張萬利,梁新紅,孫俊良,冉軍艦,莫海珍

離子交換層析分離純化甘薯β-淀粉酶

張萬利,梁新紅,孫俊良,冉軍艦,莫海珍

（河南科技學院食品學院,河南新鄉(xiāng)453003）

應用新型離子交換柱層析分離甘薯中β-淀粉酶.采用HiTrap Capto Q強陰離子柱對甘薯β-淀粉酶進行分離純化,純化的樣品經(jīng)SDS-PAGE分析純度.結(jié)果表明：pH值為6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液條件下純化效果最佳,分離色譜圖顯示洗脫液在280 nm的紫外吸收值最大,為496.32 mAU,蛋白峰面積最大,為225.55；洗脫液經(jīng)SDS-PAGE分析為單一條帶；經(jīng)HiTrap Capto Q柱分離純化后,β-淀粉酶比活力提高至96 885 U/mg,純化倍數(shù)為15.32,酶回收率為18.30%.研究表明HiTrap Capto Q柱層析純化能夠快速高效地純化甘薯β-淀粉酶,純化工藝過程簡單、快速、高效.研究對工業(yè)生產(chǎn)中運用此技術提高β-淀粉酶的分離純化效率具有理論及實踐意義.

離子交換層析；純化；甘薯；β-淀粉酶

甘薯是我國重要的糧食作物之一,其種植面積和總產(chǎn)量分別占世界的42.65%和71.22%,居世界首位,單產(chǎn)比世界平均水平高67%[1].近年來中國甘薯產(chǎn)后淀粉加工比例達到70%～80%[2-3].據(jù)報道,中國每年因生產(chǎn)甘薯類淀粉排放的廢液約1 650萬t,造成較嚴重的環(huán)境污染[4].而甘薯漿中含有大量蛋白,其中甘薯β-淀粉酶是主要的蛋白之一,甘薯中提取的β-淀粉酶是植物β-淀粉酶的最佳來源[5-6].從甘薯制淀粉的廢液中提取β-淀粉酶,既節(jié)約了生產(chǎn)成本,又大大減少了環(huán)境污染.

β-淀粉酶是一種糖苷酶,作用于淀粉時從淀粉鏈的非還原端開始,外切α-1,4-糖苷鍵,順次切下麥芽糖單位[7].β-淀粉酶主要應用于制糖、制藥及啤酒等工業(yè).β-淀粉酶是一種活性物質(zhì),容易受到提取環(huán)境條件的影響,優(yōu)化其純化條件對增加純化產(chǎn)物具有重要意義.

甘薯β-淀粉酶純化一般從甘薯淀粉廢液中獲得粗酶液,用硫酸銨沉淀法初步分離,然后再逐級純化.如Pauline等[8]應用DEAE、G-75、Glycogen precipitation和preparative native PAGE依次進行多步層析分離,Yamasaki等[9]用Sephadex G-200和DEAE-cellulofine分離純化β-淀粉酶,Kolawole等[10]用DEAE-seharose和α-CD（epoxyl）seharose6B進行多步層析分離,工藝步驟均很繁瑣,過程耗時耗力.

Capto Q是強陰離子柱,其以離子交換劑為固定相,根據(jù)帶電荷的蛋白和層析填料上相反電荷之間的可逆相互作用進行分離.Capto Q柱具有完善的配有傳統(tǒng)配體的Capto平臺的高分辨率中度純化和精細純化,易于優(yōu)化的高通量純化,能夠提高工藝經(jīng)濟性和生產(chǎn)能力等優(yōu)點[11].

本文采用強陰離子柱Capto Q柱快速純化甘薯β-淀粉酶,并對不同的緩沖液及其不同的pH值對Capto Q柱純化甘薯β-淀粉酶效果的影響進行研究,以期優(yōu)化純化工藝流程,提高純化速度,為β-淀粉酶研究及酶制劑工業(yè)生產(chǎn)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯品種為徐薯18號,產(chǎn)自河南科技學院甘薯試驗基地；透析袋1 kDa（北京索萊寶科技有限公司）；β-淀粉酶標品（美國Sigma公司）；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 儀器與設備

H2050臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；AKTAPURIFIE 10蛋白質(zhì)純化儀（美國GE公司）；HiTrap Capto Q 5×1 mL離子交換柱（美國GE公司）；miniPROTEANⅡ垂直版電泳儀（美國Bio-Rad公司）.

1.3 試驗方法

1.3.1 甘薯β-淀粉酶粗酶液制備將鮮甘薯預處理,切塊稱取100 g,加入蒸餾水200 mL,于粉碎機中粉碎1 min.過40目篩,濾液置于冷凍離心機中4℃、4 000 r/min離心15 min.取上清液,加入硫酸銨至飽和度為70%,于4℃冰箱中靜置4 h.設置離心機參數(shù)為溫度4℃,轉(zhuǎn)速8 000 r/min,冷凍離心15 min,收集沉淀.用適量緩沖液將沉淀溶解,選用截留分子量為1 kDa的透析袋透析除鹽24 h[12].

