柏文良，杜業(yè)剛，陳 萌，張浩英，李碧芳

(深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，廣東 深圳 518109)

油脂安全

食用植物油中4種氯丙醇脂肪酸酯的GC-MS測(cè)定方法研究

柏文良，杜業(yè)剛，陳 萌，張浩英，李碧芳

(深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，廣東 深圳 518109)

采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)，建立了同時(shí)測(cè)定食用植物油中3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯(3-MCPD酯)、2-氯-1,3-丙二醇脂肪酸酯(2-MCPD酯)、1,3-二氯-2-丙二醇脂肪酸酯(1,3-DCP酯)和2,3-二氯-1-丙二醇脂肪酸酯(2,3-DCP酯)含量的分析方法。該方法在0.005～0.5 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限0.1 mg/kg，定量限0.2 mg/kg，加標(biāo)回收率在97.2%～106.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.4%～7.1%之間。該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重復(fù)性好，定性定量準(zhǔn)確，對(duì)儀器污染小，能滿足食用植物油中氯丙醇酯的檢測(cè)需求。

食用植物油；3-MCPD酯；2-MCPD酯；1,3-DCP酯；2,3-DCP酯；GC-MS

氯丙醇脂肪酸酯(簡(jiǎn)稱氯丙醇酯)是近年來國(guó)際上新發(fā)現(xiàn)的一類食品污染物，包括3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯(3-MCPD酯)、2-氯-1,3-丙二醇脂肪酸酯(2-MCPD酯)、1,3-二氯-2-丙二醇脂肪酸酯(1,3-DCP酯)和2，3-二氯-1-丙二醇脂肪酸酯(2,3-DCP酯)。氯丙醇酯的健康風(fēng)險(xiǎn)主要是基于其在體內(nèi)水解為氯丙醇的假設(shè)[1]。目前已知3-氯-1，2-丙二醇(3-MCPD)具有遺傳毒性和腎臟毒性，是可能的致癌物，1,3-二氯-2-丙二醇(1,3-DCP)和2,3-二氯-1-丙醇(2,3-DCP)為遺傳毒性致癌物，會(huì)引起小鼠肝臟和腎臟的損傷[2]，其中以3-MCPD在食品中污染量最大，毒性最強(qiáng)，因此常作為氯丙醇類化合物的代表和毒性參照物。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在絕大部分食用植物油中均存在氯丙醇酯，其中尤以棕櫚油、芝麻油、菜籽油、棉籽油等食用植物油中氯丙醇酯的污染問題較突出，油脂精煉各工序中均可能形成3-MCPD酯，但關(guān)鍵在脫臭工序，高溫加快了3-MCPD酯的生成反應(yīng)，幾乎所有3-MCPD 酯是在脫臭這一步形成的，其原因可能是油脂在精煉脫臭工序中脫臭溫度較高，加快了氯丙醇酯的生成反應(yīng)[3-4]。

關(guān)于食用植物油中氯丙醇酯的檢測(cè)方面，國(guó)外已有一些研究，國(guó)內(nèi)還較少，且大多局限于3-MCPD酯。目前食用植物油中氯丙醇酯的檢測(cè)有直接法和間接法兩種[5-6]。直接法不破壞氯丙醇酯的分子結(jié)構(gòu)，采用液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)直接檢測(cè)其含量[7-8]；間接法將食用植物油中氯丙醇酯轉(zhuǎn)化為游離態(tài)的氯丙醇，通過氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)測(cè)定游離氯丙醇的含量[9-11]。受儀器和標(biāo)準(zhǔn)品等限制，目前國(guó)際上多采用間接法測(cè)定植物油中的氯丙醇酯。本研究采用間接法，將樣品中的氯丙醇酯先經(jīng)甲醇鈉甲醇水解為氯丙醇，再以硅藻土固相萃取柱凈化，經(jīng)七氟丁?；溥蜓苌蟛捎肎C-MS檢測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，建立了能夠簡(jiǎn)單快速地同時(shí)檢測(cè)植物油中4種氯丙醇酯(3-MCPD酯、2-MCPD酯、1,3-DCP酯和2,3-DCP酯)的GC-MS。同時(shí)利用該方法對(duì)不同種類的食用植物油中的4種氯丙醇酯進(jìn)行了檢測(cè)，驗(yàn)證了方法的可行性，也為食用植物油中氯丙醇酯變化規(guī)律的研究提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

