元雪芳，劉 健，牛江露

(1.易安藍焰煤與煤層氣共采技術(shù)有限責(zé)任公司，山西 晉城 048000；2.煤與煤層氣共采國家重點實驗室，山西 晉城 048000)

·問題探討·

寺河水樣微生物代謝類型研究

元雪芳1,2，劉 健1,2，牛江露1,2

(1.易安藍焰煤與煤層氣共采技術(shù)有限責(zé)任公司，山西 晉城 048000；2.煤與煤層氣共采國家重點實驗室，山西 晉城 048000)

在實驗室條件下，通過對寺河地區(qū)煤層水中微生物古菌的高通量測序分析，發(fā)現(xiàn)水樣中存在可以產(chǎn)氣的產(chǎn)甲烷古菌，以水樣作為研究對象，分別添加H2和CO2、乙酸鈉、甲醇作為外源碳源，研究寺河地區(qū)煤層水中的產(chǎn)甲烷菌哪種途徑產(chǎn)氣效果最好。結(jié)果顯示：沁水盆地煤層水中的產(chǎn)甲烷古菌通過3種代謝途徑都可以產(chǎn)氣，其中以甲基營養(yǎng)型產(chǎn)氣最好，氫營養(yǎng)型次之，乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)氣效果較差。

煤層水；高通量測序分析；產(chǎn)甲烷菌；代謝途徑；甲烷菌類型

煤層生物氣的生成需要煤層滿足埋藏淺、高滲透性和高含水性等條件[1]. 有研究表明，沁水盆地有生物氣存在的可能性。煤層中可以形成次生生物氣，形成次生生物氣的具體途徑主要是微生物還原CO2，煤層中的可溶有機質(zhì)、CO2、H2、氣態(tài)重?zé)N及水都可以成為微生物利用并最終形成次生生物氣的碳源和氫源物質(zhì)[2-4]. Gupta等認(rèn)為礦井水中的微生物群落更適合用于煤的生物降解，并分析了礦井水中微生物的群落[5]. 林海課題組從厭氧污泥中富集了產(chǎn)甲烷菌群并以煤為碳源對其進行了馴化,證實該菌群可以利用乙酸鹽和甲醇產(chǎn)甲烷,也可以利用煤產(chǎn)生甲烷[6]. 國內(nèi)致力于煤層本源菌的研究，而國外對外源菌的研究較多。

產(chǎn)甲烷是產(chǎn)甲烷菌獲得能量的唯一途徑，同時產(chǎn)甲烷菌是唯一以甲烷作為代謝終產(chǎn)物的微生物類群，產(chǎn)甲烷古菌利用的底物種類非常有限，根據(jù)底物利用特征主要可以分為3種代謝類型:氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌、甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌和乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌[7-10].

本文通過對寺河地區(qū)煤層水樣中的古菌多樣性進行分析后，加入H2和CO2、乙酸鈉、甲醇作為碳源底物，探索寺河水樣中的微生物的代謝類型。

1 試 驗

1.1 材 料

1.1.1 菌 群

試驗所用菌群取自寺河礦區(qū)煤層氣井出水口，在氮氣環(huán)境的保護下，迅速用滅菌的密封罐對準(zhǔn)出水口接取，并對罐口充氮氣密封，送回實驗室備用。送回實驗室的水樣要在熒光顯微鏡下觀察，用420 nm紫外波長進行照射，看是否發(fā)藍綠熒光，確保有產(chǎn)甲烷菌群的存在。

1.1.2 煤 樣

試驗用煤采自沁水盆地寺河礦區(qū)主采煤層，將煤樣敲碎，放入球磨機中研磨兩分鐘，過篩，去20～40目煤粒放入?yún)捬跸渲袀溆谩?/p>

1.1.3 主要儀器

HIRAYAMA HVE-50滅菌鍋，安捷倫7890A氣相色譜，500 mL的厭氧瓶，DWS厭氧操作箱，LRH-500F恒溫培養(yǎng)箱。

1.1.4 培養(yǎng)基成分

NH4Cl 0.2 g/L KH2PO40.2 g/L K2HPO40.2 g/L MgCl20.2 g/L YE 1 g/L每升中加入1 mL的刃天青作為氧化還原的指示劑；121 ℃滅菌20 min，滅菌后放入?yún)捬跸渲谐鮽溆谩?/p>

