汪 輝, 劉 江, 李晰暉, 曹 陽, 黃小貝, 李永強

(長沙市食品藥品檢驗所, 湖南省食品安全生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心, 湖南 長沙 410013)

技術(shù)與應(yīng)用

固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳粉和果凍中的氯化膽堿

汪 輝*, 劉 江, 李晰暉, 曹 陽, 黃小貝, 李永強

(長沙市食品藥品檢驗所, 湖南省食品安全生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心, 湖南 長沙 410013)

建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定乳粉和果凍中氯化膽堿的分析方法。樣品在10 mL 0.02 mol/L乙酸銨溶液(冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0)中水解3 h后離心,上清液經(jīng)DIKMA ProElut PLS固相萃取柱(60 mg/3 mL)凈化后,用Agilent ZORBAX 300 SCX色譜柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm)進行分離,通過電噴霧正離子(ESI+)模式電離,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進行定性和定量分析。方法的檢出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10)分別為0.15 mg/kg和0.50 mg/kg,加標回收率為70.8%～100.2%,相對標準偏差(RSD)均不大于6.83%(n=6)。目標化合物在0.05～8.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性方程為Y=2.05×105X+3.24×104,相關(guān)系數(shù)(r)為0.996。對市售乳粉和果凍中的氯化膽堿進行檢測,結(jié)果表明,乳粉和果凍中氯化膽堿的含量分別為251.0～2 448 mg/kg和0.261～0.314 mg/kg。該法準確可靠、靈敏度高,適用于乳粉和果凍中氯化膽堿的測定。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;固相萃取;氯化膽堿;乳粉;果凍

氯化膽堿(choline chloride)是膽堿的衍生物,具有膽堿的生物活性[1],是動物生長過程中不可缺少的一種水溶性維生素,作為一種飼料添加劑,已廣泛應(yīng)用于動物飼料工業(yè)中[2-4]。生物體內(nèi)膽堿的缺乏可能會引起發(fā)育受阻、生長緩慢、繁殖能力差等不良生理現(xiàn)象[5,6]。GB 14880-2012《食品營養(yǎng)強化劑使用標準》中規(guī)定氯化膽堿可代替膽堿,作為營養(yǎng)強化劑添加至調(diào)制乳粉和果凍中。但食品用氯化膽堿目前無相關(guān)的國家標準對其含量、水分、灼燒殘渣等理化指標做出限定,不同廠家的產(chǎn)品中氯化膽堿的含量高低不一,導(dǎo)致一些企業(yè)生產(chǎn)的食品中氯化膽堿的含量達不到國家標準[3,4]。2016年7月,我國發(fā)布了《食品營養(yǎng)強化劑氯化膽堿》的征求意見稿,意味著食品級氯化膽堿即將規(guī)范化,并在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用。因此,建立食品中氯化膽堿的分析方法,有利于食品生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制,也為監(jiān)管部門提供必要的技術(shù)支撐。

氯化膽堿沸點高、熱穩(wěn)定性好,其化學(xué)結(jié)構(gòu)既無紫外吸收基團,又無熒光特性,無法利用氣相色譜法、高效液相色譜-紫外/熒光法進行檢測[6]。目前,氯化膽堿的分析方法主要有離子色譜法[1,7-10]、分光光度法[4,11]、雷氏重量法[12,13]、定氮法[14]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法[15]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5,16]。離子色譜法采用離子交換柱分離,有一定的選擇性,但電導(dǎo)檢測器是通用型檢測器,靈敏度較低;分光光度法和常規(guī)分析法的實驗操作繁瑣、干擾大,僅適用于常量分析。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法既能對目標化合物進行有效分離,又能彌補其他檢測器的缺陷,專一性強,靈敏度高。固相萃取技術(shù)能夠?qū)悠愤M行凈化,去除部分干擾物,有效地降低基質(zhì)效應(yīng)。本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定乳粉和果凍中氯化膽堿的分析方法。采用親水親脂固相萃取柱對樣品進行凈化,并采用強陽離子交換(SCX)色譜柱進行分離,通過電噴霧正離子模式(ESI+)電離,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式掃描,實現(xiàn)了乳粉和果凍中氯化膽堿的定性和定量分析,結(jié)果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀、Agilent 6460三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司); DIKMA ProElut PLS固相萃取柱(60 mg/3 mL); 24位固相萃取裝置(美國Supelco公司); DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司); CT14D型臺式高速離心機(上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司); Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)。

嬰兒配方乳粉質(zhì)控樣品(批號QC-IP-019,膽堿指定值165.8 mg/100 g,滿意值范圍為149.0～182.6 mg/100 g,中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心);甲醇、乙腈為色譜純(北京DIKMA公司);冰乙酸為色譜純(天津化學(xué)試劑研究所);乙酸銨、氯化膽堿為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

