(qū)域，是我國西南地區(qū)特有珍稀種質(zhì)資源，滇牡丹雖然自然分布狹窄，但其生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，栽培范圍廣[2]，因此滇牡丹具有極大的引種馴化和育種空間，應(yīng)用價值高。

多不飽和脂肪酸(PUFAs)是指含有兩個或兩個以上雙鍵的長鏈脂肪酸[3]，在生物體內(nèi)具有重要作用[4-5]。自20世紀(jì)90年代后高血壓、肥胖癥及心血管疾病等對人類健康的威脅越來越大，美國、日本等國將研究重點轉(zhuǎn)向功能食品，其中主要研究對象為磷脂與多不飽和脂肪酸[6]。但由于高等動物體內(nèi)缺乏一系列脂肪酸脫氫酶而不能自身合成α-亞麻酸、亞油酸等多不飽和脂肪酸，因此研究人員希望通過研究多不飽和脂肪酸的合成途徑，獲得高含量不飽和脂肪酸的植物品種。

牡丹籽油中α-亞麻酸屬于ω-3 PUFAs，ω-3脂肪酸脫氫酶催化飽和脂肪酸脫氫反應(yīng)生成不飽和脂肪酸，是α-亞麻酸合成的關(guān)鍵酶，ω-3脂肪酸脫氫酶基因已經(jīng)在擬南芥[7]、大豆[8]、小麥[9]等多種植物中得到克隆。研究人員將ω-3脂肪酸脫氫酶基因?qū)霟煵莺蟀l(fā)現(xiàn)其不飽和脂肪酸含量顯著增加[10]，轉(zhuǎn)FAD3基因番茄葉片和果實中不飽和脂肪酸含量均有增加[11]，而對ω-3脂肪酸脫氫酶基因進(jìn)行基因沉默處理后不飽和脂肪酸含量降低[12]，由此可見ω-3脂肪酸脫氫酶在植物體內(nèi)扮演調(diào)控多不飽和脂肪酸含量的角色。從滇牡丹中克隆得到ω-3 脂肪酸脫氫酶基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)理及獲得含高不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)基因品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

滇牡丹種子于2014年6— 9月采集于云南省林業(yè)科學(xué)院樹木園苗圃，樣本經(jīng)液氮速凍后于-80℃ 冰箱保存待用?？俁NA小量提取試劑盒購自美國Qiagen, pESY-T3克隆試劑盒與感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，LA-Taq酶、Reverse Transcriptase M-MLV購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PdFAD3基因克隆

實驗方法參照李蘇雨等[13]的方法。具體操作如下：通過轉(zhuǎn)錄組分析獲得1個只含有部分滇牡丹ω-3脂肪酸脫氫酶(PdFAD3)基因的序列片段，根據(jù)該基因片段序列設(shè)計特異引物5′-RACE引物(本實驗所用引物見表1)對5′-基因片段進(jìn)行克隆。按照總RNA小量提取試劑盒操作步驟提取總RNA, 檢測總RNA濃度及完整性后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。按照試劑盒操作步驟擴(kuò)增獲得PdFAD3 基因5′端基因序列片段，利用ATG序列拼接軟件將5′-RACE獲得基因片段和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得的基因片段進(jìn)行拼接后獲得PdFAD3全長基因序列。以PdFAD3基因全長序列為模板，設(shè)計含有起始密碼子和終止密碼子的特異引物PdFAD3F0和PdFAD3R0，以滇牡丹種子cDNA為模板，PdFAD3F0和PdFAD3R0為引物擴(kuò)增滇牡丹FAD3基因cDNA開放閱讀框全長序列。PCR反應(yīng)體系參考PrimeScriptTM Kit. 擴(kuò)增程序為： 94℃ 5 min; 94℃ 30 s; 58℃ 45 s; 72℃ 90 s; 30個循環(huán)后72℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入pESY-T3載體中送測序公司檢測并驗證。

