黃 智,肖 南

(華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642)

超聲與微波輔助提取陳皮中橙皮苷及其抗氧化性研究

黃 智,肖 南*

(華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642)

將超聲波與微波輔助提取法進行對比,旨在確定具有較高提取效率的提取陳皮中陳皮苷的方法,同時評價橙皮苷提取物的抗氧化活性。以1年制陳皮為原材料,橙皮苷為檢測指標,考慮料液比、提取時間、提取功率三個因素,通過正交實驗優(yōu)化超聲波和微波輔助提取橙皮苷的條件。結果表明,超聲波輔助提取橙皮苷的最優(yōu)工藝條件為:料液比1∶50、超聲波時間25 min、超聲波功率80 W,在該條件下橙皮苷得率是8.06%±0.02%;而微波輔助提取橙皮苷的最優(yōu)工藝條件為:料液比1∶50、微波時間40 s、微波功率為240 W,在該條件下橙皮苷的提取率為8.12%±0.04%。相比于超聲輔助提取法,微波輔助提法提取時間短,且提取率高,因此采用微波輔助提取法提取橙皮苷是較有效的方法。通過三種抗氧化體系分析橙皮苷抗氧化活性,結果顯示橙皮苷對有機自由基DPPH·、羥自由基·OH有一定的清除作用,對Fe3+也有一定的還原能力。

超聲波,微波,橙皮苷,抗氧化性

作為柑橘生鮮產(chǎn)品的副產(chǎn)品,陳皮有巨大食用藥用價值,但目前國內陳皮資源的開發(fā)利用仍處于發(fā)展階段。橙皮苷是陳皮中最主要的功能性成分,具有抗過敏、降血壓、抑制癌變和抗病毒等作用[1-2]。鑒于橙皮苷顯著的生物活性,其提取工藝是當前食品、醫(yī)藥等行業(yè)研究的熱點。橙皮苷傳統(tǒng)提取方法主要有有機溶劑提取法[3]、堿提酸沉法[4]、酶解[5]等方法。近年來,超聲、微波輔助提取技術因具有高效、快速、節(jié)省時間和能源等優(yōu)點在生物活性物質萃取領域取得了顯著進展,橙皮苷的超聲及微波輔助提取法[6-7]也得到了廣泛的應用與研究。李雪誼等[8]采用超聲波輔助提取柑橘皮中的橙皮苷,通過正交實驗得到最佳提取工藝:料液比30 mL/g、提取溫度60 ℃、超聲功率240 W、超聲時間30 min,在最佳工藝下所得橙皮苷含量高且實驗重復性好。孫秀利等[9]運用微波法從陳皮中提取橙皮苷,在最佳工藝下橙皮苷提取率可達到2.40%,同時與傳統(tǒng)熱回流提取法進行對比,表明微波法具有縮短提取時間且節(jié)省生產(chǎn)成本的優(yōu)點。超聲波與微波輔助提取法雖然都具有較高的提取效率,但關于比較兩者提取效率的研究目前尚少。因此,本文將超聲波與微波輔助提取法進行對比,旨在確定具有較高提取效率的提取方法,同時評價橙皮苷提取物的抗氧化活性,為橙皮苷生產(chǎn)機械化、專業(yè)化、創(chuàng)新化提供理論基礎,提高陳皮的經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1年陳皮 廣州東鵬特飲有限公司;橙皮苷標準對照品 上海如吉生物科技有限公司;維生素C、水楊酸 廣州牌化學試劑;無水乙醇 天津市富宇精細化工有限公司;七水合硫酸亞鐵、三氯化鐵 廣州牌化學試劑;三吡啶三吖嗪(TPTZ) 北京索萊寶科技有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

CFT-100 100 g手提式高速中藥粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;UV-1800 島津紫外分光光度計 日本島津儀器有限公司;G8023CSL-K3微波爐 佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司;SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限公司;DHG-9053BS-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;Centrifuge 5804R 臺式高速離心機 德國艾本德(中國)股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 橙皮苷的提取 陳皮→烘干→粉碎→過60目篩→準確稱量1.0000 g陳皮→加70%乙醇溶解→攪拌→靜置30 min→移入超聲波/微波反應系統(tǒng)→4000r/min離心10 min→減壓抽濾→橙皮苷提取物→稀釋100倍→284.0 nm 波長處測吸光度。

