顧沛玲陳愛平* 孫金霞

（1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生部，山東 青島 266003；2 臨沂市中心醫(yī)院，山東 臨沂 276400）

卵巢癌組織中DLL4及CD105的表達(dá)及臨床意義

顧沛玲1,2陳愛平1* 孫金霞2

（1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生部，山東 青島 266003；2 臨沂市中心醫(yī)院，山東 臨沂 276400）

目的 檢測Notch-Delta樣配體（DLL4）及CD105在卵巢癌中的表達(dá)及相關(guān)性，并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化，采用S-P法，選取臨沂市中心醫(yī)院2015年1月至2016年8月來自手術(shù)中切除的卵巢癌標(biāo)本65例，用卵巢正常組織18例作對(duì)比，測定DLL4的表達(dá)及CD105標(biāo)記的微血管密度（CD105-MVD）。結(jié)果 DLL4及CD105在卵巢癌組織中的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織（P＜0.001）。在卵巢癌中，DLL4的陽性表達(dá)及CD105-MVD與卵巢癌的臨床分期、病理分級(jí)、是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性（P＜0.001），而與患者年齡、組織學(xué)類型無相關(guān)性（P＞0.05），且在卵巢癌中，DLL4的陽性表達(dá)與CD105-MVD呈正相關(guān)。結(jié)論 DLL4在腫瘤新生血管中起重要作用，并與卵巢癌的轉(zhuǎn)移、浸潤相關(guān)。DLL4和CD105聯(lián)合檢測可作為判斷卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要指標(biāo)，并為抗血管治療提供依據(jù)。

卵巢癌；DLL4；CD105；微血管密度

卵巢癌病死率位居?jì)D科惡性腫瘤的首位，卵巢位于盆腔深部，一般體檢不容易發(fā)現(xiàn)異常，加之卵巢癌的早期癥狀不典型，且沒有有效的早期診斷方法，所以確診卵巢癌時(shí)70%的患者為晚期[1]，故提高治療效果是延長生存時(shí)間的關(guān)鍵。卵巢癌5年生存率徘徊在20.0%～36.1%，大部分晚期卵巢癌患者死于腫瘤復(fù)發(fā)。然而卵巢癌的發(fā)病機(jī)制至今不清楚，研究顯示，惡性腫瘤的生長總是伴隨其周圍血管的發(fā)生與發(fā)展，用來供給所需營養(yǎng)成分，血管生長越活躍，腫瘤的侵襲性就越強(qiáng)[2]。Ueda等[3]提出，卵巢上皮癌預(yù)后差，新生血管密集是一個(gè)不可忽視的重要因素，因?yàn)槠溲苌沙潭戎苯佑绊懙脚R床進(jìn)展。目前研究的抗新生血管治療的主要目標(biāo)是受體，臨床證實(shí)有一定的療效[4]。但近幾年來發(fā)現(xiàn)，受體治療出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象[5]，所以，探索新的治療方法已是卵巢癌患者延長生存時(shí)間的急切需求。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)：DLL4（與Notch受體相對(duì)應(yīng)的配體蛋白：Notch-Delta樣配體）參與了腫瘤血管的發(fā)展[6-7]。根據(jù)在腫瘤血管中DLL4所起的作用，將為抗血管治療提供新的靶點(diǎn)。CD105參與了新生毛細(xì)血管的形成，是目前有效的毛細(xì)血管標(biāo)志物[8]。CD105獨(dú)立表達(dá)于腫瘤細(xì)胞本身，因此它可以成功標(biāo)記卵巢癌新生血管。CD105標(biāo)注的MVD能體現(xiàn)卵巢癌組織中血管的增殖程度，從而能反映出卵巢癌的生物效應(yīng)。此實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DLL4單克隆抗體和CD105單克隆抗體監(jiān)測卵巢癌組織中DLL4和CD105-MVD的表達(dá)，并分析這兩個(gè)因子的關(guān)系及討論它們?cè)诼殉舶┲械囊饬x。

1 材料與方法

1.1 一般資料：選臨沂市中心醫(yī)院婦科2015年1月至2016年8月經(jīng)手術(shù)切除的卵巢癌組織標(biāo)本65例，術(shù)前均未經(jīng)過任何治療，患者年齡29～73歲，平均年齡51歲。選擇同時(shí)間段手術(shù)切除的18例正常卵巢組織（因子宮肌瘤或子宮腺肌癥等行全子宮+雙附件切除，且卵巢無病變），該組患者的年齡43～65歲，平均年齡54歲。所有患者的病歷資料完整，并且附有經(jīng)2名病理醫(yī)師診斷的病理結(jié)果。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)所需要的材料：在上?；蚩萍加邢薰举徺I的CD105和DLL4兔抗。標(biāo)本處理：對(duì)選取的每張蠟片重新切4張，每張切片厚4 μm。。