表1 引物序列

1.2.2 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Blast和DNAMAN生物學(xué)軟件對PdFAD3的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對分析；利用軟件MEGA 5.0以鄰位連接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建PdFAD3的氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)親疏水性預(yù)測分析；使用ProtScale(http://web.expasy.org/protparam)在線工具分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；使用Tmpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)在線工具分析PdFAD3蛋白質(zhì)序列跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.3 熒光定量PCR檢測PdFAD3組織表達(dá)分析

以獲得的PdFAD3基因序列為模板設(shè)計特異性引物PdFAD3Ft和PdFAD3Rt(見表1)；分別采集滇牡丹授粉后，30、50、70 d及90 d的種子，采集后立即放入液氮中。用RNA小量提取試劑盒提取滇牡丹不同發(fā)育時期的種子總RNA,電泳檢測后-80℃保存；參照Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒合成cDNA,保存于-20℃; Real-time RT-PCR反應(yīng)用熒光染料SYBR Green Ⅰ, GAPDH為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系20 μL, 反應(yīng)程序為：94℃ 4 min;95℃ 15 s; 57℃ 15 s; 72℃ 25 s; 35個循環(huán)，72℃單點檢測信號。反應(yīng)結(jié)束后，60℃連續(xù)檢測信號產(chǎn)生溶解曲線。用Opticon monitor 3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的記錄和分析。每個樣品3次重復(fù)，滅菌水對空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PdFAD3基因克隆與序列分析

通過分析滇牡丹種子轉(zhuǎn)錄組獲得1 452 bp的ω-3脂肪酸脫氫酶基因片段，依據(jù)獲得基因片段設(shè)計5′-RACE的基因擴(kuò)增特異引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 5′-RACE獲得812 bp基因片段 (見圖1)，利用ATGC序列拼接軟件，最終獲得PdFAD3全長cDNA序列2 134 bp。利用NCBI ORF Finder軟件對拼接數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示PdFAD3基因片段包含完整的cDNA開放閱讀框(ORF)，序列全長1 353 bp，5′端非編碼區(qū) 302 bp，3′端非編碼區(qū) 448 bp；編碼450個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，起始密碼子為ATG，終止密碼子TGA。并根據(jù)獲得的PdFAD3基因全長設(shè)計含有起始密碼子和終止密碼子的特異引物，以cDNA為模板擴(kuò)增獲得PdFAD3 基因開放閱讀框(見圖1)，并將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到克隆載體中，進(jìn)行永久保存。

注：M1. Trans 2k DNA marker; M2. Takara 1k DNA marker；1. 5′-RACE；2.滇牡丹FAD3開放閱讀框PCR產(chǎn)物。

圖1 滇牡丹FAD3基因克隆

2.2 PdFAD3氨基酸序列比對分析

將克隆出來的PdFAD3基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與已報道的FAD3的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對。

結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)與已報道的FAD3蛋白質(zhì)超家族的保守結(jié)構(gòu)域具有高度一致性，氨基酸序列中有3個保守組氨酸中心位點[14]，表明該蛋白質(zhì)屬于FAD3家族蛋白質(zhì)。PdFAD3的氨基酸序列與大豆(Glycinemax)氨基酸序列(NP_001237361.1)相似性達(dá)74.18%, 與胡桃(Juglansregia)氨基酸序列(AHJ79158.1)相似性達(dá)75.93%, 與芍藥(Paeonialactiflora)氨基酸序列(NP_001046132.1)相似性達(dá)94.67%, 與蓖麻(Ricinuscommunis)氨基酸序列(CAA13176.1)相似性達(dá)71.52%(見圖2)。

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示PdFAD3分子式為C2364H3558N646O632S14, 相對分子質(zhì)量為51 589.0, 理論等電點為9.11, 親水性平均系數(shù)為-0.291, 在線軟件ProtScale進(jìn)一步分析結(jié)果顯示蛋白質(zhì)親水性較低(見圖3)。在線軟件Tmpred軟件分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示存在5個跨膜區(qū)，表明PdFAD3為跨膜蛋白質(zhì)(見表2)。