1.2.2 樣品中橙皮苷提取率計算公式

1.2.3 橙皮苷標準曲線繪制 準確稱取橙皮苷標準品0.0100 g 移入100 mL容量瓶中,用70%乙醇配制成濃度為0.1 mg/mL的母液。從中分別取出1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的母液,移入10 mL的具塞試管中,用70%乙醇稀釋至刻度,分別得到質量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的標準樣液。用紫外-可見分光光度計在284.0 nm波長下測定標準樣液的吸光度,以濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4 超聲輔助提取法

1.2.4.1 超聲輔助提取法單因素實驗 根據(jù)預實驗結果,分別考慮以下單因素:

在超聲功率60 W,超聲時間5 min,分別選擇1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60料液比進行實驗;

在料液比1∶30,超聲時間5 min的條件下,分別選擇60、70、80、90、100 W超聲提取功率進行實驗;

在超聲功率60 W,料液比1∶30的條件下,分別選擇5、10、15、20、25 min提取時間進行實驗。

1.2.4.2 超聲輔助提取法正交實驗設計 在單因素實驗基礎上,以料液比、超聲功率、超聲時間為實驗考察因素,以橙皮苷提取率為評價指標,設計L9(33)正交實驗優(yōu)化提取條件,因素與水平設計見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.5 微波輔助提取法

1.2.5.1 微波輔助提取法單因素實驗 根據(jù)預實驗結果,分別考慮以下單因素:

在微波功率240 W,微波時間60 s的條件下,分別選擇1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60料液比進行實驗;

在料液比1∶30,微波時間60 s的條件下,分別選擇160、240、320、400、480 W微波提取功率進行實驗;

在微波功率240 W,料液比1∶30的條件下,分別選擇20、40、60、80、100 s提取時間進行實驗。

1.2.5.2 微波輔助提取法正交實驗設計 在單因素實驗基礎上,以料液比、微波功率、微波時間為因子,以橙皮苷提取率為評價指標,設計L9(33)正交實驗優(yōu)化提取條件,因素與水平設計見表2。

表2 正交實驗因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.6 橙皮苷抗氧化性

1.2.6.1 DPPH·自由基清除能力 參照Cotellen[10]的方法稍作修改。用分析天平稱量一定量橙皮苷提取物,加入70%乙醇溶液,定容于100 mL容量瓶,分別配制成質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6 mg/mL的樣品待測液,同時制備0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液;取5.6 mL DPPH·溶液與0.4 mL樣品混合均勻在暗處放置30 min后于517 nm波長下測吸光值Ai,以70%乙醇溶液為參比獲得空白樣吸光度A0,每個試樣作三次平行實驗,取其平均值,代入以下清除率計算公式中獲得清除率。以維生素C為陽性對照。清除率計算公式如下:

式中:A0-空白樣吸光度;Ai-試樣吸光度。

1.2.6.2 ·OH自由基清除能力 參照Fenton反應稍作修改。在試管中分別加入濃度均為10.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、6.0 mmol/L FeSO4溶液各1.0 mL,分別加入0.1、0.2、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6 mg/mL樣品待測液1.0 mL,添加蒸餾水定容至5.0 mL。再分別加入濃度為6.0 mmol/L H2O2溶液1.0 mL,反應10 min,在波長為510 nm處測吸光度Ai,以70%乙醇溶液為參比獲得空白樣吸光度A0,每個試樣作三次平行實驗,取其平均值,代入以下公式中獲得清除率，以維生素C為陽性對照。清除率計算公式如下:

式中:A0-空白樣吸光度;Ai-試樣吸光度。

1.2.6.3 Fe3+還原力 參照Benzie[11]的反應方法稍作修改。分別加入0.1、0.2、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6 mg/mL樣品待測液1.0 mL,再加入4.9 mL FRAP試劑(0.1 mol/L醋酸緩沖液、10 mmol/L TPTZ、20 mmol/L三氯化鐵溶液按照10∶1∶1比例配制),在遮光暗處條件下混合均勻,反應10 min后在593 nm波長下測定吸光度Ai。以0.1 mL 70%乙醇溶液為參比獲得空白樣吸光度A0,每個試樣作三次平行實驗,取其平均值,代入以下公式獲得還原率。以維生素C為陽性對照,判斷橙皮苷對鐵離子還原的能力。還原計算公式如下:

式中:A0-空白樣吸光度;Ai-試樣吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗使用Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)作圖。