1.3 方法

1.3.1 染色方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)中S-P法，染色所有選取的標(biāo)本，并進(jìn)行血管標(biāo)記。

1.3.2 結(jié)果判斷：DLL4陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，以在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號(hào)，計(jì)算每張切片的陽性細(xì)胞與總細(xì)胞的百分比，計(jì)算其平均值，若陽性細(xì)胞數(shù)＜10%，則為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)≥10%，記為陽性；計(jì)算MVD的方法參照Weidner等[9]報(bào)道，開始先用低倍鏡（×40）觀察整個(gè)切片，找出腫瘤內(nèi)最高血管密度區(qū)，也就是常說的熱點(diǎn)處，然后應(yīng)用×200高倍鏡觀察看熱點(diǎn)處的切片，每一個(gè)棕色染色的、并且和周圍的腫瘤細(xì)胞和結(jié)締組織成分差別很大的內(nèi)皮細(xì)胞（或內(nèi)皮細(xì)胞簇）就可記為一個(gè)血管計(jì)數(shù)；只要是不相連的結(jié)構(gòu)，它們的分支也算為一個(gè)血管計(jì)數(shù)；只要肌層較厚、或管腔直徑＞8個(gè)紅細(xì)胞大小都不應(yīng)計(jì)數(shù)。該患者的MVD值就是計(jì)算3個(gè)視野內(nèi)的MVD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS19.0軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。用χ2檢驗(yàn)分析計(jì)數(shù)資料的組間比較，t檢驗(yàn)分析定量資料的均數(shù)的兩組間比較，單因素方差分析多組間比較。兩個(gè)變量的相關(guān)分析使用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水平以P＜0.05為有明顯的差異性。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌與正常卵巢組織中DLL4的表達(dá)：通過本實(shí)驗(yàn)得知：DLL4在卵巢中表達(dá)陽性，并廣泛定位于細(xì)胞核，染色呈棕黃色細(xì)顆粒（圖1）。DLL4在正常卵巢組織中基本無表達(dá)或低表達(dá)。65例卵巢癌患者中DLL4表達(dá)陽性的有51例，表達(dá)陰性的有14例，DLL4的陽性表達(dá)率在卵巢癌患者中為78.5%，18例正常卵巢組織中DLL4表達(dá)陽性者僅2例，表達(dá)陰性的有16例，DLL4在正常卵巢組織中的陽性表達(dá)率為11.1%，二者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝27.704，P＜0.001），見表1和圖1。

表1 卵巢癌及正常卵巢組織中DLL4的表達(dá)

圖1 卵巢癌中DLL4的表達(dá)

2.2 卵巢癌中，DLL4的表達(dá)情況與患者臨床、病理之間的關(guān)系：卵巢癌中，DLL4的表達(dá)情況與臨床的分期、卵巢癌的分化程度、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有相關(guān)（P＜0.01），但和患者組織學(xué)類型、年齡無相關(guān)（P＞0.05），見表2。

2.3 卵巢癌、正常卵巢組織中CD105-MVD的表達(dá)：試驗(yàn)得知：CD105在卵巢癌組織的表達(dá)為陽性（圖2），在正常卵巢組織中基本無表達(dá)或低表達(dá)。CD105-MVD在卵巢癌患者為（22.58±7.34）、在正常卵巢中是（0.87±0.19），二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見表3，所以得出CD105在卵巢癌組織中明顯高于正常卵巢組織。

2.4 卵巢癌中，CD105-MVD與患者的臨床、病理之間的關(guān)系分析：CD105的陽性表達(dá)與卵巢癌的分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有相關(guān)性（P＜0.05），和織學(xué)類型、年齡無相關(guān)性（P＞0.05），見表4。

表2 DLL4的表達(dá)水平與患者臨床、病理之間的關(guān)系

圖2 CD105在卵巢癌組織的表達(dá)

表3 CD105-MVD在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(dá)

表4 卵巢癌中CD105-MVD的表達(dá)水平與患者臨床、病理指標(biāo)之間的關(guān)系

2.5 卵巢癌組織中DLL4和CD105表達(dá)的關(guān)系：結(jié)果顯示：二因子在卵巢癌的表達(dá)是呈正相關(guān)的（r2＝0.813，P＜0.001），見表5。