3-MCPD(純度98%)、d5-3-MCPD(純度97%)，購(gòu)自美國(guó)Aldrich公司；1,3-DCP(純度98%)、2,3-DCP(純度98%)、d5-1,3-DCP(純度98%)、d5-2,3-DCP(純度98%)，購(gòu)自加拿大CDN公司；2-MCPD(純度98%)、d5-2-MCPD(純度98%)、3-MCPD棕櫚酸二酯(純度98%)、d5-3-MCPD棕櫚酸二酯(純度99%)、2-MCPD硬脂酸二酯(純度98%)、d5-2-MCPD硬脂酸二酯(純度99%)，購(gòu)自加拿大TRC公司；由于國(guó)際上暫無1,3-DCP酯、2,3-DCP酯及其內(nèi)標(biāo)售賣，因此內(nèi)標(biāo)用d5-1,3-DCP、d5-2,3-DCP代替d5-1,3-DCP酯、d5-2,3-DCP酯，加標(biāo)試驗(yàn)用1,3-DCP、2,3-DCP代替1,3-DCP酯、2,3-DCP酯。

正己烷、乙酸乙酯、甲醇、冰乙酸，均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck KGaA公司；叔丁基甲基醚，色譜純，購(gòu)自西班牙Scharlau Chemie S.A公司；甲醇鈉(0.5 mol/L)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；無水硫酸鈉，優(yōu)級(jí)純，200℃烘烤4 h后使用；氯化鈉，分析純；七氟丁酰基咪唑(HFBI，純度>97%)，購(gòu)自日本TCI公司。

硅藻土固相萃取柱(Chem ElutTM，3 mL)，購(gòu)自德國(guó)Merck KGaA公司。

特級(jí)初榨橄欖油、大豆油、花生油、芝麻油、茶籽油、菜籽油、棕櫚油，購(gòu)買于深圳市各市場(chǎng)。

Agilent 7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；2-16P型離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；Vortex Genius 3型渦旋儀，德國(guó)IKA公司；CPA2245型電子天平；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；Turbovap LV型濃縮氮吹儀，美國(guó)Biotage公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg的各氯丙醇、氯丙醇酯及其內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，充分混勻得到質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20℃保存，有效期小于等于6個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：取適量3-MCPD棕櫚酸二酯、2-MCPD硬脂酸二酯、1,3-DCP、2,3-DCP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于同一容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(3-MCPD棕櫚酸二酯、2-MCPD硬脂酸二酯均以MCPD 計(jì)，下同)；按照同樣方法，配制d5-3-MCPD棕櫚酸二酯、d5-2-MCPD硬脂酸二酯、d5-1,3-DCP、d5-2, 3-DCP混合內(nèi)標(biāo)工作液，有效期小于等于2周。

同上，分別配制質(zhì)量濃度為10 μg/mL的3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP、2,3-DCP混合標(biāo)準(zhǔn)工作液及d5-3-MCPD、d5-2-MCPD、d5-1,3-DCP、d5-2,3-DCP混合內(nèi)標(biāo)工作液，于-20℃保存，用于配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2.2 樣品的制備

水解：稱取0.1 g食用植物油樣品，準(zhǔn)確加入20 μL上述混合內(nèi)標(biāo)工作液和0.5 mL甲基叔丁基醚-乙酸乙酯(體積比8∶2)，渦旋混勻。隨后加入1 mL甲醇鈉甲醇(0.5 mol/L)，渦旋混勻，室溫靜置4 min 后，迅速加入3 mL冰乙酸與飽和氯化鈉混合溶液(體積比1∶29)和3 mL正己烷，渦旋混勻，靜置分層后棄去上層有機(jī)相，水相待凈化處理。

凈化：將上述水相加至3 mL硅藻土固相萃取柱中，靜置10 min，加入17 mL乙酸乙酯-正己烷(體積比6∶4)洗脫，用15 mL具塞帶刻度玻璃管接收洗脫液，在低于40℃下氮吹至近干，加入1 mL異辛烷復(fù)溶，渦旋混勻，待衍生化。

衍生化：用0.5 mL氣密針加入50 μL衍生試劑HFBI于1 mL異辛烷復(fù)溶液中，立即加蓋密塞，渦旋混合后，于70℃保溫20 min。取出后，放至室溫，加飽和氯化鈉溶液2 mL，渦旋混勻30 s，靜置使兩相分離。取上層有機(jī)相過濾至進(jìn)樣瓶中，待GC-MS 測(cè)定。