表2 滇牡丹FAD3蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 PdFAD3基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建基PdFAD3氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖4)。結(jié)果表明，PdFAD3與芍藥屬植物芍藥PlFAD3聚為一類，親緣關(guān)系最近，與雙子葉植物親緣關(guān)系次之，與單子葉植物聚為不同分支，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。由基因系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，F(xiàn)AD3基因的聚類與植物分類大體一致。

2.4 熒光定量PCR檢測PdFAD3

利用RT-PCR方法和PdFAD3的基因特異引物檢測其在授粉后30、50、70、90 d的種子中的表達(dá)情況(見圖5)。結(jié)果顯示PdFAD3的表達(dá)情況為雙峰型，在50 d時PdFAD3的表達(dá)量達(dá)到第1個高峰，此后表達(dá)水平降低，在70 d后表達(dá)水平再次升高。結(jié)果顯示在授粉后50 d內(nèi)因合成生物膜需求PdFAD3 表達(dá)水平較高，而在種子發(fā)育后期，即授粉50～70 d內(nèi)，PdFAD3表達(dá)水平降低，α-亞麻酸等不飽和脂肪酸合成量降低，以積累飽和脂肪酸等物質(zhì)以備萌發(fā)所需，PdFAD3表達(dá)狀況與目前報道的其他物種的FAD3的表達(dá)狀況相似[15]。

注：PdFAD3為滇牡丹FAD3；GmFAD3為大豆FAD3；JrFAD3為胡桃FAD3；PlFAD3為芍藥FAD3；

圖3 滇牡丹FAD3蛋白質(zhì)親水性分析

圖4 PdFAD3與其他植物FAD3系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 滇牡丹種子不同時期FAD3表達(dá)水平

3 結(jié) 論

ω-3脂肪酸脫氫酶是多不飽和脂肪酸亞麻酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。本研究對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析后克隆得到滇牡丹PdFAD3基因序列，GeneBank登錄號為KX289610, 包含完整的cDNA開放閱讀框，開放閱讀框全長1 353 bp, 編碼450個氨基酸，生物信息學(xué)分析顯示PdFAD3與芍藥FAD3蛋白質(zhì)氨基酸序列相似性高達(dá)94.67%, 親緣關(guān)系較近，屬于FAD3蛋白質(zhì)家族，該蛋白質(zhì)屬于跨膜蛋白質(zhì)，親水性較低。分析結(jié)果顯示ω-3脂肪酸脫氫酶基因比較保守，可以作為未來滇牡丹不飽和脂肪酸高產(chǎn)型新品種培育的調(diào)控研究重點。

[1] 周海梅, 馬錦琦, 苗春雨,等. 牡丹籽油的理化指標(biāo)和脂肪酸成分分析[J]. 中國油脂, 2009, 34(7):72-74.

[2] 李奎. 滇牡丹保護(hù)生物學(xué)與遺傳多樣性研究[D]. 北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院, 2013.

[3] 杭曉敏, 唐涌濂. 多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展[J]. 中國生物工程雜志, 2001, 21(4):18-21.

[4] MARTINS L P, SILVA S D M, ALVES R E. Chilling injury physiology in red mombin fruit (SpondiaspurpureaL.)[J]. Rev Bras Frutic, 2003, 25(1):23-26.

[5] 毛峰, 秦振華. 長鏈多不飽和脂肪酸與人體健康[J]. 醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)資訊, 2006, 3(3):40-41.

[6] 劉紅梅. 油脂中功能性成分的研究進(jìn)展[J]. 輕工科技, 2015(8):24-25.

[7] GIBSON S,ARONDEL V, IBA K, et al. Cloning of a temperature-regulated gene encoding a chloroplastomega-3 desaturase fromArabidopsisthaliana[J]. Plant Physiol, 1995, 106(4):1615-1621.