表5 卵巢癌組織中DLL4和CD105表達(dá)的關(guān)系

3 討 論

腫瘤的成長和生存必須依賴腫瘤血管發(fā)生的過程來持續(xù)長出新血管提供氧氣和營養(yǎng)以支持正在成長的腫瘤塊[10]。20世紀(jì)70年代以后，相關(guān)科研人員努力研究腫瘤進(jìn)展過程中血管產(chǎn)生的作用與機(jī)制，近年來的研究表明，Notch-Delta樣配體（DLL4）參與對(duì)血管生長及調(diào)控，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。有研究人員分別在膀胱癌[11]、腎癌[12]等腫瘤組織的血管中發(fā)現(xiàn)DLL4的高水平表達(dá)，并和患者預(yù)后差有顯著相關(guān)性。在人類乳腺癌中，Jubb[13]等發(fā)現(xiàn)在73%乳腺癌組織中DLL4高表達(dá)，而且這些患者的復(fù)發(fā)率表現(xiàn)出上升趨勢、5年生存率卻逐漸下降。李慧珍等[14]采用免疫組化對(duì)卵巢癌、卵巢良性腫瘤組織和正常卵巢組織中Notch的表達(dá)水平進(jìn)行探索，結(jié)果顯示在卵巢癌中Notch呈現(xiàn)高水平表達(dá)，得出Notch的表達(dá)水平與卵巢癌的病理學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，但與患者年齡、組織學(xué)類型無相關(guān)性。HU等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌和卵巢癌內(nèi)皮細(xì)胞中DLL4起著不可估量的作用，由此可知DLL4可為評(píng)估卵巢癌患者生存率的相對(duì)獨(dú)立因子。Ridgway[16]等研究發(fā)現(xiàn)，阻斷DLL4-Notch信號(hào)通路可導(dǎo)致導(dǎo)致腫瘤組織生成大量沒有功能的新生血管，這種沒有功能的新生血管可抑制和延緩腫瘤細(xì)胞的生長，致使腫瘤組織缺血從而抑制其生長。所以DLL4-Notch信號(hào)通路有可能成為腫瘤血管發(fā)生的新靶點(diǎn)，有望為腫瘤治療提供新的方向。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示DLL4可促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移，其高表達(dá)則預(yù)后差。

腫瘤組織中血管的內(nèi)皮細(xì)胞增生比正常組織高出20～2000倍，它產(chǎn)生的新生血管是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的的基礎(chǔ)[17]。通過測定腫瘤血管的MVD來判斷血管的數(shù)量[18]，Sand等[19]研究證實(shí)，和vWF、CD34比較，CD105作為腫瘤血管標(biāo)志物可以更準(zhǔn)確地作為預(yù)測腫瘤患者的預(yù)后。所以CD105是測量腫瘤微血管密度的金標(biāo)準(zhǔn)[20]。在新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞上CD105表現(xiàn)高水平表達(dá)，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生重要標(biāo)志之一[21]，且CD105只在正增殖的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)，在正常組織的血管上不表達(dá)，這種獨(dú)有的分布特點(diǎn)提示它可作為惡性腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。有試驗(yàn)研究表明，在黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、卵巢癌，胃癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、肺癌、乳腺癌，均檢測出了CD105的表達(dá)，而且和腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)顯示：在卵巢癌組織中，CD105-MVD明顯高于正常卵巢組織，并且與卵巢癌的病理分級(jí)、是否伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)。提示CD105可能成為預(yù)測卵巢癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移及判斷其預(yù)后的有效的生物學(xué)指標(biāo)。

根據(jù)Pearson相關(guān)分析結(jié)果，在卵巢癌組織中，DLL4和CD105的表達(dá)呈正相關(guān)，揭示DLL4和CD105在腫瘤血管的發(fā)生中有重要作用，將二者聯(lián)合則可提高檢測卵巢癌的準(zhǔn)確度、且指導(dǎo)卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，同時(shí)為卵巢癌的防治提供新的思路，并為輔助治療提供依據(jù)。

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Expression and Clinical Significance of DLL4 and CD105in Ovarian Cancer Tissue

GU Pei-ling1,2, CHEN Ai-ping1, SUN Jin-xia2
(1 Department of Graduate, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266003, China; 2 Linyi Central Hospital, Linyin 276400, China)

Objective To detect the expression and correlation of DLL4 and CD105in ovarian cancer, and analyze the relationship of clinical pathological parameters. Methods The expression of DLL4 and microvascular density marked by CD105(CD105-MVD) in samples of 65 ovarian carcinoma and 18 normal ovarian tissue colleted from surgical removal in linyi center hospital from January 2015 to August 2016 were detected by immunohistochemical methods of S-P. Results The expression of DLL4 and CD105in ovarian cancer tissue was significantly higher than that in normal ovarian tissue (P＜0.001). In ovarian cancer, the expression of DLL4 and CD105-MVD was positively associated with the clinical stage, pathological grade of ovarian cancer and lymph node metastasis (P＜0.001), but no correlation with patients age, histological type (P＞0.05), and in ovarian cancer, the expression of DLL4 positively correlates with CD105-MVD. Conclusion DLL4 plays an important role in tumor angiogenesis, and associated with the transfer, infiltration of ovarian cancer. The combined detection of DLL4 and CD105-MVD is an important indicator of judging the invasion and metastasis and prognosis of ovarian cancer, and provide the basis for the antiangiogenesis therapy.

Ovarian cancer; CD105; DLL4; Microvascular density

R737.31

B

1671-8194（2017）07-0010-03

*通訊作者：E-mail:chenaiping516@163.com