1.3.2 甘薯β-淀粉酶柱層析分離純化用離子交換柱HiTrap Capto Q（柱體積5 mL）柱層析純化甘薯β-淀粉酶,用0.02 mol/L緩沖液平衡柱子,β-淀粉酶粗酶液用0.22μm膜過濾,上樣量1 mL,控制流速1.0 mL/min.用相同緩沖液洗脫,收集器按照每管5.0 mL收集洗脫液.

1.3.3 β-淀粉酶與碘試劑反應淀粉具有遇碘變藍的特性[13].收集出峰的洗脫液與碘試劑反應,淀粉無顏色變化則初步判斷為洗脫液含有酶液.具體方法為：稱取1 g淀粉,加少量0.2 mol/L的緩沖液,煮沸冷卻后用相同緩沖液定容到100 mL,取0.5 mL加入試管中,然后加入出峰部分的洗脫液1 mL,于60℃水浴中反應5 min,加入少量的碘試劑,檢驗淀粉的水解情況.

1.4 分析方法

1.4.1 蛋白質(zhì)含量測定采用Folin-酚法[14].

1.4.2 β-淀粉酶活性的測定采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法[15].

1.4.3 β-淀粉酶電泳方法十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE法）[15].每個泳道上樣量為20μL.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同p H值的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液對甘薯β-淀粉酶分離純化的影響

以磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉為緩沖液體系,考察pH值為6.0～8.0時HiTrap Capto Q柱對甘薯β-淀粉酶的分離效果,結(jié)果見圖1.

圖1 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉p H值為6.0～8.0時HiTrap Capto Q對甘薯β-淀粉酶分離圖譜Fig.1 HiTrap Capto Q chromatography purification ofβ-amylase from sweetpotato atNa2HPO4-NaH2PO4pH 6.0～8.0

由圖1可知,β-淀粉酶在不同pH值的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液下的紫外吸光值不同.pH值的改變不影響出峰時間,只改變吸光值的大小.圖中有3個洗脫峰及1個流穿峰,分別收集每個峰所對應的收集管里的洗脫液.依據(jù)方法1.3.3,洗脫峰2中洗脫液與碘試劑反應無顏色變化,而洗脫峰1、洗脫峰3和流穿峰中洗脫液與碘試劑反應呈藍色,因此洗脫峰2中含有β-淀粉酶.計算在不同pH下洗脫峰2的峰面積和峰高可知：pH值為6.0時,洗脫峰2的峰高為408.26 mAU,峰面積為170.36；pH值為7.0時,洗脫峰2的峰高為300.38 mAU,峰面積為140.31；pH值為8.0時,洗脫峰2的峰高為182.30 mAU,峰面積為55.88.

以磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉為緩沖液時,在pH值為6.0時,HiTrap Capto Q對甘薯β-淀粉酶分離純化的β-淀粉酶分離效果最好,洗脫液在280 nm的紫外吸收值最大,其值為408.26 mAU,此時峰面積也達到最大,其值為170.36.

2.2 不同p H值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液對甘薯β-淀粉酶分離純化的影響

以磷酸氫二鈉-檸檬酸為緩沖液體系,考察pH值為6.0～8.0時HiTrap Capto Q柱對甘薯β-淀粉酶的分離效果,結(jié)果見圖2.

圖2 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液pH值為6.0～8.0時HiTrap Capto Q對甘薯β-淀粉酶分離色譜圖Fig.2 HiTrap Capto Qchromatography purification ofβ-amylase from sweetpotato at Na2HPO4-citric acid pH 6.0～8.0

由圖2可知,β-淀粉酶在不同pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液下的紫外吸光值不同.pH值的改變不影響出峰時間,只改變吸光值的大小.圖中有3個洗脫峰和1個流穿峰,分別收集每個峰所對應的收集管中的洗脫液.依據(jù)方法1.3.3,洗脫峰2中洗脫液與碘試劑反應無顏色變化,而洗脫峰1、洗脫峰3和流穿峰中洗脫液與碘試劑反應呈藍色,因此洗脫峰2中含有β-淀粉酶.計算在不同pH值下洗脫峰2的峰面積和峰高可知：pH值為6.0時,洗脫峰2的峰高為496.32 mAU,峰面積為225.55；pH值為7.0時,洗脫峰2的峰高為370.35 mAU,峰面積為140.31；pH值為8.0時,洗脫峰2的峰高為223.04 mAU,峰面積為60.62.

以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為緩沖液時,在pH 6.0時HiTrap Capto Q對甘薯β-淀粉酶分離純化的β-淀粉酶分離效果最好,洗脫液在280 nm的紫外吸收值最大,其值為496.32 mAU,此時峰面積也達到最大,其值為225.55.