1.2 水樣中古菌的高通量測序

實驗中為了保證基因組DNA提取效果，采用OMEGA水樣DNA提取試劑盒，收集的水樣菌體進行DNA提取，提取方法嚴(yán)格按照說明書操作方法進行。提取的基因組用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)DNA無污染、無降解。然后用特異性引物擴增V6-F(5’-CAACGCGARGAACCTTACC-3’)和V6-R(5’-CGACAGCCATGCANCACCT-3’)進行PCR擴增，利用OLIGO軟件預(yù)測PCR擴增條件，擴增古菌16SrdnaV6區(qū)片段PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定條帶大小并無雜帶，送深圳華大科技公司進行ILLUMINA雙末端測序分析。

1.3 實驗設(shè)計

選取100 mL的血清瓶，設(shè)置3組實驗，每組實驗兩個平行樣。每個厭血清瓶中加入50 mL培養(yǎng)基、20 mL的煤層水樣和5 g的20～40目的煤粒，SHB1組中另外加入1 mL的甲醇作為碳源底物；SHB2中加入乙酸鈉2.5 g；SHB3中添入50 mL的4∶1的H2和CO2的混合氣體。血清瓶用橡膠塞和鋁蓋密封，所有操作均在厭氧箱中進行。

1.4 甲烷氣體組分測定

甲烷氣體含量的測定采用安捷倫7890A氣相色譜儀，色譜柱為Agilent Carbonplot(60 m×320 μm),載氣為高純氮氣，填充柱進樣口溫度150 ℃，隔墊吹掃流量3 mL/min,進樣量500 μL,柱箱溫度25 ℃，保持7.5 min，檢測器為TCD. 檢測溫度200 ℃，參比流量400 mL/min,尾流量8 mL/min.

甲烷含量=甲烷實際出峰面積×(標(biāo)氣中甲烷濃度/標(biāo)氣中甲烷平均峰面積)

2 結(jié)果與討論

2.1 古菌V6高變區(qū)測序結(jié)果分析

實驗室中提取的DNA經(jīng)瓊脂糖檢測條帶大小在23 kb左右，用16SrdnaV6區(qū)特異性引物進行擴增，pcr產(chǎn)物圖見圖1，水樣中微生物擴增條帶清晰明顯，與Maker比對大小在100 bp左右，無污染。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖

將測序所得的序列在GENEBANK數(shù)據(jù)庫中比對結(jié)果如下：水樣中的古菌類群都屬于廣古菌門，包含了甲烷微球菌綱和甲烷桿菌綱。其中，甲烷微球菌綱又分為甲烷微菌目、甲烷八疊球菌目；甲烷桿菌綱分為甲烷桿菌目，細(xì)分為甲烷鬃菌科和甲烷桿菌科，到屬的水平劃分為甲烷爍菌屬、甲烷絲狀菌屬和甲烷細(xì)菌屬。其中甲烷細(xì)菌屬為氫營養(yǎng)和甲基營養(yǎng)型都可以的代謝途徑；甲烷爍菌屬為氫營養(yǎng)型，甲烷絲狀菌屬為乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑。水樣中甲烷古菌的類型圖見圖2.

圖2 水樣中甲烷古菌的類型圖

氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌利用H2、甲酸鹽等電子供體還原CO2產(chǎn)生CH4；有的氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌可以利用二元醇、丙酮酸鹽作為電子供體進行產(chǎn)甲烷。甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌能利用甲基類化合物(如甲醇)、甲胺類化合物(如甲胺、二甲胺、三甲胺)和甲基硫化合物(如甲硫醇、二甲基硫)進行產(chǎn)CH4生長；乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌只利用乙酸產(chǎn)生CH4和CO2. 具體的代謝反應(yīng)見表1.