[8] 劉文浩, 李偉, 陳相艷,等.ω-3脂肪酸脫氫酶在高、低油大豆品種中的克隆與序列分析[J]. 大豆科學(xué), 2008, 27(4):569-571.

[9] 李敏, 高翔, 陳其皎,等. 小麥品種陜253ω-醇溶蛋白基因的克隆及序列分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2010, 18(5):853-860.

[10] SHIMADA T,WAKITA Y, OTANI M, et al. Modification of fatty acid composition in rice plants by transformation with a tobacco microsomal.Omega-3 fatty acid desaturase gene (NtFAD3)[J]. Plant Biotechnol, 2000, 17(1):43-48.

[12] MURAKAMI Y, TSUYAMA M, KOBAYASHI Y, et al. Trienoic fatty acids and plant tolerance of high temperature[J]. Science, 2000, 287(5452):476-479.

[13] 李蘇雨, 王毅, 原曉龍,等. 滇牡丹ω-6脂肪酸脫氫酶基因的克隆與功能分析[J]. 西部林業(yè)科學(xué), 2016，45(2):22-28.

[14] 官玲亮, 侯凱, 陳郡雯,等.ω-6和ω-3脂肪酸脫氫酶家族系統(tǒng)進(jìn)化與功能分化[J]. 遺傳, 2013, 35(5):643-654.

[15] LI S S, WANG L S, SHU Q Y, et al. Fatty acid composition of developing tree peony (PaeoniasectionMoutanDC.) seeds and transcriptome analysis during seed development[J]. BMC Genomics, 2015, 16(1):1-14.

Cloning and functional analysis ofomega-3 fatty acid desaturase gene fromPaeoniadelavayi

ZHUJinxin1,2,SUNJinjin1,2,YUANXiaolong2,3,WANGJuan2,3,YANGYuming2,3,WANGYi2,3

(1.ForestryCollege,SouthwestForestryUniversity,Kunming650224,China; 2.YunnanProvincialKeyLaboratoryofCultivationandExploitationofForestPlants,YunnanLaboratoryforConservation>ofRare,Endangered&EndemicForestPlants,PublicKeyLaboratoryoftheStateForestryAdministration,Kunming650204,China；3.YunnanAcademyofForestry,Kunming650204,China)

Omega-3 fatty acid desaturase is the key enzyme in the biosynthesis pathway of linolenic belonging to polyunsaturated fatty acids. A full-length cDNA sequences of a new FAD3 gene was successfully cloned fromPaeoniadelavayiby RT-PCR method with the specific primers designed based on transcriptome datas, named PdFAD3(GeneBank accession number: KX289610).Bioinformatics analysis results showed that full-length sequence of PdFAD3 gene was 2 134 bp, containing the complete cDNA open reading frame (ORF), encoded a protein with 450 amino acids. Blast comparison results showed that the protein belonged to the FAD family. Analysis results of phylogenetic tree showed thatPaeoniadelavayihad close genetic relationship withPaeonialactiflorabelonging toPaeoniaSect.Paeonia. The protein belonged to the transmembrane protein and was less hydrophilic. RT-PCR results showed that the expression in the seed as maturation occured bimodal change, similar to the FAD3 reported in other species. The PdFAD3 gene cloned fromPaeoniadelavayiprovided a scientific basis for further study on its regulation mechanism and obtainingPaeoniadelavayitransgenic variety with highly unsaturated fatty acids.

Paeoniadelavayi;omega-3 fatty acid desaturase; gene clone; gene functional analysis

2016-06-14；

2016-12-11

云南省林業(yè)科學(xué)院重點實驗室自主創(chuàng)新項目(22CX2016-05)；云南省科技計劃項目(2015A005)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點項目(2013FA054)

朱金鑫(1993)，男，碩士研究生，研究方向為植物分子生物學(xué)(E-mail)1639807959@qq.com。

王 毅，助理研究員(E-mail)22825818@qq.com。

TS222;S502

A

1003-7969(2017)02-0102-05