準確稱取適量的氯化膽堿,用甲醇溶解并定容,配制質(zhì)量濃度為1.0 g/L的標準儲備液,于-18 ℃保存;根據(jù)實驗要求逐級稀釋標準儲備液至適當(dāng)濃度,配制標準工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 UPLC-MS/MS條件

色譜柱:Agilent ZORBAX 300 SCX色譜柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm)(美國Agilent公司);柱溫:30 ℃;流動相:0.02 mol/L乙酸銨(冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-乙腈(60∶40, v/v);等度洗脫;流速:0.4 mL/min;進樣量:1 μL。

離子源:ESI源;正離子模式;毛細管電壓:4 000 V;霧化器(N2)壓力:3.4×105Pa;干燥氣(N2)溫度:350 ℃;干燥氣(N2)流速:10 L/min;裂解電壓:105 V;掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);母離子:m/z104;定量子離子:m/z60,碰撞能量:15 eV;定性子離子:m/z45,碰撞能量:20 eV。

1.3 樣品前處理

準確稱量1.0 g乳粉或果凍于25 mL離心管中,加入10 mL 0.02 mol/L乙酸銨溶液(冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0),混勻,置于70 ℃水浴中水解3 h,冷卻,搖勻,以10 000 r/min離心5 min,取上清液待用。分別用3 mL甲醇、3 mL超純水活化DIKMA ProElut PLS固相萃取柱(60 mg/3mL),移取3 mL上清液上樣,收集濾液,供LC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

本實驗考察了Agilent SB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm)和Agilent SCX色譜柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm)對目標化合物分離效果的影響。結(jié)果表明,采用Agilent SB-C18色譜柱時,以0.02 mol/L乙酸銨(冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-乙腈為流動相,氯化膽堿在水相比例較高時,幾乎無保留,而隨著水相比例降低,保留時間增大,但色譜峰拖尾嚴重,采用梯度洗脫,效果仍不令人滿意;采用Agilent SCX色譜柱時,因氯化膽堿主要以離子形式存在于水溶液中,其分離效果良好,色譜峰峰形尖銳,分離度高。因此選擇Agilent SCX色譜柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm)分離氯化膽堿。

2.1.2 流動相的選擇

考察了流動相中不同濃度(0.01、0.015、0.02、0.025 mol/L)的乙酸銨對目標化合物分離效果的影響(見圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),目標化合物的保留時間隨乙酸銨濃度的增大而減小,響應(yīng)強度隨乙酸銨濃度的增大而增大。但是過高濃度的乙酸銨與有機相混合時可能會析出,從而堵塞色譜柱,因此乙酸銨的濃度不宜過高。結(jié)合目標化合物的響應(yīng)強度和保留時間,最終選擇濃度為0.02 mol/L的乙酸銨(見圖1b)作為流動相中的水相。

圖 1 采用不同濃度的乙酸銨時氯化膽堿的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of choline chloride by different concentrations of ammonium acetatea. 0.025 mol/L; b. 0.02 mol/L; c. 0.015 mol/L; d. 0.01 mol/L.

考察了不同pH值(6.8、4.5和3.0,用冰乙酸調(diào)節(jié))的乙酸銨對目標化合物分離效果的影響(見圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)乙酸銨的pH值為3.0時,氯化膽堿的響應(yīng)強度最高(見圖2a)。因此最終選擇將乙酸銨的pH調(diào)節(jié)至3.0。

圖 2 采用不同pH值的乙酸銨時氯化膽堿的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of choline chloride under different pH values of ammonium acetatepH values of ammonium acetate: a. 3.0; b. 4.5; c. 6.8.

考察了當(dāng)0.02 mol/L乙酸銨(冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-乙腈為流動相時,二者不同的體積比(70∶30、60∶40、50∶50、40∶60)對目標化合物分離效果的影響(見圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),目標化合物的保留時間隨乙酸銨體積分數(shù)的增加而減小,而其響應(yīng)強度先增大后減小。當(dāng)流動相為0.02 mol/L乙酸銨(pH 3.0)-乙腈(60∶40, v/v)時,氯化膽堿的響應(yīng)強度最大,色譜峰峰形對稱(見圖3b),因此選為實驗所用。

圖 3 采用不同比例的流動相時氯化膽堿的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of choline chloride by different ratios of mobile phaseVolume ratios of ammonium acetate (0.02 mol/L, pH 3.0) to acetonitrile: a. 70∶30; b. 60∶40; c. 50∶50; d. 40∶60.