總結(jié)兩種緩沖液及其不同pH值對甘薯β-淀粉酶分離純化的影響可知,在以磷酸氫二鈉-檸檬酸為緩沖液、pH值為6.0時分離純化甘薯β-淀粉酶效果最好,此時蛋白濃度最大,280 nm的紫外吸收值最大為496.32 mAU,峰面積最大為225.55.

2.3 HiTra p Ca pto Q柱對甘薯β-淀粉酶純化效果

以pH值為6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸為緩沖液,應用HiTrap Capto Q柱對甘薯β-淀粉酶進行分離純化,對粗酶液和圖2-a色譜圖中洗脫峰2對應的洗脫液進行酶活及蛋白質(zhì)含量測定,以比活力及提純倍數(shù)等為指標對β-淀粉酶純化效果進行比較,結(jié)果見表1.

表1 HiTrap Capto Q柱對β-淀粉酶純化效果Tab.1 Purification ofβ-amylase using HiTrap Capto Q

由表1可知,經(jīng)HiTrap Capto Q柱分離純化后,β-淀粉酶比活力提高至96 885 U/mg,純化倍數(shù)為15.32,酶回收率為18.30%.

2.4 電泳鑒定結(jié)果

以pH值為6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸為緩沖液,應用HiTrap Capto Q柱對甘薯β-淀粉酶進行分離純化,對圖2-a中色譜圖中對應的3個洗脫峰和1個流穿峰對應的洗脫液進行SDS-PAGE電泳,結(jié)果見圖3.

圖3 甘薯β-淀粉酶SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis spectrums ofβ-amylase from sweetpotato

由圖3可知,色譜圖中洗脫峰1、洗脫峰3和流穿峰中不含有甘薯β-淀粉酶,與β-淀粉酶標品條帶相比較,粗酶液和洗脫峰2中含有甘薯β-淀粉酶.由電泳圖譜可知,洗脫峰2為單一條帶,其位置在Mark蛋白的第2條和第3條帶之間,分子量約為45～50 kDa.由此可見,應用AKTApurifier純化儀,以HiTrap Capto Q離子交換技術分離純化β-淀粉酶有很好的純化效果,得到的β-淀粉酶純度很高.

3 結(jié)論

研究應用AKTApurifier Plus層析系統(tǒng),選用HiTrap Capto Q離子交換柱對甘薯β-淀粉酶進行分離純化.分別在磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉和磷酸-檸檬酸兩種緩沖液的不同pH值條件下進行試驗,結(jié)果表明,pH值為6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸為緩沖液時效果最佳,分離色譜圖表明洗脫液在280 nm處的紫外吸收值最大為496.32 mAU,蛋白峰面積最大為225.55；洗脫液經(jīng)SDS-PAGE分析為單一條帶；經(jīng)HiTrap Capto Q柱分離純化后,β-淀粉酶比活力提高至96 885 U/mg,純化倍數(shù)為15.32,酶回收率為18.30%.由此可見在β-淀粉酶分離純化過程中新層析技術結(jié)合此緩沖液效果更佳.研究對工業(yè)生產(chǎn)中運用此技術提高β-淀粉酶的純度具有重大理論及實踐意義.

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（責任編輯：鄧天福）

Purification ofβ-amylase from sweet potato using ion-exchange chromatography technique

ZHANG Wanli,LIANG Xinhong,SUN Junliang,RAN Junjian,MO Haizhen
（Schoolof Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

Ion-exchange chromatography technique to separateβ-amylase from sweet potato was investigated.Sweet potatoβ-amylase were purified with a novel chromatographic technique based on the principles of anion exchange resin Capto Q with high resolution.The samples purified were identified by SDS-PAGE.The results showed that the best effect at sodium phosphate dibasic-citric acid buffer pH 6.0,and the separating chromatogram showed that the maximum ultraviolet absorption value was 496.32 mAU,the maximum peak area of protein was 225.55.The high purityβ-amylase was also reflected in the single band obtained on SDS-PAGE.Under these conditions,the specific activities of was 96 885 U/mg,purification（fold）was 15.32,and yield was 18.30%.HiTrap Capto Q may be used for purificationβ-amylase from sweet potato,which was simple,rapid,easy to be scaled-up and suitable for large-scale production.The research has the important significance in theory and practice on high efficiently separatingβamylase from sweet potato.

ion-exchange chromatography technique；purification；sweet potato；β-amylase

TS209,TQ925+.1

A

1008-7516（2017）02-0023-06

10.3969/j.issn.1008-7516.2017.02.006

2016-12-16

河南省科技計劃項目（142102110127）；河南省教育廳自然科學研究資助計劃項目（14A550010）；河南省高校科技創(chuàng)新團隊支持計劃項目（16IRTSTHN007）

張萬利（1990―）,男,河南蘭考人,碩士研究生.主要從事食品生物技術研究.

梁新紅（1971―）,女,河南新鄉(xiāng)人,博士,副教授.主要從事食品生物技術研究.