1.2.3 檢測(cè)條件

GC條件：DB-5 ms色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度230℃；升溫程序?yàn)槌鯗?0℃，保持1 min，以2℃/min升至78℃，再以40℃/min升至260℃，保持3 min；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μL。

MS條件：電子轟擊源(EI)，能量70 eV；傳輸線溫度280℃；離子源溫度250℃；溶劑延遲時(shí)間5 min；質(zhì)譜采集時(shí)間5～12 min；采用選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)采集，監(jiān)測(cè)的氯丙醇及其內(nèi)標(biāo)衍生物特征離子見表1。

表1 監(jiān)測(cè)的氯丙醇及其內(nèi)標(biāo)衍生物特征離子

化合物保留時(shí)間/min定性離子(m/z)定量離子(m/z)1,3-DCP衍生物10.79677,275,27775d5-1,3-DCP衍生物10.59181,278,280792,3-DCP衍生物11.50677,111,25375d5-2,3-DCP衍生物11.31581,116,257793-MCPD衍生物14.437289,275,453253d5-3-MCPD衍生物14.242278,294,2962572-MCPD衍生物14.798289,291,75253d5-2-MCPD衍生物14.61879,294,296257

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品制備條件的優(yōu)化

水解步驟參考了盧躍鵬等[12]的試驗(yàn)條件，采用冰乙酸與100 g/L硫酸鈉混合溶液(體積比1∶29)中和溶液的堿性，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用飽和氯化鈉溶液比使用硫酸鈉溶液時(shí)的回收率要高。并考察了冰乙酸與飽和氯化鈉溶液體積比為1∶29、2∶28和3∶27 3種比例的溶液，結(jié)果顯示在體積比1∶29時(shí)回收率最高。

洗脫時(shí)，一般采用乙酸乙酯作為洗脫液。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在乙酸乙酯中添加一定比例的正己烷能使之更好地匹配氯丙醇的極性，以減少非目標(biāo)物質(zhì)的干擾。試驗(yàn)結(jié)果表明正己烷比例在50%以上時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響回收率；在20%時(shí)的回收率最高，但隨之洗脫下來的雜質(zhì)也多，干擾檢測(cè)結(jié)果；在40%時(shí)的回收率較為理想，且雜質(zhì)較少，因此采用體積比為6∶4的乙酸乙酯-正己烷混合溶液作為洗脫液。

復(fù)溶時(shí)，盧躍鵬等[12]和里南等[13]使用的溶液是正己烷，但正己烷在接下來的衍生化步驟中，于70℃高溫下極易揮發(fā)，導(dǎo)致定容體積不準(zhǔn)，因此改用揮發(fā)性較弱的異辛烷進(jìn)行復(fù)溶。

2.2 線性試驗(yàn)

準(zhǔn)確移取適量1.2.1中的氯丙醇及混合內(nèi)標(biāo)工作液，以正己烷稀釋氯丙醇質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.1、0.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為0.1 μg/mL。取各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)系列溶液2 mL，低于40℃下氮吹至近干，用異辛烷定容至1 mL，渦旋混勻，按1.2.2進(jìn)行衍生化后分別進(jìn)樣，測(cè)定4種氯丙醇及其內(nèi)標(biāo)相應(yīng)的色譜峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的各氯丙醇與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量比(x)為橫坐標(biāo)，以峰面積(y)比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，4種氯丙醇的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表2。由表2可知，該方法在0.005～0.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。

表2 線性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 方法檢出限和定量限

以空白樣品基質(zhì)(特級(jí)初榨橄欖油)0.200、0.400、0.800、1.00、2.00 mg/kg 5個(gè)水平的3-MCPD棕櫚酸二酯、2-MCPD硬脂酸二酯、1,3-DCP酯(以1,3-DCP代替)、2,3-DCP酯(以2,3-DCP代替)添加回收的響應(yīng)為基礎(chǔ)，以信噪比為3計(jì)算方法的檢出限，以信噪比為10計(jì)算方法的定量限，結(jié)果見表3。由表3可知，該方法的4種MCPD酯檢出限和定量限分別為0.1、0.2 mg/kg。

表3 食用植物油中氯丙醇酯的檢出限和定量限

2.4 方法精密度和準(zhǔn)確度

以空白特級(jí)初榨橄欖油為基質(zhì)，分別在不同的濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，平行制備5個(gè)樣品，以基質(zhì)加標(biāo)的回收率表示方法的準(zhǔn)確度，以加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示方法的精密度。結(jié)果見表4。