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在不接色譜柱的情況下,采用直接進樣的方式,將1.0 mg/L氯化膽堿標準溶液注入質(zhì)譜離子源。根據(jù)目標化合物的結(jié)構(gòu)和相對分子質(zhì)量,在正離子模式下SIM掃描,得到目標化合物的分子離子峰,并通過連續(xù)測試得到優(yōu)化的裂解電壓。設(shè)定優(yōu)化的裂解電壓,以分子離子為母離子進行子離子掃描,得到碎片離子信息和優(yōu)化的碰撞能量。按照歐盟2002/657/EC指令,對化合物進行定量確證必須達到4個確證點,即必須選擇2個以上特征子離子。因此選擇相對豐度較高的碎片離子作為定量特征離子,干擾較少的碎片離子作為定性特征離子(見圖4),結(jié)合優(yōu)化后的參數(shù),采用MRM模式掃描,最終得到穩(wěn)定性好、響應(yīng)強度較高的色譜圖。

圖 4 氯化膽堿可能的裂解途徑Fig. 4 Possible fragmentation pathways of the choline chloridem/z 60: quantitative ion; m/z 45: qualitative ion.

2.3 前處理條件的優(yōu)化

分別考察了ProElut PWC(60 mg/3 mL)、ProElut PLS(60 mg/3 mL)、ProElut C18(60 mg/3 mL)、ProElut PLS(200 mg/6 mL)和ProElut C18(200 mg/6 mL)5種固相萃取柱對目標化合物凈化效果的影響。ProElut PWC兼具弱陽離子交換保留和反相保留機理,專用于季銨鹽類物質(zhì)的保留;ProElut C18常被用來保留非極性和弱極性化合物,由于進行了封端處理,所以吸附劑的離子次級相互作用幾乎不發(fā)揮作用;ProElut PLS對極性化合物和非極性化合物均有較好的保留。根據(jù)各固相萃取柱的特性,試驗過程分別測試了每種固相萃取柱在上樣、淋洗和洗脫3個步驟中目標化合物的回收率(見表1)。其中ProElut PWC固相萃取柱依次采用3 mL 5%(v/v)氨水、甲醇淋洗,3 mL含2%(v/v)甲酸的甲醇溶液洗脫;ProElut C18和PLS固相萃取柱采用3 mL 10%(v/v)甲醇水溶液淋洗,3 mL甲醇洗脫。結(jié)果表明,采用ProElut PWC(60 mg/3 mL)和ProElut PLS(200 mg/6 mL)固相萃取柱時,每個步驟回收率均不理想,其他3種固相萃取柱在上樣過程的回收率均大于90%,且采用ProElut PLS(60 mg/3 mL)和ProElut C18(60 mg/3 mL)固相萃取柱時,回收率均在99%左右?？紤]到ProElut PLS固相萃取柱兼具親水基團和疏水基團,對極性化合物和非極性化合物均有較好保留,因此最終選用ProElut PLS(60 mg/3 mL)固相萃取柱對樣品進行凈化。

表 1 5種固相萃取柱在上樣、淋洗和洗脫過程中

ProElut PWC column: washed by 3 mL 5%(v/v) ammonia water and 3 mL methanol, eluted by 3 mL methanol containing 2%(v/v) formic acid; ProElut C18 and PLS column: washed by 3 mL 10%(v/v) methanol aqueous solution, eluted by 3 mL methanol.

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用LC-MS/MS分析時,由于樣品溶液中的干擾物影響目標化合物的電離,導(dǎo)致其響應(yīng)強度增強或減弱的現(xiàn)象稱為基質(zhì)效應(yīng)(ME)[17,18]。為盡量降低基質(zhì)效應(yīng),本實驗采用緩沖溶液(乙酸銨-冰乙酸)提取樣品,以減小溶液pH的變化;采用固相萃取凈化，以減小過多干擾物的影響;采用較低的進樣量，以減小高含量共流出組分的影響;采用陽離子交換柱分離，以減小相似極性化合物的影響。分別配制高、低兩個水平的標準溶液和樣品基質(zhì)溶液,根據(jù)同一水平下樣品基質(zhì)溶液和標準溶液中氯化膽堿響應(yīng)強度的比值,考察方法的基質(zhì)效應(yīng)[19],每個水平重復(fù)測定6次。結(jié)果表明，乳粉和果凍樣品的基質(zhì)效應(yīng)分別為93.7%～98.2%和96.3%～103.8%(見表2)。因此本實驗可忽略基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響。

表 2 乳粉和果凍樣品溶液的基質(zhì)效應(yīng)(n=6)

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 檢出限、定量限和線性范圍

在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下,以3倍和10倍信噪比計算方法的檢出限和定量限,分別為0.15 mg/kg和0.50 mg/kg。將氯化膽堿標準溶液用0.02 mol/L乙酸銨(冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0)溶液逐級稀釋,以氯化膽堿的峰面積為縱坐標(Y)、對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(X, mg/L)繪制標準曲線。目標化合物在0.05～8.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性方程為Y=2.05×105X+3.24×104,相關(guān)系數(shù)(r)為0.996。