表1 不同類型營養(yǎng)型古菌的代謝反應(yīng)表

2.2 底物類型對微生物產(chǎn)氣含量分析

每組樣品中氣體主要是由CH4和CO2組成，樣

品中各氣體的組分含量及變化趨勢見圖3. SHB1組的甲烷含量最高為30.88%，SHB2組的甲烷含量最高為4.2%，SHB3組的甲烷含量最高為13.76%. 其中，隨著甲烷含量的升高，SHB2組的CO2呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢，其余兩組的CO2含量都是逐步降低的趨勢。加入甲醇的SHB1組，微生物的活性在第21～28天出現(xiàn)了一個倍數(shù)的增長，到28天后到達一個生長緩慢的平穩(wěn)期。這是因為產(chǎn)甲烷菌利用甲醇合成自身的細(xì)胞物質(zhì)，使其數(shù)量有效的增長直接導(dǎo)致氣體組分中CH4含量的顯著增加。

圖3 樣品中CH4和CO2相對含量的變化特征曲線圖

甲醇、乙酸鈉、混合氣的添加均增加了系統(tǒng)中CH4的含量，乙酸鈉溶解在水中形成CHCOO-可直接被產(chǎn)甲烷菌利用，產(chǎn)生CH4和CO2，而CO2的生成會降低菌液的PH值，這可能是加入乙酸鈉對產(chǎn)甲烷激活作用不明顯的原因。混合氣的加入直接激活了水樣中氫營養(yǎng)型甲烷菌的活性，但是系統(tǒng)中H2和CO2的比例又是限制氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌活性的重要因素。

寺河水樣中微生物以甲醇、乙酸鈉和混合氣為底物的3種代謝活動類型都能產(chǎn)氣，其中以甲基型產(chǎn)氣類型較好，乙基型產(chǎn)氣類型較差。

由水樣高通量測序發(fā)現(xiàn)甲烷絲狀菌屬產(chǎn)甲烷菌群較多，它主要以乙酸途徑為主，但是由實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲基產(chǎn)甲烷效果最好，其中可能存在的原因有：1) 以甲醇為底物的產(chǎn)氣途徑，微生物能較快的利用甲醇產(chǎn)甲烷，加入混合氣的產(chǎn)甲烷途徑，雖然是按1∶4的比例進行了添加，但是不能確保添加進入的氣體的比例，而添加乙酸鈉的產(chǎn)氣途徑中，乙酸鈉的水解速率可能限制了甲烷產(chǎn)生的速率。2) 甲烷絲狀菌屬又歸為甲烷八疊球菌目中，其中甲烷八疊球菌目中有甲基產(chǎn)甲烷八疊球菌，因此加入甲酸鈉和甲醇的產(chǎn)氣含量高不排除激活了甲烷八疊球菌目中的某一類群甲烷菌。

3 結(jié) 論

寺河水樣中微生物的類群主要以廣古菌門、甲烷八疊球菌目為主，其中的古菌類群主要有甲烷絲狀菌屬、甲烷爍菌屬和甲烷細(xì)菌屬。以水樣作為菌源，甲醇、乙酸鈉、混合氣作為底物的產(chǎn)氣實驗表明，3種底物類型均可以激活寺河水樣中的微生物產(chǎn)甲烷，其中以加入甲醇的產(chǎn)甲烷類型最好，加入混合氣的代謝途徑次之，以乙酸鈉為底物的代謝途徑較差。但是系統(tǒng)中具體是哪種菌在起作用還需進一步的研究。

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Study on Microbial Metabolic Types of Water in Sihe Coal Mine

YUAN Xuefang, LIU Jian, NIU Jianglu

Under the laboratory conditions, by the high-flux sequencing analysis of microbial archaea in coal seam water, it is found that there are methanogenic bacteria in the water sample, and the water samples are used as the research object, CO2, H, sodium acetate and methanol being the exogenous carbon sources, to seek for the best way for methane production in coal seam water. The results show that the methanogenic bacteria gas in coal seam water in Qinshui basin can be produced by all the three pathways, among which methyl is the best, the hydrogen good and the acetic acid nutrition poor.

Coal seam water; High-flux sequencing analysis; Methanogens; Metabolic pathways; Methane bacteria type

2016-12-18

山西省煤炭煤基重點科技攻關(guān)項目—煤地質(zhì)微生物成氣機理研究(MQ2014-03)

元雪芳(1986—)，女，山西晉城人，2009年畢業(yè)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，助理工程師，主要從事煤炭生物氣化試驗工作

(E-mail)1325771086@qq.com

TD712

B

1672-0652(2017)02-0050-03