2 結果與分析

2.1 橙皮苷標準曲線

采用橙皮苷為標準品,以不同的標準系列質量濃度為橫坐標,以吸光度A為縱坐標繪制標準曲線,橙皮苷質量濃度與吸光度呈很好的線性關系,橙皮苷標準曲線如圖1所示。

圖1 橙皮苷標準曲線Fig.1 Hesperidin standard graph

2.2 超聲輔助提取法

2.2.1 超聲輔助提取法單因素實驗

2.2.1.1 料液比的單因素實驗 由圖2可知,當料液比小于1∶50時,隨著料液比增大,橙皮苷提取得率顯著提高,這是由于提取溶劑的用量增加,溶液中橙皮苷濃度降低,陳皮原料與提取溶劑的接觸面積增加,且接觸面的濃度差變大,擴散推動力大,提高了傳質的速率。當料液比為1∶50時,橙皮苷提取得率趨向于穩(wěn)定,但料液比的增加會給生產(chǎn)加工后續(xù)濃縮純化等操作帶來影響,且費時耗能。因此綜合考慮實際操作與生產(chǎn)成本,選擇料液比1∶30、1∶40、1∶50三個水平進行正交實驗。

圖2 料液比對橙皮苷提取得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extration yield of hesperidin

2.2.1.2 超聲功率的單因素實驗 由圖3可知,隨著超聲波功率增大,提取得率不斷增大,當超聲波功率為70 W時橙皮苷得率達到最大值。超聲波功率大于70 W,隨著超聲波功率繼續(xù)增大橙皮苷提取得率逐漸減少,這是由于高功率可以降解溶出的橙皮苷,導致橙皮苷得率減少。因此選擇超聲波功率60、70、80 W三個水平進行正交實驗。

圖3 超聲波功率對橙皮苷提取得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extration yield of hesperidin

2.2.1.3 超聲時間的單因素實驗 由圖4可知,橙皮苷得率先隨著超聲波時間的增加而增加,并在超聲波時間20 min時橙皮苷得率達到最大值,隨后橙皮苷得率開始下降,這是由于橙皮苷在長時間超聲處理下發(fā)生降解。因此選擇超聲時間15、20、25 min三個水平進行正交實驗。

圖4 超聲波時間對橙皮苷提取得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extration yield of hesperidin

2.2.2 超聲輔助提取法正交實驗 基于單因素實驗結果,以超聲波時間、超聲波功率、料液比為因子,設計三因素三水平正交實驗,結果見表3。

由表3可知,因素對得率影響主次順序是C>A>B,即超聲波時間>料液比>超聲波功率。最優(yōu)組合為A3B3C3,因此最佳提取條件為超聲波時間25 min、超聲波功率80 W、料液比1∶50。在最佳提取條件下進行驗證性實驗,測得橙皮苷得率為8.06%±0.02%。齊兵[3]采用有機溶劑熱回流萃取法在最佳條件(料液比1∶35,提取時間2.5 h,提取時間85 ℃,乙醇濃度75%)下橙皮苷最大得率為3.31%±0.07%。對比傳統(tǒng)有機溶劑萃取法,超聲波輔助提取法具有提取時間短并且得率高的優(yōu)勢。

表3 L9(33)正交實驗及結果Table 3 L9(33)orthogonal test and results

2.3 微波輔助提取法

2.3.1 微波輔助提取法單因素

2.3.1.1 料液比的單因素實驗 由圖5可知,橙皮苷提取率先隨著提取液用量的增加而增加,這是由于隨料液比的增加,陳皮藥材得到完全浸潤,有效成分充分溶出。當料液比為1∶40 g/mL 時,提取率達到最大值。綜合浸出效果和節(jié)約溶劑以及降低成本等方面考慮,選擇液料比1∶30、1∶40、1∶50 g/mL三個水平進行正交實驗。

圖5 料液比對橙皮苷提取率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on extration yield of hesperidin

2.3.1.2 微波功率的單因素實驗 由圖6可知,隨著微波功率增大,提取得率不斷增大,當微波功率為240 W時橙皮苷得率達到最大值。微波功率大于240 W,隨著微波功率繼續(xù)增大橙皮苷提取得率逐漸減少,這是由于高功率可以降解溶出的橙皮苷,導致橙皮苷得率減少。因此選擇超聲波功率160、240、320 W三個水平進行正交實驗。

圖6 微波功率對橙皮苷提取率的影響Fig.6 Effect of microwave power on extration yield of hesperidin