2.5.2 回收率和精密度

為驗證方法的實用性,參考一般乳粉和果凍中目標化合物的含量,進行了加標回收率試驗。分別在乳粉樣品中添加100、200、2 000 mg/kg的氯化膽堿,在果凍樣品中添加0.5、1.0、5.0 mg/kg的氯化膽堿,同一添加水平分別制備6份樣品,供LC-MS/MS測試。結(jié)果表明,乳粉中氯化膽堿的加標回收率為80.8%～91.2%, RSD為2.04%～2.80%;果凍中氯化膽堿的加標回收率為70.8%～100.2%, RSD為2.39%～6.83%(見表3),可以滿足日常檢測需求。

表 3 乳粉和果凍中氯化膽堿的加標回收率和相對標準偏差(n=6)

2.6 穩(wěn)定性

隨機抽取一份乳粉樣品和果凍樣品,對其進行前處理,隨后分別在0、2、4、8、12 h測定氯化膽堿的含量,考察方法的穩(wěn)定性。乳粉樣品和果凍樣品中氯化膽堿峰面積的RSD分別為4.81%和4.51%(n=5)。說明樣品提取溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖 5 乳粉質(zhì)控樣品、實際乳粉和果凍樣品中氯化膽堿的MRM色譜圖Fig. 5 MRM chromatograms of choline chloride in a milk powder quality-control sample, a real milk powder and jelly sample

2.7 實際樣品測定

采用本方法對乳粉質(zhì)控樣品(批號QC-IP-019)和市售的5個乳粉樣品、5個果凍樣品中氯化膽堿的含量進行測定,乳粉質(zhì)控樣品、實際乳粉和果凍樣品的MRM色譜圖見圖5。乳粉質(zhì)控樣品中氯化膽堿(以膽堿計)的含量為156.7 mg/100 g，在滿意值范圍內(nèi)，說明方法準確、可靠。10個市售樣品均檢出目標化合物,乳粉和果凍樣品中氯化膽堿的含量分別為251.0～2 448 mg/kg和0.261～0.314 mg/kg。

3 結(jié)論

本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定乳粉和果凍中氯化膽堿含量的分析方法。該方法穩(wěn)定性好、靈敏度高,可滿足乳粉和果凍中氯化膽堿含量的測定,為今后企業(yè)對原料把關(guān)和食品監(jiān)督部門的日常監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

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Determination of choline chloride in milk powder and jelly by solid phase extraction-ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

WANG Hui*, LIU Jiang, LI Xihui, CAO Yang, HUANG Xiaobei, LI Yongqiang

(ChangshaInstituteforFoodandDrugControl,FoodSafetyProductionEngineeringResearchCenterofHunanProvince,Changsha410013,China)

An analytical method was developed for the determination of choline chloride in milk powder and jelly by solid phase extraction-ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The samples were centrifuged after hydrolyzation 3 h in 10 mL 0.02 mol/L ammonium acetate (glacial acetic acid adjust pH to 3.0). The supernatant was cleaned up by a DIKMA ProElut PLS column (60 mg/3 mL). The target compounds were separated by an Agilent ZORBAX 300 SCX column (150 mm×2.1 mm, 5 μm). Qualitative and quantitative analyses were carried out by multiple reaction monitoring (MRM) mode with positive electrospray ionization (ESI+). The limit of detection (LOD,S/N=3) and the limit of quantitation (LOQ,S/N=10) were 0.15 mg/kg and 0.50 mg/kg, respectively. The recoveries of choline chloride spiked in milk powder and jelly were 70.8%-100.2%, with RSDs no more than 6.83% (n=6). The standard curves showed good linearity in the concentration range from 0.05 to 8.0 mg/L with correlation coefficient (r) of 0.996. The method was applied to detection of commercially available choline chloride in milk powder and jelly. The contents of choline chloride in real milk power and jelly samples were 251.0-2 448 mg/kg and 0.261-0.314 mg/kg, respectively. The developed method is accurate, reliable, sensitive, and suitable for the determination of choline chloride in milk powder and jelly.

ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); solid phase extraction (SPE); choline chloride; milk powder; jelly

10.3724/SP.J.1123.2016.12024

2016-12-12

湖南省科技計劃重點項目(2014SK2011).

Foundation item: Key Program of Hunan Provincial Science and Technology Department (No. 2014SK2011).

O658

A

1000-8713(2017)05-0558-05

* 通訊聯(lián)系人. E-mail:wanghuei158@163.com.