由表4可知，氯丙醇酯的各水平空白加標(biāo)的回收率在97.2%～106.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.4%～7.1%之間，說明方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)(n=5)

2.5 樣品檢測(cè)

利用上述分析方法檢測(cè)了6種市售食用植物油樣品中3-MCPD酯、2-MCPD酯、1,3-DCP酯、2,3-DCP 酯的含量，每種樣品做5個(gè)平行樣，取平均值，結(jié)果見表5。

表5 食用植物油樣品中氯丙醇酯的測(cè)定結(jié)果 mg/kg

樣品3-MCPD酯2-MCPD酯1,3-DCP酯2,3-DCP酯大豆油0.5850.506--花生油1.4300.734--芝麻油1.3801.040--茶籽油1.3400.736--菜籽油1.6600.918--棕櫚油4.2001.040--

由表5可知，6種食用植物油中均存在3-MCPD酯和2-MCPD酯的污染，1,3-DCP酯和2,3-DCP酯均未檢出。3-MCPD酯含量和2-MCPD酯含量存在一定的相關(guān)性，3-MCPD酯含量高的樣品中2-MCPD酯含量也較高。棕櫚油受氯丙醇酯的污染最嚴(yán)重，大豆油受污染程度最輕，花生油、芝麻油、茶籽油和菜籽油受污染程度相當(dāng)。造成食用植物油品種間氯丙醇酯污染水平差異的原因可能是不同油料所含氯丙醇酯的前體物質(zhì)，如三?；视王?、氯離子等含量存在差異以及精煉工藝的差異[14]。精煉時(shí)若采用磷酸脫膠，可能會(huì)增加體系中的氯離子含量，導(dǎo)致氯丙醇酯含量增加；脫色助劑的種類和酸性強(qiáng)弱也會(huì)影響油脂體系中的氯丙醇酯含量；精煉植物油氯丙醇酯主要產(chǎn)生于脫臭工序，脫臭溫度越高，需通入的水蒸氣就越多，氯丙醇酯含量也越高。

3 結(jié) 論

建立了同時(shí)測(cè)定食用植物油中3-MCPD酯、2-MCPD酯、1,3-DCP酯、2,3-DCP酯含量的GC-MS。該方法在0.005～0.5 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0.1 mg/kg，定量限為0.2 mg/kg，加標(biāo)回收率在97.2%～106.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.4%～7.1%之間。本方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，定性定量準(zhǔn)確，重復(fù)性好，對(duì)儀器污染小，能夠很好地滿足食用植物油中氯丙醇酯的檢測(cè)以及相關(guān)質(zhì)監(jiān)部門監(jiān)管需要。

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Determination of four kinds of chloropropanols fatty acid esters in edible vegetable oil by GC-MS

BAI Wenliang, DU Yegang, CHEN Meng, ZHANG Haoying, LI Bifang

(Shenzhen Academy of Metrology & Quality Inspection, Shenzhen 518109,Guangdong, China)

A method for the simultaneous determination of the contents of 3-monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD ester), 2-monochloropropane-1,3-diol (2-MCPD ester), 1,3-dichloropropane-2-ol (1, 3- DCP ester) and 2,3-dichloropropane-1-ol(2,3-DCP ester) in edible vegetable oil was established by gas chromatography-mass spectrography (GC-MS). The method showed good linear relationship in the range of 0.005-0.5 mg/L. The detection limit and quantification limit were 0.1 mg/kg and 0.2 mg/kg respectively. The recovery rate was between 97.2%- 106.0%, and the relative standard deviation was between 3.4%- 7.1%. The method was easily operated with good sensitivity, good repeatability, precise quanlification and quantification and little pollution to instrument, and it could meet the determination demand of chloropropanols fatty acid esters in edible vegetable oil.

edible vegetable oil; 3-MCPD ester; 2-MCPD ester; 1,3- DCP ester; 2,3-DCP ester; GC-MS

2016-05-21；

2016-11-16

柏文良(1984)，男，工程師，碩士，主要從事食品安全檢測(cè)與研究工作(E-mail)reagee@qq.com。

李碧芳，高級(jí)工程師，碩士(E-mail)libf@smq.com.com。

TS225.1;TS201.6

A

1003-7969(2017)02-0081-05