2.3.1.3 微波時間的單因素實驗 由圖7可知,橙皮苷的提取率隨微波輻照時間的增大而增大,微波時間在60 s時,橙皮苷的提取率達到最大值;此后隨著微波時間延長,橙皮苷的提取率呈下降趨勢,這是由于微波提取時間過長,橙皮苷可能因長時間反復輻照或受熱導致結構發(fā)生變化,最終發(fā)生分解。因此選擇微波提取時間40、60、80 s三個水平進行正交實驗。

圖7 微波時間對橙皮苷提取率的影響Fig.7 Effect of microwave time on extration yield of hesperidin

2.3.2 微波輔助提取法正交實驗 基于單因素實驗結果,以微波時間、微波功率、料液比為提取因素,設計三因素三水平正交實驗,結果見表4。

由表4可知,由于極差RA>RB>RC,故因素對得率影響主次順序是A>B>C,即料液比>微波功率>微波時間。最優(yōu)組合為A3B2C1,因此最佳提取條件為料液比1∶50,微波功率為240 W,微波時間40 s。在最佳提取條件下進行驗證性實驗,測得橙皮苷得率為8.12%±0.04%。

表4 L9(33)正交實驗及結果Table 4 L9(33)orthogonal test and results

2.4 超聲與微波輔助提取法的比較

從橙皮苷得率可得,在最優(yōu)條件下微波輔助提取法提取橙皮苷的得率略高于超聲輔助法。伍鋼[12]等的研究結果與此相反,其解釋是微波使分子間相互摩擦碰撞而產(chǎn)生的高溫會促使橙皮苷發(fā)生降解,而超聲波主要利用空化和機械效應破碎細胞故可避免高溫對橙皮苷的破壞。本實驗結果可能的原因是,微波輔助提取法所用的微波功率較低,在提取過程中并沒有產(chǎn)生較高的溫度,此外,微波輔助提法提取時間很短,故溫度對橙皮苷降解的影響十分有限。微波輔助提法在很短提取時間內具有較高的提取率,表現(xiàn)出較高的提取效率,因此微波輔助提取法提取橙皮苷是較有效的方法。

2.5 DPPH·自由基清除能力

由圖8可知,隨著橙皮苷濃度的增加,清除率呈緩慢上升趨勢,即橙皮苷濃度與清除率呈現(xiàn)一定的量效關系。在0.1～0.6 mg/mL范圍內,當橙皮苷濃度為0.6 mg/mL時,DPPH·的清除率達到最大值。相比之下,維生素C的清除效果非常明顯。當樣品溶液中維生素C濃度<0.3 mg/mL時,隨著維生素C濃度的增加,其對DPPH·的清除率急劇增加;當維生素C濃度>0.3 mg/mL后,維生素C 其對DPPH·清除率增加突然放緩,當維生素C濃度為0.3 mg/mL時清除率已經(jīng)達到86.45%。由此可見,橙皮苷清除DPPH·的能力明顯弱于維生素C。

圖8 橙皮苷對DPPH·的清除作用Fig.8 Scavenging effect of hesperidin on DPPH·

2.6 ·OH自由基清除能力

由圖9可知,隨著橙皮苷濃度的增加,橙皮苷對·OH的清除能力逐漸增強,當橙皮苷濃度為0.6 mg/mL時,其對羥自由基的清除率達到最大值16.79%,即橙皮苷濃度與清除率呈現(xiàn)一定的量效關系。而維生素C的曲線趨勢變化則更為明顯。當樣品溶液中維生素C濃度<0.35 mg/mL時,隨著維生素C濃度的增加,其對·OH的清除率急劇增加;當維生素C濃度在0.35～0.45 mg/mL時,隨著維生素C濃度的增加,其對·OH清除率增加緩慢。雖然橙皮苷清除·OH的能力明顯弱于維生素C,但橙皮苷仍表現(xiàn)出一定清除·OH的能力。黃芳[13]等的研究也有類似結果,其探究了不同濃度橘皮橙皮苷提取液對·OH的清除效果,發(fā)現(xiàn)橙皮苷提取液對·OH的半清除率IC50=10.08μg/mL,也證實了橙皮苷具有一定的抗氧化能力。

圖9 橙皮苷對·OH的清除作用Fig.9 Scavenging effect of hesperidin on ·OH

2.7 Fe3+還原力實驗

由圖10可知,隨著橙皮苷濃度的增加,橙皮苷對Fe3+的還原能力逐漸增強,即橙皮苷濃度與還原率呈現(xiàn)一定的量效關系,當橙皮苷濃度達到0.6 mg/mL時,吸光度最大,表明其對Fe3+的還原能力最大。與DPPH·和·OH清除曲線一樣,維生素C還原Fe3+的曲線趨勢變化比橙皮苷更為明顯。當維生素C濃度<0.3 mg/mL時,隨著維生素C濃度增加,其對Fe3+的還原能力持續(xù)增加,并且與橙皮苷對Fe3+還原能力相差無幾;當維生素C濃度在0.3～0.45 mg/mL時,隨著維生素C濃度增加,其對Fe3+的還原能力急劇增加。由此可見,橙皮苷雖表現(xiàn)出一定還原Fe3+的能力,但與維生素C還原Fe3+能力存在一定差距。

圖10 橙皮苷對Fe3+的還原作用Fig.10 Saving effect of hesperidin on Fe3+

3 結論與討論

通過單因素和正交實驗,確定了橙皮苷超聲輔助提取法和微波輔助提取法的最優(yōu)提取條件。超聲波輔助提取橙皮苷的最優(yōu)工藝條件為:超聲波時間25 min、料液比1∶50、超聲波功率80 W,在該條件下橙皮苷得率是8.06%±0.02%;而微波輔助提取橙皮苷的最優(yōu)工藝條件為:微波時間40 s、料液比1∶50、微波功率240 W,在該條件下橙皮苷的得率為8.12%±0.04%。從橙皮苷得率可以看出,在最優(yōu)條件下微波輔助提取法提取橙皮苷的得率略高于超聲輔助法且提取時間短,因此微波輔助提取法是橙皮苷較為高效的提取方法。

通過三種抗氧化體系分析橙皮苷抗氧化活性,結果表明橙皮苷對有機自由基DPPH·、羥自由基·OH表現(xiàn)出一定的清除能力,對Fe3+表現(xiàn)出一定的還原能力,但明顯弱于維生素C清除自由基及還原鐵離子能力。在橙皮苷濃度0.1～0.6 mg/mL范圍內,隨著橙皮苷濃度的增加,橙皮苷對DPPH·和·OH的清除能力及Fe3+的還原能力均逐漸增強,即橙皮苷濃度均與清除率或還原率呈現(xiàn)一定的量效關系,并在0.6 mg/mL時達到了最大值。由于實驗中的橙皮苷未經(jīng)過純化處理,經(jīng)過純化處理后其抗氧特性應該會進一步提高。由此可見,橙皮苷是一種天然的抗氧化劑,具有廣泛的應用前景和開發(fā)價值。

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Ultrasound and microwave-assisted extracting hesperidin form citrus and study of its antioxidant activities

HUANG Zhi,XIAO Nan*

(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

In this paper,ultrasonic and microwave-assisted extraction methods were compared in order to determine the efficient extraction method,while evaluating the antioxidant activity of hesperidin extract.Single factor and orthogonal design were adopted in the experiments. 1-year dried citrus peel was as raw materials and hesperidin was used as detection index,considering solid-liquid ratio,extraction time and extraction power to compare the two methods of extraction process.The results showed that the optimum process conditions of ultrasound-assisted extraction was solid-liquid ratio 1∶50,ultrasonic time 25 min,ultrasonic power 80 W and under this condition the extraction rate was 8.06%±0.02%. While optimum process conditions of microwave-assisted extraction was solid-liquid ratio 1∶50,microwave time 40 s,microwave power 240 W and under this condition the extraction rate was 8.12%±0.04%.Compared with the ultrasound-assisted extraction,microwave-assisted extraction takes less time and exhibits more effcient extraction rate,so the method of microwave-assisted extraction was regarded as a more effective way.In addition,it was proved that hesperidin had certain scavenging effect on DPPH· and ·OH,and also had certain reduction effect on Fe3+.

ultrasound;microwave;hesperidin;antioxidant activity

2016-09-02

黃智(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品加工與安全控制,E-mail:18289289695@163.com。

*通訊作者:肖南(1979-)，女，碩士，實驗師，研究方向：食品加工工藝,E-mail:317617365@qq.com。

廣東省省科技計劃項目(2013B090600040)。

TS255.1

B

1002-0306(2017)08-0250-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.040